Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-18T19:16:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Janiffe P. Oliveira.pdf: 3897493 bytes, checksum: e8c1c8593647f30604371255062ad2cb (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-18T19:16:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Janiffe P. Oliveira.pdf: 3897493 bytes, checksum: e8c1c8593647f30604371255062ad2cb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T19:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Janiffe P. Oliveira.pdf: 3897493 bytes, checksum: e8c1c8593647f30604371255062ad2cb (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this work was to determine morpho-physiological parameters and to determinate the genomic stability of banana plants produced in Temporary Immersion Bioreactor (TIB), besides analyzing the agronomic behavior of the multiplied plant in the field. Therefore, the work was organized in three chapters, as follows: 1- Maintenance, multiplication and acclimatization of banana plants produced in different in vitro cultivation systems; 2- Organogenic behavior and morpho-anatomical characterization of banana plants multiplied in Semi-Solid (SS) and Temporary Immersion Bioreactor (TIB) systems, and; 3 – Cytometric evaluation, morphological and field production of banana plants from plantlets produced in TIB. Initially, banana genotypes were evaluated in vitro under minimal growth conditions, where concentrations of culture medium full and half‐strength MS medium) and two temperatures (20 e 25 °C) were tested. After seven months, the material was evalued and the shoots multiplied in different culture systems, acclimatized. For the multiplication, two systems were evaluated and after, the plants were rooted, then, the plants were acclimatized and evaluated for survival and growthIn all conditions, the plants were evaluated anatomically to better characterize the effects of different treatments and environments on plant development. Finally, at the end of the in vitro propagation process, the plants from TIB were established in the field and evaluated with conventionally produced plants (clump division) during two production cycles. In parallel determinations of nuclear DNA content of the plants were also performed by flow cytometry, , with views to detect possible somaclonal variations of the. It was found that the best maintenance condition of the shoots under in vitro conditions was in full strength MS medium at 20 ºC. After the storage period, the multiplication rates reached values between 1.1 and 2.5 shoots per explant. When SS and TIB systems were compared, It was observed that plants produced in TIB presented higher growth, but, lower multiplication rates than those of the SS system. In general, the in vitro rooting was 100% for both culture systems, and the plant survival in greenhouse reached levels above 70%, with differences between cultivation systems. Morpho-anatomically few differences were observed between plants from TIB or SS systems,, although during acclimatization, increments in the epicuticular wax layer, stomatal density, epidermal thickness and hypodermis in the adaxial face, besides differences between the parenchyma tissues had been characteristic for the plants from both culture systems. Finally, when the plants produced in TIB were evaluated in field, it was found that they presented agronomic behavior similar to those conventionally propagated , without significant changes in nuclear DNA content, neither visual morphological abnormalities that could characterize some type of somaclonal variation. With this work it is possible to conclude that: i) banana plants can be maintained under in vitro minimal growth conditions, before being used for propagating purposes; ii) The TIB provide lower multiplication rates than SS system, althought it can be recommended to be used to lengthen or promote the rooting of shoots in cultivation; iii) Plants produced in TIB present morpho-anatomical characteristics similar to the ones produced in SS system, and; iv) Under field conditions, plantlets produced from TIB have similar agronomic performance to those produzed byconvencional propagation. / Este trabalho teve por objetivo determinar parâmetros morfo-fisiológicos e avaliar a estabilidade genômica de plantas de bananeiras produzidas em Biorreator de Imersão Temporária (BIT), além de analisar o comportamento agronômico em campo dos genótipos multiplicados. Para tanto, o trabalho foi dividido em três capítulos, como segue: 1- Manutenção, multiplicação e aclimatização de bananeiras produzidas em diferentes sistemas de cultivo in vitro; 2- Comportamento organogênico e caracterização morfo-anatômica de plantas de bananeiras multiplicadas em sistema Semi-Sólido (SS) e Biorreator de Imersão Temporária (BIT) e; 3 – Avaliação citométrica, morfológica e de produção em campo de bananeiras produzidas em Biorreator de Imersão Temporária. Inicialmente genótipos de bananeira foram avaliados quanto a capacidade de serem mantidos in vitro sob condições de crescimento mínimo, onde concentrações do meio de cultura (MS pleno e ½ MS) e duas temperaturas da câmara de crescimento (20 e 25 °C) foram testadas. Após sete meses, o material foi avaliado e as brotações multiplicadas em diferentes sistemas de cultivo, aclimatizadas e levadas para plantio e monitoramento em campo. Para a etapa de multiplicação, dois sistemas foram testados. Após replicadas e determinadas as taxas de multiplicação as plantas foram então enraizadas, sendo determinados seus padrões de crescimento e desenvolvimento. Uma vez avaliadas, as plantas foram aclimatizadas e avaliadas quanto ao crescimento e sobrevivência. Em todas as condições, as plantas também foram avaliadas anatomicamente por microscopia de luz e de varredura para melhor caracterizar os efeitos dos diferentes tratamentos e ambientes sobre o desenvolvimento das plantas. Por fim, ao final de todo o processo de propagação in vitro, as plantas do sistema BIT foram plantadas em campo e avaliadas durante dois ciclos de produção, quanto ao seu comportamento morfo-agronômico, com plantas produzidas convencionalmente (divisão de touceiras). Paralelamente a este experimento, também foram realizadas quantificações no conteúdo do DNA nuclear das plantas, por meio de análises por citometria de fluxo, além de avaliações visuais, com vistas a detectar possíveis alterações somaclonais nas plantas em estudos. De maneira geral, verificou-se que a melhor condição de manutenção das plantas foi quando estas foram mantidas sob meio de cultura de MS à 20ºC. Sob multiplicação, após o período de conservação, obtiveram-se taxas de multiplicação do material entre 1,1 e 2,5 brotos/explante, sendo que quando os sistemas SS e BIT foram comparados, verificaram-se que as plantas em BIT apresentam maior crescimento, mas menores taxas de multiplicação do que àquelas do sistema SS. De maneira geral, o índice de enraizamento in vitro das plantas foi de 100%, em ambos os sistemas de cultivo e a sobrevivência das plantas em casa de vegetação alcançou índices superiores a 70%, com diferenças quanto ao sistema de cultivo utilizado. Morfo-anatomicamente observaram-se poucas diferenças das plantas quando estas foram avaliadas nos diferentes sistemas de cultivo, embora durante a aclimatização, incrementos na camada de cêra epicuticular, densidade estomática, espessura da epiderme e hipoderme na face adaxial, além de diferenças entre os tecidos parenquimáticos tenham sido característicos para as plantas originadas em ambos os sistemas de cultivo (SS e BIT). Por fim, quando as plantas produzidas em sistema BIT foram avaliadas em campo, verificou-se que, de modo geral, estas apresentaram comportamento agronômico semelhante àquelas propagadas convencionalmente, sem variações significativas no conteúdo de DNA nuclear, nem anomalias morfológicas visuais que pudessem caracterizar algum tipo de variação somaclonal nas plantas. Conclui-se com este trabalho que: i) genótipos de bananeiras podem ser mantidos in vitro em condições de crescimento mínimo, antes de serem utilizados para fins de propagação; ii) O sistema de cultivo BIT proporciona menores taxas de multiplicação do que sistemas SS e são mais indicados para serem utilizados durante as fases de alongamento/enraizamento de plantas de bananeira in vitro; iii) Plantas produzidas em sistema BIT apresentam características morfo-anatômicas semelhantes àquelas produzidas em sistemas SS, e; iv) Em condições de campo, o uso de plantas produzidas em sistema BIT apresentam comportamento semelhantes à plantas produzidas convencionalmente, incluindo aspectos relacionados à produção e produtividade.

Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-16T15:50:30Z No. of bitstreams: 1 Gemima Manco de Melo.pdf: 1128164 bytes, checksum: 2e667a493ac00163fb5ae1d774736709 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-16T15:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gemima Manco de Melo.pdf: 1128164 bytes, checksum: 2e667a493ac00163fb5ae1d774736709 (MD5) Previous issue date: 2011-02-16 / The sugarcane culture has great importance in the socio-economic development of Brazil, being one of the earliest economic activities in the country's history. The proliferation of commercial varieties of sugarcane has been successfully accomplished by applying techniques of tissue culture, as an example the system of temporary immersion bioreactor (TIB). In this system the plant material is immersed in liquid medium for controlled intervals of time, which favors the absorption of nutrients from the culture medium by stimulating the production of seedlings. During the in vitro culture the plant material is submitted to unusual environmental conditions that can cause physiological morphological, biochemical and molecular imbalances. Such imbalances can lead to large losses in the production of biofactories, as well as in research institutions. Therefore, the evaluation both biochemical and molecular in vitro plants has great importance for the production of seedlings genetically faithful to matrix plant. In order to assess the causes of physiological disorder observed in sugarcane RB872552 variety which caused the uncontrolled growth of small buds, forming a cluster of shoots known a "green mass" were performed biochemical and molecular analysis. The "masses" green "and the plants were collected by the TIB and subcultured in flasks containing MS liquid medium supplemented or not with 1.5 mg L-1 6-benzylaminopurine (BAP), following the conventional micropropagation of sugarcane. The activity of catalase and peroxidase was higher in samples of "green mass” cultured on TIB. The ascorbate peroxidase activity was higher in the "green masses cultured in the presence of BAP in the two micropropagation systems. The ascorbate peroxidase activity was higher in the "green masses” grow in the presence of BAP in the two micropropagation systems. The DNA fragments obtained after amplification of the whole plant material analyzed showed monomorphism, suggesting genetic fidelity of cloned material. The profile of enzymatic antioxidative system associated with the molecular analysis showed that the physiological disorder that resulted in the emergence of "green masses" was not caused by genetic variation but a result of stress conditions to which the material was submitted during cultivation in vitro. / A cultura da cana-de-açúcar destaca-se por apresentar grande importância no desenvolvimento sócio-econômico do Brasil, sendo uma das primeiras atividades econômicas da história do país. A multiplicação comercial de variedades de cana-de-açúcar tem sido realizada com sucesso mediante a aplicação de técnicas de cultura de tecidos, como exemplo o sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). Nesse sistema o material vegetal fica imerso em meio líquido por intervalos controlados de tempo, o qual favorece a absorção dos nutrientes do meio de cultura estimulando a produção das mudas. Da introdução in vitro até a aclimatização, o material vegetal é submetido a condições ambientais incomuns que podem provocar desajustes fisiológicos, morfológicos, bioquímicos ou moleculares. Tais desajustes podem gerar grandes perdas na produção de biofábricas, como também em instituições de pesquisa. Sendo assim, a avaliação tanto a nível bioquímico quanto molecular de plantas cultivadas in vitro apresenta grande importância para produção de mudas geneticamente fiéis a planta matriz. Com o objetivo de avaliar a causa da desordem fisiológica observada na variedade RB872552 de cana-de-açúcar que provocou o crescimento desordenado de pequenas brotações, formando um aglomerado de brotos conhecido como “massa verde”, foram realizadas análises bioquímica e molecular. As “massas verdes” e as plantas coletadas dos BITs foram subcultivadas em frascos contendo meio MS líquido suplementado ou não com 1,5 mg L-1 de 6-benzilaminopurina (BAP), seguindo o sistema convencional de micropropagação de cana-de-açúcar. A atividade da catalase e da peroxidase foi mais elevada nas amostras de “massa verde” cultivadas em BIT. A atividade da peroxidase do ascorbato foi maior nas “massas verdes” cultivadas na presença de BAP nos dois sistemas de micropropagação. Os fragmentos de DNA obtidos ápos a amplificação de todo o material vegetal analisado apresentou monomorfismo, sugerindo fidelidade genética do material clonado. O perfil enzimático do sistema antioxidativo associado à análise molecular evidenciam que a desordem fisiológica que resultou no surgimento das “massas verdes”, não foi provocada por variação genética e sim resultado das condições de estresse ao qual o material foi submetido durante o cultivo in vitro.

Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants