Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Coorientador: Antônio Fernandes da Silva Junior / Banca: Eduardo Bagagli / Banca: José Belasque Junior / Banca: Luís Otávio Saggion Beriam / Banca: Renate Krause Sakate / Resumo: Uma das principais doenças bacterianas que acomete a cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) no Brasil é a murcha-de-curtobacterium, causa por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Até o momento são escassas as informações a respeito da sobrevivência da bactéria no cultivo do feijoeiro, fato que pode interferir no manejo e controle da doença, além de informações a respeito da variabilidade genética da bactéria. Assim, esta pesquisa teve por objetivos analisar o potencial de algumas coberturas de inverno como hospedeiras alternativas de Cff, avaliar o efeito destas culturas aplicadas em sistema de rotação com o feijoeiro na incidência e severidade da doença, avaliar o comportamento de genótipos de feijoeiro que melhor se adaptam à doença em regiões do estado do Paraná, verificar a sobrevivência de Cff como células livres no solo e analisar a variabilidade genética da bactéria pela técnica de análise por sequências multilocus (MLSA). Foi observado que Cff pôde colonizar epifiticamente ou endofiticamente a aveia preta, trigo, aveia branca, cevada, azevém e canola. Os cultivos prévios da aveia preta e do trigo propiciaram o aumento da incidência e severidade da doença no feijoeiro, bem como redução no peso médio de 100 grãos. A produtividade média do feijoeiro teve uma redução de 50,64% em uma área com maior intensidade da doença, com parâmetros agronômicos (número de vagens/planta, número de grãos/planta, peso dos grãos/planta e peso de 100 grãos), m... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: One of the most important diseases of common bean in Brazil is the bacterial wilt, caused by Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Until now, there is no much knowledge about how this bacterium survives on common bean, fact that could interfere with the disease management, besides of information about genetic variability of the bacterium. In this work we studied the potential of some winter crops as alternative hosts of Cff; the effect of these crops in the incidence and severity of bacterial wilt in rotation with common bean; detection of common bean cultivars with resistance levels to Cff in regions of Paraná State; study the survival of Cff as free cells in the soil; and assess the genetic variability of the bacterium by multilocus sequence analysis (MLSA). Cff colonized epiphytically and endophytically black oat, wheat, white oat, barley, ryegrass and canola. The previous crop of black oat and wheat increased the incidence and severity of bacterial wilt and reduced the average weight of 100 grains. The average production of common bean decreased 50,64% in area with higher intensity of disease, with reduction of number of pods/plant, number of grains/plant, weigh of grains/plant and weigh of 100 bean grains. The previous crop of corn and soybean reduced the Cff incidence and increased the bean production. The cultivars IPR Juriti and IPR Tuiuiú shown greater level of reistance for bacterial wilt and were more productive in Paraná State. Cff strains showed... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Jonas Contiero / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Danielle Biscaro Pedrolli / Banca: Antonio José Gonçalves da Cruz / Banca: Luiz Carlos Basso / Resumo: O glicerol de biodiesel pode ser utilizado para produção de 1,3 propanodiol por bactérias. Nesse estudo sobre a produção de 1,3 propanodiol por Klebsiella pneumoniae GLC29 foi possível otimizar o meio de cultura para a produção de 1,3-propanodiol utilizando técnicas estatísticas de planejamento experimental e superfície de resposta, onde foram experimentados 11 possíveis variáveis no meio de cultura e verificou-se a influência de apenas 5 (glicerol, extrato de levedura, sulfato de amônio, vitamina B12 e Fumarato). Posteriormente, verificou-se a produção desse composto em bioreatores de 0,75 litros, tanto em batelada como batelada alimentada exponencial, onde foi possível atingir 23.6 g/L de 1,3-propanodiol em batelada usando glicerol puro, 27 g/L de 1,3-propanodiol em batelada usando glicerol bruto de biodiesel e 29.9 g/L de 1,3-propanodiol usando glicerol bruto de biodiesel por batelada alimentada exponencial. Além da otimização, foi possível amplificar e clonar todos os genes responsáveis à produção de 1,3-propanodiol de Klebsiella pneumoniae GLC29 em um plasmídeo usando a técnica Gibson Assembly, um método recente de montagem isotermal. Os genes foram expressos em cepas de Escherichia coli, e foi então verificada a produção de 1,3-propanodiol em frascos e bioreatores, onde foi possível atingir 11 g/L de 1,3-propanodiol produzido por E. coli SZ63 contendo o plasmídeo pSB1C3-dhaB123TFG em batelada alimentada / Abstract: Biodiesel glycerol can be used for the production of 1,3-propanediol by bacteria. In this study on the production of 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae GLC29 was possible to optimize media culture the production of 1,3-propanediol using statistical experimental design techniques and response surface methodology, where 11 variables were tested and only 5 were found significant (glycerol, yeast extract, ammonium sulfate, vitamin B12 and fumarate). Subsequently, production of 1,3-propanediol was verified in 0,75 liter reactors, both in batch and exponential fed-batch. It was possible to achieve 23.6 g/L of 1,3- propanediol in batch cultures using pure glycerol, 27 g/L of 1,3-propanediol in batch cultures using biodiesel glycerol, and 29.9 g/L of 1,3-propanediol in exponential fed-batch using biodiesel glycerol. Also, it was possible to amplify and clone all the genes responsible for the production of 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae GLC29 in a plasmid, using Gibson assembly, a recent isothermal assembly methodology. The genes were expressed in Escherichia coli strains, and it was then verified the production of 1,3-propanediol in flasks and bioreactors, in which it was possible to reach 11 g/L 1,3-propanediol produced by E. coli SZ63 with the plasmid pSB1C3-dhaB1234TFG in fed-batch cultures / Doutor

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:56Z : No. of bitstreams: 1 000832760_20170311.pdf: 139938 bytes, checksum: 0737e841b7271a870a44ca0eb7d96746 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-17T12:37:59Z: 000832760_20170311.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-17T12:39:05Z : No. of bitstreams: 1 000832760.pdf: 3326019 bytes, checksum: 72ebef8783b6896ac1a2e1353815020e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O glicerol de biodiesel pode ser utilizado para produção de 1,3 propanodiol por bactérias. Nesse estudo sobre a produção de 1,3 propanodiol por Klebsiella pneumoniae GLC29 foi possível otimizar o meio de cultura para a produção de 1,3-propanodiol utilizando técnicas estatísticas de planejamento experimental e superfície de resposta, onde foram experimentados 11 possíveis variáveis no meio de cultura e verificou-se a influência de apenas 5 (glicerol, extrato de levedura, sulfato de amônio, vitamina B12 e Fumarato). Posteriormente, verificou-se a produção desse composto em bioreatores de 0,75 litros, tanto em batelada como batelada alimentada exponencial, onde foi possível atingir 23.6 g/L de 1,3-propanodiol em batelada usando glicerol puro, 27 g/L de 1,3-propanodiol em batelada usando glicerol bruto de biodiesel e 29.9 g/L de 1,3-propanodiol usando glicerol bruto de biodiesel por batelada alimentada exponencial. Além da otimização, foi possível amplificar e clonar todos os genes responsáveis à produção de 1,3-propanodiol de Klebsiella pneumoniae GLC29 em um plasmídeo usando a técnica Gibson Assembly, um método recente de montagem isotermal. Os genes foram expressos em cepas de Escherichia coli, e foi então verificada a produção de 1,3-propanodiol em frascos e bioreatores, onde foi possível atingir 11 g/L de 1,3-propanodiol produzido por E. coli SZ63 contendo o plasmídeo pSB1C3-dhaB123TFG em batelada alimentada / Biodiesel glycerol can be used for the production of 1,3-propanediol by bacteria. In this study on the production of 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae GLC29 was possible to optimize media culture the production of 1,3-propanediol using statistical experimental design techniques and response surface methodology, where 11 variables were tested and only 5 were found significant (glycerol, yeast extract, ammonium sulfate, vitamin B12 and fumarate). Subsequently, production of 1,3-propanediol was verified in 0,75 liter reactors, both in batch and exponential fed-batch. It was possible to achieve 23.6 g/L of 1,3- propanediol in batch cultures using pure glycerol, 27 g/L of 1,3-propanediol in batch cultures using biodiesel glycerol, and 29.9 g/L of 1,3-propanediol in exponential fed-batch using biodiesel glycerol. Also, it was possible to amplify and clone all the genes responsible for the production of 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae GLC29 in a plasmid, using Gibson assembly, a recent isothermal assembly methodology. The genes were expressed in Escherichia coli strains, and it was then verified the production of 1,3-propanediol in flasks and bioreactors, in which it was possible to reach 11 g/L 1,3-propanediol produced by E. coli SZ63 with the plasmid pSB1C3-dhaB1234TFG in fed-batch cultures / FAPESP: 2011/01974-3 / FAPESP: 2011/21620-1

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-12Bitstream added on 2014-06-13T20:43:08Z : No. of bitstreams: 1 rossi_jr_dr_jabo_parcial.pdf: 88852 bytes, checksum: f0badc33849f0f480aac58f70772e600 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-16T10:37:50Z: rossi_jr_dr_jabo_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-01-16T10:38:35Z : No. of bitstreams: 1 000671176.pdf: 1093299 bytes, checksum: d1fd5a36d749654ea04ac75ca09f863d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A caracterização molecular de 46 isolados de Bacillus thuringiensis foi realizada por meio da técnica de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores gerais Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r), resultando na identificação do isolado BT_I622 como portador do gene cry8 (coleóptero-específico). O fragmento obtido de aproximadamente 376 pares de base (pb), localizado na porção inicial do gene, foi clonado em vetor pGEM®-T Easy, sequenciado e analisado por bioinformática. A determinação da sequência completa do gene cry8 presente no isolado BT_I622, foi realizada pela estratégia de “primer walking” com a utilização de oligonucleotídeos específicos. Os iniciadores foram elaborados através do programa Primer3, com base nas sequências de genes cry8 depositadas no banco de dados público GenBank (NCBI) e, por meio da análise das sequências geradas com o par de oligonucleotídeos gerais utilizados inicialmente na caracterização dos isolados. As amplificações com diferentes combinações de iniciadores resultaram na obtenção de fragmentos em torno de 1420, 3302, 628, 1580, 508 e 510 pb, os quais foram clonados, sequenciados e analisados pelos programas Phred/Phrap/Consed visando a montagem do gene. A sequência contendo 3531 pb foi comparada ao GenBank pela ferramenta BLASTn, apresentando 98% de similaridade com o gene cry8Ka2. Paralelamente, a sequência de aminoácidos deduzida (1176 aa) revelou 75% de identidade com a proteína Cry8Ba1 na análise com o algoritmo BLASTp, demonstrando que o isolado BT_I622 é portador de um novo gene cry8. Os bioensaios indicaram que as larvas de Sphenophorus levis são sensíveis a nova proteína Cry8 de B. thuringiensis / The molecular characterization of 46 Bacillus thuringiensis isolates was carried out using the PCR technique with primers designed to detect cry8 genes (Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r)), resulting in the identification of the isolate BT_1622 as a cry8 gene carrier (coleopteran specific). The ca. 376 base pairs (bp) fragment obtained was located in the initial part of the gene, which was cloned into the plasmid pGEM®-T Easy, sequenced and analyzed by bioinformatics. The complete sequence determination of this gene found within isolate BT_1622 was done using the “primer walking” strategy. The primers were designed using the software Primer3, comparing to previously sequenced cry8 genes found in the public database GenBank (NCBI) and analyzing the sequences generated with the pair of general primers used initially in the characterization of isolates. The amplifications with different primer combinations resulted other fragments of this gene with 1,420; 3,302; 628; 1,580; 508 and 510 bp, which were cloned, sequenced and analyzed using the software Phred/Phrap/Consed to obtain the full gene. The 3,531 bp sequence was compared to the GenBank using the BLASTn tool, and showed 98% of similarity with the gene cry8Ka2. Also, the deduced amino acid sequence (1,176 amino acids) showed 75% identity to the Cry8Ba1 using the algorithm BLASTp, demonstrating that the isolate BT_1622 carriers a new cry8 gene. The bioassay results indicated that the Sphenophorus levis larvae are sensitive to the new Cry8 protein of B. thuringiensis

Orientador: Everlon Cid Rigobelo / Banca: Hélio José Montassier / Banca: José Carlos Rende / Resumo: O presente estudo foi realizado no período de janeiro de 2012 a janeiro de 2013 em fazendas leiteiras da região de Dracena, São Paulo. Durante o período, foram coletadas 800 amostras de fezes com suabes retais em vacas leiteiras. Essas amostras foram levadas para o Laboratório de Microbiologia do Campus Experimental de Dracena, onde foram isoladas e identificadas 561 amostras para Escherichia coli. Após o isolamento foram extraídos os DNAs de todas as amostras pelo método da fervura e por PCR o DNA foi amplificado para se detectar a presença dos genes de virulência de E. coli pertencentes ao grupo STEC, produtora de toxina tipo shiga em 446 amostras. De todas as cepas isoladas 90 eram portadoras do gene stx1, 97 do gene stx2, 45 do gene eae, 37 dos genes stx1 e stx2, 110 dos genes stx1 e eae e 67 dos genes stx2 e eae. Foram isoladas também 115 cepas que não eram portadoras de nenhum dos genes de virulência de STECs do estudo. Todos os isolados de E. coli portadores de cada gene de virulência foram avaliados quanto a resistência frente a 10 antimicrobianos. Os percentuais de resistências aos antimicrobianos foram maiores para a lincomicina, penicilina e novobiocina e menores para ampicilina, neomicina e tetraciclina. Foram identificados os sorogrupos, dos quais os mais frequentes entre os isolados portadores do gene de virulência stx1 foram o O119 e O114; do gene de virulência stx2 foram os sorogrupos O9 e O8; e do gene de virulência eae foram os sorogrupos O9, O8 e O127. Todos os isolados de E. coli apresentaram multirresistência e a maioria apresentou maior percentagem de multirresistência contra 2 a 3 e contra 10 antimicrobianos. Não foi verificado estatisticamente relação entre os padrões de virulência e os padrões de resistência aos antimicrobianos entre as amostras / Abstract: The present study was conducted between january 2012 to january 2013 on dairy farms of Dracena city region, São Paulo. During the period, 800 samples of faeces were collected with rectal suabs from dairy cattle cows. Those samples were taken to the laboratory of microbiology of Dracena Experimental Campus, where 561 samples were isolated and identified for Escherichia coli. After the DNA from the samples were extracted by the boiling method and with PCR the genetic material was amplified to detect the presence of virulence genes from STEC, shiga-like toxin producer E. coli, on 446 samples. Of those samples, 90 were carriers of the stx1 gene, 97 of the gene stx2, 45 of the gene eae, 37 of the genes stx1 and stx2, 110 of the genes stx1 and eae, 67 of the genes stx2 and eae. Also were isolated 115 samples that did not carry none of the virulence genes from STECs of the study. All the E. coli isolates of each virulence gene were evaluated for resistence to 10 antibiotics. The percentual of resistence were higher for lincomycin, penicillin and novobiocin and lower for ampicillin, neomycin and tetracycline. A serogroup test was made, of which the most frequent among isolates carrying the virulence gene stx1 were O119 and O114; of the gene stx2 were serogroups O8 and O9; and of the gene eae were the serogroups O9, O8 and O127. All the E. coli isolates presented multirresistence and most isolates presented more percentage of multirresistence against 2 to 3 and against 10 antibiotics. Was not verified statistically relationship between virulence patterns and patterns of antimicrobial resistance among the samples / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-10-11Bitstream added on 2014-06-13T19:14:38Z : No. of bitstreams: 1 000738835.pdf: 2748761 bytes, checksum: dcad72914370b9d270982eb35f883ae3 (MD5) / O presente estudo foi realizado no período de janeiro de 2012 a janeiro de 2013 em fazendas leiteiras da região de Dracena, São Paulo. Durante o período, foram coletadas 800 amostras de fezes com suabes retais em vacas leiteiras. Essas amostras foram levadas para o Laboratório de Microbiologia do Campus Experimental de Dracena, onde foram isoladas e identificadas 561 amostras para Escherichia coli. Após o isolamento foram extraídos os DNAs de todas as amostras pelo método da fervura e por PCR o DNA foi amplificado para se detectar a presença dos genes de virulência de E. coli pertencentes ao grupo STEC, produtora de toxina tipo shiga em 446 amostras. De todas as cepas isoladas 90 eram portadoras do gene stx1, 97 do gene stx2, 45 do gene eae, 37 dos genes stx1 e stx2, 110 dos genes stx1 e eae e 67 dos genes stx2 e eae. Foram isoladas também 115 cepas que não eram portadoras de nenhum dos genes de virulência de STECs do estudo. Todos os isolados de E. coli portadores de cada gene de virulência foram avaliados quanto a resistência frente a 10 antimicrobianos. Os percentuais de resistências aos antimicrobianos foram maiores para a lincomicina, penicilina e novobiocina e menores para ampicilina, neomicina e tetraciclina. Foram identificados os sorogrupos, dos quais os mais frequentes entre os isolados portadores do gene de virulência stx1 foram o O119 e O114; do gene de virulência stx2 foram os sorogrupos O9 e O8; e do gene de virulência eae foram os sorogrupos O9, O8 e O127. Todos os isolados de E. coli apresentaram multirresistência e a maioria apresentou maior percentagem de multirresistência contra 2 a 3 e contra 10 antimicrobianos. Não foi verificado estatisticamente relação entre os padrões de virulência e os padrões de resistência aos antimicrobianos entre as amostras / The present study was conducted between january 2012 to january 2013 on dairy farms of Dracena city region, São Paulo. During the period, 800 samples of faeces were collected with rectal suabs from dairy cattle cows. Those samples were taken to the laboratory of microbiology of Dracena Experimental Campus, where 561 samples were isolated and identified for Escherichia coli. After the DNA from the samples were extracted by the boiling method and with PCR the genetic material was amplified to detect the presence of virulence genes from STEC, shiga-like toxin producer E. coli, on 446 samples. Of those samples, 90 were carriers of the stx1 gene, 97 of the gene stx2, 45 of the gene eae, 37 of the genes stx1 and stx2, 110 of the genes stx1 and eae, 67 of the genes stx2 and eae. Also were isolated 115 samples that did not carry none of the virulence genes from STECs of the study. All the E. coli isolates of each virulence gene were evaluated for resistence to 10 antibiotics. The percentual of resistence were higher for lincomycin, penicillin and novobiocin and lower for ampicillin, neomycin and tetracycline. A serogroup test was made, of which the most frequent among isolates carrying the virulence gene stx1 were O119 and O114; of the gene stx2 were serogroups O8 and O9; and of the gene eae were the serogroups O9, O8 and O127. All the E. coli isolates presented multirresistence and most isolates presented more percentage of multirresistence against 2 to 3 and against 10 antibiotics. Was not verified statistically relationship between virulence patterns and patterns of antimicrobial resistance among the samples

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-04-07Bitstream added on 2014-06-13T19:14:40Z : No. of bitstreams: 1 silveira_el_me_jabo.pdf: 655008 bytes, checksum: ac46de019a2703894b3c1bc37633b43c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Métodos tradicionais de isolamento e cultivo limitam análises da diversidade microbiana no meio ambiente, pois acredita - se que aproximadamente 10% desses microrganismos possam ser cultivados. A ecologia microbiana molecular teve recentes progressos através da construção de bibliotecas metagenômicas, o que constitui uma poderosa abordagem para explorar a diversidade microbiana de solo fornecendo inclusive dados sobre os microrganismos não cultiváveis desse habitat. Este trabalho teve por objetivo comparar e estimar a diversidade de comunidades bacterianas, em solos de duas áreas, sendo solo de Floresta Nativa (SFN) e a outra sob arboreto com eucaliptos (SAE) de uma mesma região. Utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos, o gene 16S rRNA foi amplificado por PCR, os amplicons foram clonados em pGEMR-T e os clones obtidos seqüenciados parcialmente. No solo SFN foram analisados 231 clones e no solo SRE 248 clones. As seqüências obtidas foram submetidas à análise de similaridade de nucleotídeos com o banco de dados GenBank. Os filos bacterianos que mais se destacaram nos dois tipos de solo foram Acidobacteria e Proteobacteria. No solo SFN destacaram-se também as bactérias pertencentes ao filo Bacteroidetes e no solo SAE observou-se alta freqüência das bactérias Actinobacteria. Análises filogenéticas revelaram diferenças em ambos os solos, verificando através de índice de diversidade bacteriana observou-se que o solo sob eucalipto apresentou maior diversidade quando comparado ao solo sob de Floresta Nativa. / Traditional methods of isolation and culture limits the analyses of the microbian diversity in the environment, because it is believed - that approximately 10% of these microrganisms can be cultivated. The molecular microbian ecology have had recent progress through the construction of metagenomics Iibraries, what constitutes a powerful boarding to explore the microbian diversity of soil, also supplying information on the microrganisms that cannot be cultivated on this habitat. This work had the objective of stimate the diversity of bacterial communities, in two areas, an area of Native Forest (SFN) and the another one under eucalypts (SAE) of the same region. Using specific oligonucleotides starters, the gene 16S rRNA was amplified by PCR, amplicons had been cloned in pGEMR-T and the obtained clones were partial/y sequenced. In the soil SFN, 231 clones had been analyzed and 248 clones in the soil SAE. The sequences obtained were submitted to the nucleotides similarity analysis with the GenBank database. The bacterial phylum that was more evident in the two types de soil were Acidobacteria and Proteobacteria. In the soi! SFN the bacteria of the phylum Bacteroidetes were evident and in the soil SRE high frequency of the Actinobacteria bacteria was observed. Phylogenetic analyses reveled an extensive diversity in both soils, verified through diversity index differences in the bacterial communities in both areas, and that the area under eucalypt presented more diversity in relation to the area of Native Forest.

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Helen Alves Penha / Banca: Fabrício José Jaciani / Banca: Flávia Maria de Souza Carvalho / Resumo: O cancro cítrico tem como agente causal a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), que afeta diferentes espécies de citros economicamente importantes. É uma doença ainda sem método curativo, e pela sua relevância e dano econômico, faz-se necessário o entendimento em termos moleculares da interação Xac-citros para o desenvolvimento de estratégias que controlem a doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da deleção da ORF XAC0024 presente no genoma da Xac isolado 306, que codifica uma proteína hipotética conservada e que apresenta vários domínios putativos, entre eles o domínio peptidase M23. A hipótese é que esta proteína pode estar envolvida com a patogenicidade e/ou virulência da bactéria. Para obter o mutante ΔXAC0024 foi utilizada a técnica de mutagênese sítio-dirigida, seguida de recombinação homóloga com o vetor suicida pOK1. O mutante ΔXAC0024 foi analisado em relação às características de patogenicidade, crescimento in vivo e in vitro, capacidade de autoagregação, produção de biofilme e produção de goma xantana. O teste de patogenicidade e a curva de crescimento in vivo foram realizados em limão cravo utilizando o método de infiltração por seringa para a inoculação da bactéria. Os sintomas do desenvolvimento da doença foram registrados por fotografia digital até o 25º dia após a inoculação (dai) e a curva de crescimento in vivo também foi determinada até o 25º dai. A curva de crescimento in vitro e a agregação célula-a-célula foram analisa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a disease that affects different species of economically important citrus. There is no a curative method for this disease, and do to its relevance and economic damage, it is necessary to understand at molecular level the Xac-citrus interaction in order to develop strategies to control the disease. The objective of this study was to investigate the effects of the deletion of the ORF XAC0024 present in the genome of Xac strain 306, which encodes a conserved hypothetical protein and has several putative domains, including peptidase M23 domain. It is hypothesized that this protein may be involved in the pathogenicity and / or virulence of the bacterium. For the ΔXAC0024 mutant was used for site-directed mutagenesis technique, followed by homologous recombination with the suicide vector pOK1. The ΔXAC0024 mutant was analyzed in relation to pathogenicity characteristics, growth in vivo and in vitro, self-aggregation capacity, biofilm production and production of xanthan gum. The pathogenicity test and in vivo growth curves were performed on Rangpur lime using syringe-infiltration method for the inoculation of bacteria. Symptoms of the disease development were recorded by digital photography to the 25° day after inoculation (dai) and in vivo growth curve was also determined to give the 25°. The growth curve in vitro and cell-to-cell aggregation were analyzed in liquid culture medium NB. Biofilm p... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Janete Apparecida Desidério / Banca: Ana Maria Guidelli Thuler / Banca: Fernando Hercos Valicente / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Resumo: A caracterização molecular de 46 isolados de Bacillus thuringiensis foi realizada por meio da técnica de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores gerais Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r), resultando na identificação do isolado BT_I622 como portador do gene cry8 (coleóptero-específico). O fragmento obtido de aproximadamente 376 pares de base (pb), localizado na porção inicial do gene, foi clonado em vetor pGEM®-T Easy, sequenciado e analisado por bioinformática. A determinação da sequência completa do gene cry8 presente no isolado BT_I622, foi realizada pela estratégia de "primer walking" com a utilização de oligonucleotídeos específicos. Os iniciadores foram elaborados através do programa Primer3, com base nas sequências de genes cry8 depositadas no banco de dados público GenBank (NCBI) e, por meio da análise das sequências geradas com o par de oligonucleotídeos gerais utilizados inicialmente na caracterização dos isolados. As amplificações com diferentes combinações de iniciadores resultaram na obtenção de fragmentos em torno de 1420, 3302, 628, 1580, 508 e 510 pb, os quais foram clonados, sequenciados e analisados pelos programas Phred/Phrap/Consed visando a montagem do gene. A sequência contendo 3531 pb foi comparada ao GenBank pela ferramenta BLASTn, apresentando 98% de similaridade com o gene cry8Ka2. Paralelamente, a sequência de aminoácidos deduzida (1176 aa) revelou 75% de identidade com a proteína Cry8Ba1 na análise com o algoritmo BLASTp, demonstrando que o isolado BT_I622 é portador de um novo gene cry8. Os bioensaios indicaram que as larvas de Sphenophorus levis são sensíveis a nova proteína Cry8 de B. thuringiensis / Abstract: The molecular characterization of 46 Bacillus thuringiensis isolates was carried out using the PCR technique with primers designed to detect cry8 genes (Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r)), resulting in the identification of the isolate BT_1622 as a cry8 gene carrier (coleopteran specific). The ca. 376 base pairs (bp) fragment obtained was located in the initial part of the gene, which was cloned into the plasmid pGEM®-T Easy, sequenced and analyzed by bioinformatics. The complete sequence determination of this gene found within isolate BT_1622 was done using the "primer walking" strategy. The primers were designed using the software Primer3, comparing to previously sequenced cry8 genes found in the public database GenBank (NCBI) and analyzing the sequences generated with the pair of general primers used initially in the characterization of isolates. The amplifications with different primer combinations resulted other fragments of this gene with 1,420; 3,302; 628; 1,580; 508 and 510 bp, which were cloned, sequenced and analyzed using the software Phred/Phrap/Consed to obtain the full gene. The 3,531 bp sequence was compared to the GenBank using the BLASTn tool, and showed 98% of similarity with the gene cry8Ka2. Also, the deduced amino acid sequence (1,176 amino acids) showed 75% identity to the Cry8Ba1 using the algorithm BLASTp, demonstrating that the isolate BT_1622 carriers a new cry8 gene. The bioassay results indicated that the Sphenophorus levis larvae are sensitive to the new Cry8 protein of B. thuringiensis / Doutor

Resumo: Métodos tradicionais de isolamento e cultivo limitam análises da diversidade microbiana no meio ambiente, pois acredita - se que aproximadamente 10% desses microrganismos possam ser cultivados. A ecologia microbiana molecular teve recentes progressos através da construção de bibliotecas metagenômicas, o que constitui uma poderosa abordagem para explorar a diversidade microbiana de solo fornecendo inclusive dados sobre os microrganismos não cultiváveis desse habitat. Este trabalho teve por objetivo comparar e estimar a diversidade de comunidades bacterianas, em solos de duas áreas, sendo solo de Floresta Nativa (SFN) e a outra sob arboreto com eucaliptos (SAE) de uma mesma região. Utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos, o gene 16S rRNA foi amplificado por PCR, os amplicons foram clonados em pGEMR-T e os clones obtidos seqüenciados parcialmente. No solo SFN foram analisados 231 clones e no solo SRE 248 clones. As seqüências obtidas foram submetidas à análise de similaridade de nucleotídeos com o banco de dados GenBank. Os filos bacterianos que mais se destacaram nos dois tipos de solo foram Acidobacteria e Proteobacteria. No solo SFN destacaram-se também as bactérias pertencentes ao filo Bacteroidetes e no solo SAE observou-se alta freqüência das bactérias Actinobacteria. Análises filogenéticas revelaram diferenças em ambos os solos, verificando através de índice de diversidade bacteriana observou-se que o solo sob eucalipto apresentou maior diversidade quando comparado ao solo sob de Floresta Nativa. / Abstract: Traditional methods of isolation and culture limits the analyses of the microbian diversity in the environment, because it is believed - that approximately 10% of these microrganisms can be cultivated. The molecular microbian ecology have had recent progress through the construction of metagenomics Iibraries, what constitutes a powerful boarding to explore the microbian diversity of soil, also supplying information on the microrganisms that cannot be cultivated on this habitat. This work had the objective of stimate the diversity of bacterial communities, in two areas, an area of Native Forest (SFN) and the another one under eucalypts (SAE) of the same region. Using specific oligonucleotides starters, the gene 16S rRNA was amplified by PCR, amplicons had been cloned in pGEMR-T and the obtained clones were partial/y sequenced. In the soil SFN, 231 clones had been analyzed and 248 clones in the soil SAE. The sequences obtained were submitted to the nucleotides similarity analysis with the GenBank database. The bacterial phylum that was more evident in the two types de soil were Acidobacteria and Proteobacteria. In the soi! SFN the bacteria of the phylum Bacteroidetes were evident and in the soil SRE high frequency of the Actinobacteria bacteria was observed. Phylogenetic analyses reveled an extensive diversity in both soils, verified through diversity index differences in the bacterial communities in both areas, and that the area under eucalypt presented more diversity in relation to the area of Native Forest. / Orientadora: Lúcia Maria Carareto Alves / Coorientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Janete Apparecida Desiderio Sena / Banca: Uderlei Doniseti Silveira Covissi / Mestre