Orientador: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Alessandro Minillo / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Resumo: A estratégia de clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA é uma das técnicas moleculares que permite estimar e comparar a diversidade microbiana de diferentes amostras ambientais. O objetivo deste trabalho foi estimar a diversidade de microrganismos pertencentes ao Domínio Bactéria em um consórcio degradador de óleo diesel, por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA, assim como desenvolver uma nova metodologia de rastreamento em bibliotecas metagenômicas. O consórcio bacteriano foi obtido através de solo enriquecido com óleo diesel. O DNA metagenômico foi extraído com o auxílio do kit Fast DNA spin Kit for soil (Bio101- Quantum Biotechnologies) e amplificado por uma reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com os oligonucleotídeos iniciadores FD1 e RD1 específicos para a o gene 16S rRNA. Os produtos de PCR foram clonados em vetor pGEM T Easy (Promega) e transformados em células competentes de Escherichia Coli DH5 . O sequenciamento parcial dos clones foi feito com oligonucleotideos universais do vetor. Para a prospecção gênica foi utilizado membranas de nylon com "pools" de DNA de todas as placas. A biblioteca obtida gerou 431 clones. Os clones obtidos apresentaram similaridade com o filo Proteobacteria, com representantes das classes Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira e Betaproteobacteria. O gênero Pseudomonas apresentou-se com maior frequência de clones na biblioteca. O "software" DOTUR foi usado para determinar o número de unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A curva de extinção indicou que os 431 clones sequenciado foram suficientes para estimar a diversidade bacteriana do consórcio. A metodologia testada baseado em "pools" de DNA foi eficiente na detecção e isolamento do gene Alkb na bilbioteca metagenomica. / Abstract: Cloning and sequencing of 16S rRNA gene it is one of the molecular techniques that permits estimate and compare the microbial diversity of different environmental samples. The aim of this work was estimate the diversity of microorganisms that belong to Bacteria domain in a consortium specialized in diesel oil degradation, through partial sequencing of 16S rRNA gene, as well as develop a new methodology for screening libraries in metagenomics. This consortium was obtained through enrichments achieved using diesel oil in soil samples. The metagenomic DNA was obtained using Fast DNA spin Kit for soil (Bio 101-Quantum Biotechnologies) and amplified by PCR (Polymerase chain reaction) with FD1 and RD1 oligonucleotides, which are specific for 16S rRNA gene. The PCR products were cloned into pGEM-TEasy vector (Promega) and Escherichia coli DH5 was used as the host cell for recombinant DNAs. The partial clones sequencing was obtained using universal primers of the vector. For the exploration of gene were used nylon membranes with Pools of DNA from all plates. The library generated from 431 clones. All clones sequenced showed similarity with the phylum Proteobacteria, distributed in Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira and Betaproteobacteria classes. The Pseudomonas genus was the most abundant genus found in the metagenomic library. The DOTUR software was used to assigns sequences to operational taxonomic units (OTUs). Using the OTUs composition data, rarefaction curves were made to show that 431 sequences were enough to obtain a satisfactory coverage of diversity of the microbial consortium. The test methodology based on Pools of DNA isolation was effective in detecting the gene Alkb Library metagenomics. / Mestre

Resumo: Nesta pesquisa foram temas de estudo diversos aspectos relacionados à técnica de biorremediação de solos e águas subterrâneas contaminados com hidrocarbonetos. A partir de amostras de solo e água subterrânea coletadas em diferentes postos de combustíveis, avaliouse a biorremediação natural da água subterrânea em local onde ocorreu vazamento de óleo diesel, mediante o monitoramento de indicadores geoquímicos durante 2 anos. Diferentes técnicas de biorremediação (bioestimulação com a adição de nutrientes e de um surfactante e bioaumento (injeção de microrganismos)) foram comparadas quando aplicadas isoladas e em conjunto a solos contaminados com óleo diesel e comparou-se a capacidade de diferentes microrganismos em biodegradar óleo diesel comercial e intemperizado. Conciliando a biorremediação com a prática atual no gerenciamento ambiental de reutilização de resíduos, avaliou-se o efeito da adição da vinhaça na biorremediação de solos e águas subterrâneas contaminados com óleo diesel e investigou-se a capacidade de diferentes culturas de bactérias em utilizarem óleo diesel intemperizado como matéria prima para produção de biossurfactante. O método respirométrico de Bartha e Pramer foi utilizado nos experimentos em que foi averiguada a biodegradação em solos e, no caso da água subterrânea, frascos de DBO e reatores aerados. Experimentos de biodegradabilidade dos óleos diesel foram realizados com a técnica do indicador redox DCPIP e o monitoramento da produção de biossurfactantes foi realizado com medidas de tensão superficial, segundo o método do anel de De Nöuy, empregando-se o tensiômetro Krüss K6. A partir do monitoramento dos indicadores geoquímicos, foi possível identificar fatores que corroboram a eficiência da técnica de biorremediação natural para o tratamento da água subterrânea na área de estudo. / Abstract: In this research, different aspects related to the bioremediation technique of soils and groundwaters contaminated with hydrocarbons were considered. From soil and groundwater samples collected at different petrol stations, the natural bioremediation of the groundwater, where a diesel oil leakage took place, was evaluated by monitoring geochemical indicators for 2 years. Different bioremediation techniques (biostimulation with addition of nutrients and a surfactant and bioaugmentation (injection of microorganisms)) were compared when applied individually or grouped to contaminated soils with diesel oil and the capability of different microorganisms to biodegrade commercial and weathered diesel oil was compared. Considering the current environmental management practice of reusing residues, the effects of the vinasse in the bioremediation of soils and groundwaters contaminated with diesel oil was evaluated and the capability of different bacterial cultures to use weathered diesel oil as raw material to produce biosurfactant was investigated. The Bartha & Pramer respirometric method was employed in the biodegradation experiments with soils, and, in the case of the groundwater, BOD flasks and aerated reactors. The experiments testing the biodegradability of diesel oils were carried out using the DCPIP redox indicator technique and the monitoring of the biosurfactant production by superficial tension measurements, according to the De Nöuy ring method, and employing the Krüss K6 tensiometer. From the monitoring of the geochemical indicators, it was possible to identify factors that support the efficiency of the natural bioremediation technique for the treatment of the groundwater at the area of study. The respirometric experiments demonstrated the importance of the soil nutritional balance and that no gain in terms of increasing the biodegradation efficiency was obtained with the bioaugmentation technique. / Orientador: Daniel Marcos Bonotto / Coorientador: Dejanira de Franceschi de Angelis / Banca: Carlos Renato Corso / Banca: Bruno Coraucci Filho / Banca: Cassiana Maria Reganhan Coneglian / Banca: Aurora Mariana Garcia de França Souza / Doutor

Orientador: Edério Dino Bidóia / Banca: Edson Aparecido Abdul Nour / Banca: Maria Aparecida Marin Morales / Resumo: A biodegradação tem sido há muito tempo um dos principais campos de pesquisa em microbiologia, cuja utilidade inclui a biodegradação de substâncias orgânicas e inorgânicas. Microrganismos podem ser ótimas ferramentas de remoção de poluentes em solo, água e sedimentos pelas suas inúmeras vantagens sobre outros processos. Para a limpeza de ambientes com hidrocarbonetos pela biorremediação deve-se explorar a habilidade dos microrganismos e compreender a maneira pela qual o processo ocorre em diferentes derivados do petróleo. Existem estudos que propõem a biorremediação de ambientes contaminados por hidrocarbonetos pela inoculação de microrganismos com potencial biodegradador e a adição de biossurfactantes. O presente trabalho estudou a biodegradação de diferentes derivados do petróleo com a proposta de aprimorar o processo pelo uso de biossurfactante produzido por Bacillus subtilis. Também foi avaliada a toxicidade das substâncias antes e depois da biodegradação. Os biossurfactantes produzidos foram adicionados aos ensaios de biodegradação de diferentes tipos de derivados do petróleo, incluindo óleo cru, compostos fenólicos, querosene, gasolina e óleos lubrificantes automotivos sintéticos e usados. Foram utilizados também, como comparação, óleos vegetais de soja e biodiesel. O estudo foi desenvolvido utilizando a técnica de respirometria a qual monitora a formação de CO2. Também foi utilizada a técnica de colorimetria pela análise da coloração do indicador redox DCPIP. Assim, a partir dos dados obtidos foram observados os diferentes perfis de biodegradação das diferentes substâncias, a fim de obter uma descrição de como a aplicação de biossurfactante produzido por B. subtilis afeta a biodegradação dos derivados do petróleo. Observou-se que a biodegradação dos derivados do petróleo ocorreu pela ação de consórcio de microrganismos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Biodegradation has been for a long time a main field of study in microbiology whose application includes organic and inorganic substances biodegradation. Microorganisms can be great pollutant removal tools in soil, water and sediments due to their advantages compared to other processes. In order to accomplish hydrocarbon-polluted environments cleanup by bioremediation, the microorganisms' capabilities must be exploited and studied, so then information on different petroleum byproducts can be achieved. Some studies propose environmental biorremediation not only by hydrocarbon-degrading microorganisms' insertion, but also by adding biossurfactants. In this work, different petroleum byproducts biodegradation was studied, aiming a biodegradation improvement through inclusion of a Bacillus subtilis produced biosurfactant. Biosurfactant production was also evaluated, as well as the substances toxicity before and after biodegradation. The biossurfactant produced was added to biodegradation assays of many different substances: crude oil, phenolic compounds, kerosene, gasoline and automotive lubricant oils. As a comparison, vegetable soy oils and biodiesel had their biodegradation performance evaluated. This study was developed by using the respirometric technique which is capable of evaluate CO2 production during biodegradation. Also, another biodegradation monitoring technique was used with a redox dye and colorimetry. Thus, from data obtained, different biodegradation profiles were estabilished and a precise description on how the biossurfactant affects petroleum byproducts biodegradation could be designed. It was observed that biodegradation occurred through microorganism consortium and B. subtilis. Also, the biossurfactant application yielded a better biodegradation. The mathematical modeling of the biodegradation process was also possible... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O potencial de um sistema de biopilhas em degradar resíduos oleosos provenientes de refinaria de petróleo também chamado de borra de óleo foi estudado, assim como a possibilidade de otimizar o mesmo através da bioestimulação (adição de fertilizantes) e bioenriquecimento (adição de inóculo). Primeiramente, verificou-se a biodegradabilidade do resíduo através do método respirométrico de Bartha, quantificando o CO2 emitido, observando os efeitos do uso de inóculo e de fertilizantes neste processo. Os microrganismos utilizados na produção do inóculo, fungos e bactérias, foram isolados de "landfarming" da Refinaria de Paulínia, REPLAN, estado de São Paulo, por serem adaptados ao ambiente de estresse ocasionado pelo resíduo oleoso e por terem demonstrado capacidade em biodegradar hidrocarbonetos de petróleo, em ensaios prévios realizados em laboratório. Foram construídas cinco biopilhas contendo solo poluído pela borra de óleo, nas constituições: 1 controle do experimento; 2 adicionada com inóculo; 3 com inóculo e fertilizante para plantas; 4 com inóculo e palha de arroz; 5 com inóculo, fertilizante e palha de arroz. Os resultados após 350 dias demonstraram redução da quantidade de resíduo em todas as biopilhas: 67%, 70%, 75%, 82% e 79% nas biopilhas 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente. As biopilhas contendo palha de arroz demonstraram degradação mais rápida do resíduo, principalmente nos dois primeiros meses deste estudo, provavelmente devido ao maior número de microrganismos que foram observados nas mesmas decorrente da adição do inóculo ou estimulação da microbiota natural. Nas condições de estudo, o inóculo adicionado nas biopilhas 2 e 3 não sobreviveram ao novo ambiente não influenciando a degradação do resíduo assim como a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The potential of a biopile system to degradate oily residues from a petroleum refinery also called oil sludge was studied, as well as the possibility of its optimization through biostimulation (fertilizers addition) and bioaugmentation (inoculum addition). First, the biodegradability of the residue was verified through the Bartha flasks, quantifying the CO2 emitted, observing the effects of the inoculum and fertilizer use in this process. The microorganisms used in the inoculum production were isolated from the landfarming of Refinery of Paulínia, REPLAN, São Paulo State, as they are adapted to the environmental stress provoked by the oily residue showed the capacity to degradate petroleum hydrocarbons in previous assays in laboratory. Five biopiles were built with the soil polluted by the oil sludge, they were constituted by: 1 experimental control, 2 with inoculum; 3 with inoculum and plant fertilizer; 4 with inoculum and rice straw; 5 with inoculum, fertilizer and rice straw. The results after 350 days showed a reduction of the residue quantity in all the biopiles: 67%, 70%, 75%, 82% and 79% in the biopiles 1, 2, 3, 4 and 5 respectively. The biopiles containing rice straw showed a faster degradation of the residue mainly during the first two months of this study, probably due to the higher number of microorganisms provoked by the addition of the inoculum or stimulation natural microorganisms. At the conditions of this study, the addition of the inoculum to the biopiles 2 and 3 did not survive in the new environment not influencing the residue degradation, as well as the fertilizer addition did not have any influence to the biopiles 3 and 5. It was clear the importance of the addition of materials and aggregated such as the rice straw, to improve the soil characteristics regarding to aeration and permeability... (Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Orientador: Sâmia Maria Tauk-Tornisielo / Coorientador: Ana Paula de Arruda Geraldes Kataoka / Banca: Ariovaldo José da Silva / Banca: Roberto Naves Domingos / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Mirna Helena Regali Seleghim / Banca: Eduardo Alves de Almeida / Resumo: Os basidiomicetos são conhecidos por sua capacidade em degradar a madeira. Essa característica deve-se à sua habilidade em oxidar a lignina presente nas plantas. Essa molécula é um composto recalcitrante formado por sub-unidades de fenilpropanóides e as enzimas capazes de degradá-la são conhecidas conjuntamente como enzimas ligninolíticas. Tais enzimas são inespecíficas. Essa característica confere-lhes o seu emprego na oxidação de compostos que possuem estrutura molecular semelhante à da lignina, tais como pesticidas e hidrocarbonetos poli-aromáticos, que possuem anéis aromáticos em sua estrutura. Dessa forma, é possível utilizar tais enzimas na degradação desses xenobióticos. Alguns basidiomicetos possuem a habilidade de crescer em meio com baixa atividade de água. Assim, é possível usá-los em processos de biorremediação de ambientes que possuem uma alta concentração de solutos, como em meios com alta salinidade. Esse trabalho teve como objetivo o estudo da capacidade de crescimento em meio líquido agitado com baixa atividade de água do basidiomiceto Dacryopinax elegans SXS323, promovida pela adição de cloreto de sódio 0,5 M, manitol 0,5 M ou glicerol 0,5 M ao meio de cultura; a produção de enzimas ligninolíticas e o seu poder de degradação do herbicida diurom nessas condições. Verificou-se que o basidiomiceto foi capaz de crescer sob todos os meios testados, sendo este mais pronunciado quando manitol ou glicerol foram acrescentados ao meio, averiguando-se um estímulo de crescimento. O manitol e o glicerol serviram como fonte secundária de carbono. O cloreto de sódio inibiu seu crescimento. Outro fator de inibição do crescimento foi a adição de diurom. A produção de enzimas ligninolíticas foi muito baixa, com pico de atividade de 3,67 U . L -1 com 144 horas de cultivo em meio com glicerol 0,5M. Apesar disso, detectou-se degradação... (Resumo comp'leto, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The basidiomycetes are known for their ability to degrade wood. This feature is due to its ability to oxidize lignin of plants. This molecule is a compound formed by recalcitrant sub-units of phenylpropanoids and enzymes able to degrade it and are known as ligninolytic enzymes. These enzymes are nonspecific. This characteristic provides them the capability of oxidation of compounds that have molecular structures similar to lignin, such as pesticides and polyaromatic hydrocarbons, which possess aromatic rings in their structure. Thus, it is possible to use such enzymes in the degradation of xenobiotics. Some basidiomycetes have their ability to grow in media with low water activity. Thus, it can be used in bioremediation process in environments that have a high concentration of solutes, such as hypersaline environments. This work aimed to study the capability of the basidiomycete Dacryopinax elegans SXS323 to grow in liquid shaken with low water activity, promoted by the addition of sodium chloride 0.5 M, mannitol 0.5 M or glycerol 0.5 M to the medium culture, the production of ligninolytic enzymes and their degradation capability of the herbicide diuron in these conditions. It was found that the basidiomycete was able to grow in all media tested. The growth was most pronounced when mannitol or glycerol was added to the medium, probably working as a stimulus for growth, and were used as a secondary source of carbon. Sodium chloride inhibited its growth. Another factor inhibiting the growth was the addition of diuron. The ligninolytic enzyme production was very low, with peak activity of 3.67 U. L -1 with 144 hours in medium with glycerol 0.5 M. Nevertheless, we detected the degradation of the herbicide, registering 32.63% (glycerol 0.5 M, 192 hours), 25.47% (mannitol 0.5 M, 192 hours) 20.51% of reduction in medium with glucose 5.0 g . L -1 (240 hours)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Crispin Humbero Garcia Cruz / Banca: Benício Alves de Abreu Filho / Banca: Eleni Gomes / Resumo: Surfactantes são moléculas que por apresentarem porções hidrofílicas e hidrofóbicas são capazes de reduzir a tensão superficial de um meio fluido. Esta característica é importante para aplicações industriais fazendo destes tenso-ativos compostos de alto interesse. Compostos de origem microbiana que apresentam características surfactantes são denominados biossurfactantes e apresentam vantagens de serem produzidos a partir de substratos renováveis, serem biodegradáveis, apresentarem baixa toxicidade e especificidade química. O objetivo desse trabalho foi verificar a produção de biossurfactante pela bactéria Bacillus pumilus utilizando glicose, sacarose, vinhaça, óleo residual de fritura e melaço como substrato e avaliar o potencial para aplicação na biorremediação envolvendo óleo residual de fritura. O microrganismo foi mantido em meio ágar nutriente, para a produção de biossurfactante foi utilizado um meio mínimo basal composto por sais e óleo diesel acrescido de concentrações de 1 a 5% de glicose, sacarose, vinhaça, óleo residual de fritura e melaço, o pH foi ajustado a 7,0. A fermentação ocorreu em agitador orbital rotatório a 200 rpm em 30 ºC, e foi verificada a produção de biossurfactante após 24, 48, 72 e 96h de fermentação. Foi verificada a variação do pH após cada período de fermentação. O caldo fermentado foi centrifugado a 7077 x g a 4 ºC por 15 minutos. O crescimento celular foi determinado pela massa celular seca. A presença de biossurfactante foi verificada no caldo livre de células através da medição da tensão superficial, índice de emulsificação e concentração micelar crítica (CMC). O biossurfactante foi precipitado com etanol absoluto. A partir do melhor parâmetro de produção foi verificada a atividade emulsificante, atividade antimicrobiana e potencial para remoção do óleo residual de fritura... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Surfactants are molecules that make portions of hydrophilic and hydrophobic are able to reduce the surface tension of a fluid medium. This feature is very important for industrial applications by making these surface-active compounds of high interest. Compounds of microbial origin that has characteristics surfactants are called biosurfactants and have advantages to be produced from renewable substrates, are biodegradable, they exhibit low toxicity and chemical specificity. The aim of the present study was to evaluate the biosurfactant production by Bacillus pumilus using glucose, sucrose, vinassa, waste frying oil and molasses as substrate and evaluate the potential for application in bioremediation involving residual oil frying. The bacterium organism was maintained on nutrient agar for biosurfactant production, it was used a minimal medium composed of salts and diesel oil increased by concentrations of 1 to 5% glucose, sucrose, vinassa, waste frying oil and molasses, pH was adjusted to 7,0. Fermentation occurred in an orbital shaker rotating at 200 rpm at 30 º C, and was evaluated the production of biosurfactant after 24, 48, 72 and 96 hours of fermentation. The change in pH was observed after each period of fermentation. The fermented broth was centrifuged at 7077 x g at 4 ° C for 15 minutes. The cell growth was determined by dry mass. The presence of biosurfactant was found in the cell-free broth by measuring the surface tension, emulsification index and critical micelle concentration (CMC). The biosurfactant was precipitated with absolute ethanol. From the best measure of production was checked emulsifying activity, antimicrobial activity and potential for removal of residual oil from frying the water and sand. Sucrose was the best substrate, it showed the highest biosurfactant production (26.83 g / L) and greater reduction of surface tension (32 mN / m)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre