Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Gabriel Padilla Maldonado / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Resumo: As PKSs tipo II são complexos enzimáticos envolvidos na produção de policetídeos. Estes são metabólitos secundários que possuem papel-chave no desencadeamento das respostas bioquímicas que levam à diversificação fisiológica frente a fatores adversos, fazem parte da composição de pigmentos de esporos microbianos, além de comporem a estrutura química de importantes antibióticos explorados pela indústria farmacêutica. Foi feita a prospecção de novos "clusters" gênicos para PKSs tipo II em uma biblioteca metagenômica de 9.320 clones, através de amplificação por PCR com "primers" degenerados para uma região gênica conservada. Dentre três clones encontrados, um foi sequenciado pela estratégia de shotgun, resultando em um consensus de 22.988 pares de bases. Foi feita a predição funcional de ORFs por homologia obtida com a ferramenta Blast (NCBI) e também a identificação de domínios enzimáticos pelo PRODOM e PFAM. Dentre os resultados da predição por homologia de domínios enzimáticos foi possível identificar ORFs homologas à: reguladores gênicos (LacI e LuxR); carboidrases (Lacases, β-glucosidases, Quitinases/Celulases); transferases (O-metil-transferases, Acíl-transferases); pks mínima; ciclases, aromatases, hidroxilases, mono-oxigenases e transportadores ABC. Alguns "clusters" enzimáticos podem ainda atuar em degradação de celulose e lignina. As enzimas candidatas ao core biossíntético do "cluster" (pks mínima) foram submetidas à modelagem de estrutura tridimensional in silico. Os modelos 3D foram avaliados quanto a acurácia, utilizando as ferramentas: Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage e Swiss-Model. Uma vez validados, as KSA e CLF foram submetidas a simulações de "docking" enzimático / Abstract: The type II PKSs are enzyme complexes involved in the production of polyketides. These are secondary metabolites that have key role in triggering the biochemical responses that lead to physiological diversification against adverse factors are part of the pigment composition of microbial spores, and compose the chemical structure of most antibiotics exploited by the pharmaceutical industry. Some clusters could act in enzymatic degradation of cellulose and lignin. It was made a prospection for new clusters gene for type II PKSs in a metagenomic library of 9320 clones by PCR amplification with degenerate primers for a conserved gene region. Among three clones found, one was sequenced by subcloning and shotgun strategy, resulting in a consensus of 22,988 base pairs. It was made the prediction of functional homology ORFs by Blast (NCBI) and also identifying areas for enzymatic Prodom and PFAM. Among them were found homologous to: ABC transporters; minimal PKS, cyclasea; Aromatasea; Hydroxylases; Mono-oxygenases; O-methyl-transferases; Multicopper oxidase/laccase, β-glucosidase, chitinase/ Cellulases; Peptidases; Acyl-transferases, in addition of gene regulators similar to LacI and LuxR. The biosynthetic enzymes candidates for the core of the cluster (minimal pks) underwent three-dimensional structure modeling in silico. The 3D models were evaluated for accurate, using the tools of 'Assessing "Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage and Swiss-Model. Once validated, the KSA and CLF were subjected to simulated docking enzyme between them / Mestre

Orientador: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Alessandro Minillo / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Resumo: A estratégia de clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA é uma das técnicas moleculares que permite estimar e comparar a diversidade microbiana de diferentes amostras ambientais. O objetivo deste trabalho foi estimar a diversidade de microrganismos pertencentes ao Domínio Bactéria em um consórcio degradador de óleo diesel, por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA, assim como desenvolver uma nova metodologia de rastreamento em bibliotecas metagenômicas. O consórcio bacteriano foi obtido através de solo enriquecido com óleo diesel. O DNA metagenômico foi extraído com o auxílio do kit Fast DNA spin Kit for soil (Bio101- Quantum Biotechnologies) e amplificado por uma reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com os oligonucleotídeos iniciadores FD1 e RD1 específicos para a o gene 16S rRNA. Os produtos de PCR foram clonados em vetor pGEM T Easy (Promega) e transformados em células competentes de Escherichia Coli DH5 . O sequenciamento parcial dos clones foi feito com oligonucleotideos universais do vetor. Para a prospecção gênica foi utilizado membranas de nylon com "pools" de DNA de todas as placas. A biblioteca obtida gerou 431 clones. Os clones obtidos apresentaram similaridade com o filo Proteobacteria, com representantes das classes Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira e Betaproteobacteria. O gênero Pseudomonas apresentou-se com maior frequência de clones na biblioteca. O "software" DOTUR foi usado para determinar o número de unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A curva de extinção indicou que os 431 clones sequenciado foram suficientes para estimar a diversidade bacteriana do consórcio. A metodologia testada baseado em "pools" de DNA foi eficiente na detecção e isolamento do gene Alkb na bilbioteca metagenomica. / Abstract: Cloning and sequencing of 16S rRNA gene it is one of the molecular techniques that permits estimate and compare the microbial diversity of different environmental samples. The aim of this work was estimate the diversity of microorganisms that belong to Bacteria domain in a consortium specialized in diesel oil degradation, through partial sequencing of 16S rRNA gene, as well as develop a new methodology for screening libraries in metagenomics. This consortium was obtained through enrichments achieved using diesel oil in soil samples. The metagenomic DNA was obtained using Fast DNA spin Kit for soil (Bio 101-Quantum Biotechnologies) and amplified by PCR (Polymerase chain reaction) with FD1 and RD1 oligonucleotides, which are specific for 16S rRNA gene. The PCR products were cloned into pGEM-TEasy vector (Promega) and Escherichia coli DH5 was used as the host cell for recombinant DNAs. The partial clones sequencing was obtained using universal primers of the vector. For the exploration of gene were used nylon membranes with Pools of DNA from all plates. The library generated from 431 clones. All clones sequenced showed similarity with the phylum Proteobacteria, distributed in Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira and Betaproteobacteria classes. The Pseudomonas genus was the most abundant genus found in the metagenomic library. The DOTUR software was used to assigns sequences to operational taxonomic units (OTUs). Using the OTUs composition data, rarefaction curves were made to show that 431 sequences were enough to obtain a satisfactory coverage of diversity of the microbial consortium. The test methodology based on Pools of DNA isolation was effective in detecting the gene Alkb Library metagenomics. / Mestre

Resumo: Métodos tradicionais de isolamento e cultivo limitam análises da diversidade microbiana no meio ambiente, pois acredita - se que aproximadamente 10% desses microrganismos possam ser cultivados. A ecologia microbiana molecular teve recentes progressos através da construção de bibliotecas metagenômicas, o que constitui uma poderosa abordagem para explorar a diversidade microbiana de solo fornecendo inclusive dados sobre os microrganismos não cultiváveis desse habitat. Este trabalho teve por objetivo comparar e estimar a diversidade de comunidades bacterianas, em solos de duas áreas, sendo solo de Floresta Nativa (SFN) e a outra sob arboreto com eucaliptos (SAE) de uma mesma região. Utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos, o gene 16S rRNA foi amplificado por PCR, os amplicons foram clonados em pGEMR-T e os clones obtidos seqüenciados parcialmente. No solo SFN foram analisados 231 clones e no solo SRE 248 clones. As seqüências obtidas foram submetidas à análise de similaridade de nucleotídeos com o banco de dados GenBank. Os filos bacterianos que mais se destacaram nos dois tipos de solo foram Acidobacteria e Proteobacteria. No solo SFN destacaram-se também as bactérias pertencentes ao filo Bacteroidetes e no solo SAE observou-se alta freqüência das bactérias Actinobacteria. Análises filogenéticas revelaram diferenças em ambos os solos, verificando através de índice de diversidade bacteriana observou-se que o solo sob eucalipto apresentou maior diversidade quando comparado ao solo sob de Floresta Nativa. / Abstract: Traditional methods of isolation and culture limits the analyses of the microbian diversity in the environment, because it is believed - that approximately 10% of these microrganisms can be cultivated. The molecular microbian ecology have had recent progress through the construction of metagenomics Iibraries, what constitutes a powerful boarding to explore the microbian diversity of soil, also supplying information on the microrganisms that cannot be cultivated on this habitat. This work had the objective of stimate the diversity of bacterial communities, in two areas, an area of Native Forest (SFN) and the another one under eucalypts (SAE) of the same region. Using specific oligonucleotides starters, the gene 16S rRNA was amplified by PCR, amplicons had been cloned in pGEMR-T and the obtained clones were partial/y sequenced. In the soil SFN, 231 clones had been analyzed and 248 clones in the soil SAE. The sequences obtained were submitted to the nucleotides similarity analysis with the GenBank database. The bacterial phylum that was more evident in the two types de soil were Acidobacteria and Proteobacteria. In the soi! SFN the bacteria of the phylum Bacteroidetes were evident and in the soil SRE high frequency of the Actinobacteria bacteria was observed. Phylogenetic analyses reveled an extensive diversity in both soils, verified through diversity index differences in the bacterial communities in both areas, and that the area under eucalypt presented more diversity in relation to the area of Native Forest. / Orientadora: Lúcia Maria Carareto Alves / Coorientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Janete Apparecida Desiderio Sena / Banca: Uderlei Doniseti Silveira Covissi / Mestre