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Ramnolipídeos (RLs) e polihidroxialcanoatos (PHAs) produzidos por Pseudomonas aeruginosa são compostos biodegradáveis e que podem ser obtidos a partir de matérias-primas renováveis. Com o objetivo de elucidar aspectos metabólicos e regulatórios da produção de RLs e PHAs, mutantes de P. aeruginosa LFM634 afetados na síntese desses compostos foram obtidos utilizando um transposon (ISlacZ/hah). Dentre 61 mutantes caracterizados, foram detectados vários super-produtores de RLs e/ou PHAs, bem como alguns nos quais nenhum RL foi detectado. Dois mutantes (p09-13 e p12-39) apresentaram capacidade reduzida de inserir ramnose em RLs e de direcionar intermediários da biossíntese de ácidos graxos para a síntese de RLs ou PHAs. O mutante p09-13 está afetado no gene crc, sugerindo um importante papel deste regulador global no processo de síntese de RLs e PHAs. / Rhamnolipids (RLs) and polyhydroxyalkanoates (PHAs) produced by Pseudomonas aeruginosa are biodegradable compounds and can be obtained from renewable raw materials. Aiming to elucidate metabolic and regulatory issues involved in the RLs and PHAs production, P. aeruginosa LFM634 mutants affected in their biosynthesis were obtained using a transposon (ISlacZ/hah). Out of 61mutants characterized, it was detected several overproducing RLs and/or PHA, as well as some in which no RLs was detected. Two mutants (p09-13 and p12-39) presented reduced capability of inserting rhamnose in RLs and of channeling intermediates from fatty acid biosynthesis to the synthesis of RLs and PHAs. The mutant p09-13 is affected on crc gene, suggesting an important role of this global regulator on the process of RLs and PHA synthesis.

Thesis (Ph.D.)--Mississippi State University. Dave C. Swalm School of Chemical Engineering. / Title from title screen. Includes bibliographical references.

Breve / Breve

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os biossurfactantes constituem uma classe de compostos obtidos por via microbiana com estrutura molecular anfifílica, responsáveis pela redução de tensão superficial e interfacial, com ampla aplicação no setor industrial alimentício, farmacêutico, cosmético, na biorremediação e na recuperação de petróleo. A busca de alternativas para o uso de resíduos torna a produção de biossurfactante mais competitiva e viável, minimizando os custos de produção e consequentemente os impactos no ambiente. Nesse contexto, estudos foram realizados com fungo isolado de solo da caatinga (Pernambuco, Brasil). O fungo foi identificado como Cunninghamella echinulata, sendo em seguido avaliado seu potencial biotecnológico na produção de biossurfactante. Realizou-se crescimento em meio utilizando resíduos agroindustriais de baixo custo, milhocina (M) e óleo residual de soja (ORS) como substratos, empregando um planejamentyo fatorial competo de 22, tendo como variável resposta a produção de biossurfactante, a qual foi avaliada pela redução da tensão superficial e do índice emulsificação. Os resultados indicaram uma redução da tensão da água de 72 para 36mN/m e índice de emulsão de 80% para o óleo queimado de motor. Os testes de estabilidade com o líquido metabólico livre de células frente diferentes temperaturas, concentrações de NaCl e pH tanto para tensão superficial, como para o índice de emulsificação. O biossurfactante apresentou carga iônica, constituição química polimérica com lipídeos (40%), carboidratos (35,2%) e proteínas (20,3%). E ainda apresentou propriedade como agente de dispersão de óleos e no aumento e ou redução da viscosidade. Os resultados promissores com o fungo C. echinulata na produção do biossurfactantes/emulsificante sugerem o seu emprego, no futuro, em processos de biorremediação, na redução da concentração dos componentes do petróleo, na limpeza de tanques, no derramamento de petróleo, como também em outras aplicações industriais. / The biosurfactants are a class of compounds obtained by microbial way with amphiphilic molecular structure, responsible for the reduction of surface and interfacial tension, with wide application in the food industry, pharmaceutical, cosmetic, in bioremediation and oil recovery. The search for alternatives to the use of waste makes the production of more viable and competitive biosurfactant minimizing production costs and hence the impact on the environment. In this context, studies were performed with fungus isolated from Caatinga soil (Pernambuco, Brazil). The fungus was identified as Cunninghamella echinulata, being evaluated in a row biotechnological potential biosurfactant production. The growth medium was used agro-industrial residues, corn steep liquor (M) and soybean oil waste (ORS) as substrates, employing a complete planning design of 22 with the variable response biosurfactant production which was evaluated by reduction of the surface tension and emulsification index. The results indicated a reduction of water surface tension of 72 to 36mN/m, and emulsification index of 80% for the engine burning oil. Stability tests with cell-free metabolic liquid against different temperatures, pH and NaCl concentrations for surface tension, as well as the emulsification index. The biosurfactant showed ionic charge, polymeric chemical composition constituted by lipids (40%), carbohydrates (35.2%) and proteins (20.3%), and presented property as ability to oil displacement area and increased or decreased the viscosity. The promising results obtained with the fungus C. echinulata in the of biosurfactant/emulsifier production suggest in future perspectives to use in bioremediation processes, reducing the concentration of the components of petroleum, cleaning tanks, the oil spill, as well as in other industrial applications.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Um dos grandes desafios na produção biotecnológica é a produção de insumos de alto valor agregado a um baixo custo. Neste contexto, o fungo filamentoso Cunninghamella elegans apresenta em sua parede celular grandes quantidades de quitina e quitosana, como também é capaz de produzir biossurfactantes. A quitina e quitosana apresentam um vasto campo de aplicações biotecnológicas, e na biorremediação vem sendo utilizado na remoção e recuperação de diferentes resíduos, biotransformação de poluentes e descoloração de efluente têxtil. Estes biopolímeros possuem estruturas lineares, com unidades monoméricas β-1,4-N-acetil-D-glicosamina e β-1,4-D-glicosamina, respectivamente. Por outro lado, os biossurfactantes são compostos sintetizados por micro-organismos, apresentando propriedades como a redução da tensão superficial e interfacial, emulsificação, solubilização e dispersão de fases, sendo muito aplicado na indústria petroquímica. Estudos com Cunninghamella elegans UCP/WFCC 0542 foram realizados com objetivo de avaliar o seu potencial biotecnológico para a produção de quitina, quitosana e biossurfactante com a utilização de resíduos agroindustriais (milhocina e óleo de soja pós-fritura), através de um delineamento central composto rotacional de 2. Os biopolímeros quitina e quitosana foram obtidos através de tratamento álcali-ácido, com hidróxido de sódio 1M, e posterior emprego de ácido acético a 2%. As propriedades tensoativas do biossurfactante foram avaliadas pela determinação da tensão superficial do líquido metabólico livre de células. A produção de biomassa por C. elegans foi de 8,12 g/L de com rendimentos de 0,095 mg/g de quitina e 0,036 mg/g de quitosana, com um grau de desacetilação de 87,44%, na condição proposta. O biossurfactante obtido na condição 8 do planejamento com 2,15% de milhocina e 5,22% de óleo de soja pós-fritura demonstrou a melhor tensão superficial com 28,20 mN/m-1 e apresentou estabilidade frente a diferentes condições ambientais, possuindo caráter aniônico e sua composição bioquímica preliminar sugere que o biossurfactante isolado seja constituído por proteínas e lipídeos. Também este se mostrou eficiente na remoção de compostos hidrofóbicos derivados do petróleo, com remoção de 55,15% de óleo de motor, 71,42% de petróleo bruto, 77,46% de querosene e 96,41% de óleo diesel em areia de praia. Testes de toxicidade do biossurfactante com sementes de Brassica oleracea provaram seu caráter atóxico. Os resultados obtidos demonstram o potencial biotecnológico de C. elegans a partir substratos agroindustriais alternativos e de baixo custo, possibilitando o seu emprego em processo de biorremediação na recuperação ambiental. / One of the biggest challenges in biotechnological production is to produce high value-added products at a low cost. In this context, the filamentous fungus Cunninghamella elegans presents in its cell wall large amounts of chitin and chitosan, but is also able to produce biosurfactants. Chitin and chitosan has a vast field of biotechnological applications, and the bioremediation has been used in the removal and recovery of different waste, pollutant biotransformation and textile effluent discoloration. These biopolymers have linear structures with monomeric units β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine and β-1,4-D-glucosamine, respectively. Furthermore, the surfactants are compounds synthesized by micro-organisms having properties such as reducing surface and interfacial tension, emulsification, solubilization and dispersion phases, being widely applied in the petrochemical industry. Studies with C. elegans UCP/WFCC 0542 were performed in order to evaluate their biotechnological potential for the production of chitin, chitosan and biosurfactant with the use of agroindustrial residues (corn steep liquor and soybean oil waste), using a central composite design rotational 2. The biopolymers chitin and chitosan were obtained by alkali-acid treatment with 1M sodium hydroxide, and subsequent use of 2% acetic acid. The surface-active properties of the biosurfactant were evaluated by measuring the surface tension of the metabolic liquid cell-free. Biomass production by C. elegans was 8.12 g/L with yields of 0.095 mg/g chitin and 0.036 mg/g of chitosan with a deacetylation degree of 87.44% in the proposed condition. The biosurfactant obtained in condition 8 of planning with 2.15% of corn steep liquor and 5.22% soybean oil waste has demonstrated the best surface tension with 28.20 mN/m-1 and showed stability against to different environmental conditions, having anionic character and its preliminary biochemical composition suggests that the isolated biosurfactant consists of proteins and lipids. Also this proved effective in the removal of petroleum derivatives hydrophobic compounds, removing 55.15% of motor oil, 71.42% of crude petroleum, 77.46% of kerosene and 96.41% of diesel oil in sand beach. Biosurfactant toxicity tests with Brassica oleracea seeds proved their non-toxic nature. The results show the biotechnological potential of C. elegans from alternative and low cost agroindustrial substrates, allowing its use in bioremediation process in environmental recovery.

Derramamentos de petróleo e derivados, como querosene e diesel, em água do mar são motivos de preocupação mundial devido aos sérios efeitos causados ao meio ambiente marinho e costeiro. A taxa de biodegradação de hidrocarbonetos em água do mar é afetada por inúmeros parâmetros físico-químicos e biológicos, incluindo o número e a diversidade de micro-organismos endógenos, as condições para a atividade de degradação microbiana (presença de nutrientes, oxigênio favorável e condições de pH e temperatura), a quantidade, a qualidade e a biodisponibilidade dos contaminantes e características da água do mar. Neste trabalho, dois planejamentos fatoriais completos 24 foram realizados para analisar a influencia do pH (6; 10 e 14) e das concentrações de querosene e nutrientes (sulfato de amônio e fosfato monobásico de potássio) sobre degradação de querosene e produção de bioemulsificantes/biossurfactantes por Candida lipolytica UCP 0988 em água do mar. A água do mar usada nos ensaios foi coletada em praia próxima ao Porto de Suape, Pernambuco, Brasil. Os ensaios de biodegradação foram realizados à temperatura de 28C, em um agitador rotatório a 200rpm, durante 5 dias. A levedura C. lipolytica UCP 0988 foi capaz de utilizar querosene (10%, 20% ou 30% v/v) e crescer em água do mar, suplementada com sulfato de amônio e fosfato monobásico de potássio, produzindo biossurfactantes com altas atividades de emulsificação. A fitotoxicidade de amostras biodegradadas coletadas com 5 dias foi avaliada usando técnicas de germinação e crescimento radicular de feijões-macáçar (Vigna ungiculata (L.) WALP.) / Spills of oil and oil products, such as kerosene and diesel in seawater are cause for concern worldwide due to serious effects caused to the marine and coastal environment. The rate of biodegradation of hydrocarbons in sea water is affected by many physical, chemical and biological parameters, including the number and diversity of endogenous microorganism, the conditions for microbial degradation activity (presence of nutrients, oxygen and favorable conditions pH and temperature), the quantity, quality and bioavailability of contaminants and characteristics of sea water. In this work, two 24 full factorial designs were carried out to analyze the influence of pH (6, 10 and 14) and concentrations of kerosene and nutrients (ammonium sulfate and potassium phosphate monobasic) on degradation of kerosene and production bioemulsifiers/biosurfactants by Candida lipolytica UCP 0988 in seawater. The seawater used in the tests was collected near the beach in Suape Harbor, Pernambuco, Brazil. The biodegradation tests were performed at the temperature of 28 C, on a rotatory shaker at 200 rpm, for 5 days. The yeast C. lipolytica UCP 0988 was able to use kerosene (10%, 20% or 30% v / v) and grows in seawater, supplemented with ammonium sulfate and potassium phosphate monobasic, producing biosurfactants with high emulsification activity. The phytotoxicity of biodegradated samples collected with 5 days was evaluated using seed germination and root elongation techniques with Makassar beans (Vigna ungiculata (L.) Walp.).

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Biossurfactantes são moléculas anfipáticas de origem microbiana que apresentam atividade em diferentes tipos de superfícies, elevada biodegradabilidade, baixa toxicidade, sendo produzidos a partir de fontes renováveis, e apresentando aplicações sob condições extremas de pH e temperatura. Os micro-organismos oleaginosos apresentam como principal característica a habilidade de acumular lipídeos acima de 20% do seu peso seco, sendo quimicamente descritos como triacilgliceróis, apresentando uma constituição comparável aos óleos vegetais e animais, sendo sua composição química semelhante ao biodiesel. Ensaios foram realizados visando à produção simultânea de biossurfactante e lipídeos por Penicillium spinulosum UCP1347, utilizando como substratos milhocina (5%) e óleo de soja pós-fritura (3%), aplicando um planejamento experimental do tipo Delineamento Composto Central Rotacional DCCR 22. A fermentação foi realizada em frascos de Erlenmyers contendo 100mL do meio de acordo com o DCCR, 5% de inóculo da suspensão de 107 esporos/mL, incubados à temperatura de 280C, agitação orbital de 150rpm e 96h. Ao final da fermentação, o líquido metabólico livre de células apresentou a produção de um biossurfactante que reduziu a tensão superficial da água de 72 para 32,7 mN/m, tensão interfacial de 1,7 mN/m, CMC de 1,25%(p/v), atividade de emulsificação de 3,73 UEA/mL utilizando óleo de soja pós-fritura, como também estabilidade frente a variações de pH, temperatura e salinidade. O biossurfactante de caráter aniônico apresentou uma composição polimérica (39,56% de carboidratos, 33,78% de lipídeos e 10,4% de proteínas). No mesmo ensaio (pontos centrais) foi observado uma biomassa com acumulação de 57% de lipídeos, em relação ao peso seco, com uma composição química de ácidos graxos insaturados (ácido palmitoléico, oléico e linoléico) e saturados (ácido palmítico e esteárico). Os resultados obtidos demonstram que o P. spinulosum é um fungo filamentoso oleaginoso, promissor, com elevado potencial biotecnológico na produção de biossurfactante e lipídeos de constituição comparável ao biodiesel, além da habilidade de utilizar como fontes alternativas e renováveis os resíduos agroindustriais, reduzindo o custo de produção de ambos os produtos. / Surfactants are amphipathic molecules of microbial origin that exhibit activity on different types of surfaces, have high biodegradability, low toxicity, can be produced from renewable sources and have funcionality under extreme conditions of pH and temperature. Oleaginous microorganisms present as main characteristic the ability to accumulate lipids over 20% of its dry weight, represented in the form of triacylglycerol, a constitution comparable to vegetable and animal oils, and their chemical composition similar to biodiesel. Assays were carried out for the simultaneous production of lipids and biosurfactant by Penicillium spinulosum UCP1347 using as substrates corn steep liquor (5%) and post-frying soybean oil (3%), using an Experimental Design - Central Composite Design CCD 22. The fermentation was performed in Erlenmyers flaks containing 100 mL of medium, in according to the CCD, 5% of the suspension inoculum of 107 spores/mL, incubated at temperature of 28C, orbital shaking of 150 rpm and 96 hours. At the end of fermentation, the cell free broth showed the production of a biosurfactant, which reduced the water surface tension from 72 to 32.7 mN/m, interfacial tension of 1.7 mN/m, CMC 1.25% (w/v), emulsifying activity 3.73 UEA /mL using post-frying soybean oil, as well as stability against pH, temperature and salinity. The anionic character of biosurfactant showed a polymeric composition (39.56% carbohydrates, 33.78% lipids and 10.4% protein). In the same assay (central points) was observed accumulation of a biomass with 57% of lipids in the dry weight, with a chemical composition of unsaturated fatty acids (palmitoleic, oleic and linoleic acids) and saturated (palmitic and stearic acids). The results show that P. spinulosum is an oleaginous filamentous fungus, promising with high biotechnological potential in the production of biosurfactant and lipids to the biodiesel formation and the ability to use agro-industrial waste as alternative and renewable sources, reducing the production costs of both products.

Orientador: Crispin Humberto Garcia Cruz / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Banca: Márcia Nitschke / Resumo: Surfactantes são compostos anfipáticos, que reduzem a tensão interfacial e superficial, além disso, possuem capacidade de detergência, emulsificação, espumante, molhante, de solubilização e dispersão de substâncias. Os biossurfactantes, surfactantes biológicos derivados do metabolismo secundário de microrganismos, são amplamente utilizados na biorremediação e nas indústrias petrolíferas, de alimentos e de produtos de limpeza. Esses compostos podem ser produzidos por fermentação semi-sólida, a qual pode aproveitar resíduos agroindustriais como substrato para o crescimento microbiano. Os objetivos desse trabalho foram produzir biossurfactante utilizando os fungos Aspergillus ochraceus e Penicillium expansum por fermentação semi-sólida usando bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo como substratos; avaliar a influência destes substratos; avaliar a influência da concentração de sacarose, glicose, óleo diesel e óleo residual de fritura no crescimento microbiano e o potencial de biorremediação dos biossurfactantes produzidos, assim como dos fungos utilizados. Os microrganismos foram propagados em tubos de ensaio inclinados incubados a 25oC em meio PDA. Posteriormente os esporos foram suspensos em solução nutriente e incubados em frascos de Erlenmeyer contendo cinco gramas do substrato a ser utilizado, bagaço de cana-de-açúcar ou farelo de trigo, 30 mL da solução nutriente contendo os esporos (1,7 x 107 esporos/mL) e uma fonte de carbono adicional testada: sacarose, glicose, óleo diesel e óleo residual de fritura. Os experimentos foram realizados a 25oC e tempo de fermentação de 72, 120 e 168h. A presença do biossurfactante no caldo de fermentação foi determinada pela medida da tensão superficial, do índice de emulsificação, da concentração micelar... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Surfactants are amphiphilic compounds that reduce the interfacial and surface tension; also they have capacity of detergency, emulsifying, wettability, of solubilization and dispersation of substances. The biosurfactants, biologic surfactants derivated from secundary metabolism of microorganism, are widely used in the bioremediation and in the petroleum, food and cleaning industries. These compounds can be produced under solid-state fermentation, which can use agro-industrial wastes as substrates for the microbial growth. The purposes of this study were produce biosurfactants using the fungi Aspergillus ochraceus and Penicillium expansum by solid-state fermentation using sugarcane bagasse and wheat bran as substrates; evaluate the influence of these substrates; evaluate the influence of sucrose, glucose, diesel oil and residual frying oil in the microbial growth and the biosurfactants bioremediation potencial, and microorganisms bioremediation potencial. First, for the inoculum preparation, the microorganisms were propagated in the inclined Erlenmeyers flasks containing PDA and kept at 25°C. After that, the spores were suspended in nutrient solution and incubated in Erlenmeyers flasks containing five grams of the substrate, sugarcane bagasse or wheat bran, 30 mL of nutrient solution containing the spores (1,7 x 107 spores/mL) and an additional carbon source tested: sucrose, glucose, diesel oil and frying oil. The experiments were realized in 25°C and 72, 120 and 168 hours. The presence of the biosurfactant in the fermentation broth was determinated by the surface tension, the emulsification index and the critical micelle concentration. The microorganisms Aspergillus ochraceus e Penicillium expansum showed a high potentiality for biosurfactant production using sugarcane bagasse... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarcioSB_TESE.pdf: 2488710 bytes, checksum: a89cb34af4b96bdd59b8b2051a8431f1 (MD5) Previous issue date: 2012-06-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / This study evaluates the biosurfactants production from cassava wastewater, an agro industrial residue, to be used as carbon source. Using a factorial design 24-1 (half fraction), 10 tests were performed using Pseudomonas aeruginosa AP029/GVII-A in submerged batch cultivation in rotating incubator (shaker). The influence of factors (temperature, agitation, aeration ratio and concentration of cultivation medium) at two different levels for the synthesis of the biosurfactant. Samples were collected throughout the cultivation by 132 hours of fermentation were completed. The best outcome was intended by following production through substrate consumption, dry matter, reduction of surface tension (ring method) and emulsification index. The kinetics of microorganism was assessed for the carbon source used. The results showed that the cassava wastewater is a well assimilable substrate for the production of biotensoactive, reaching 91 % of consumption by the micro-organism under study. The growth temperature was found to be one of the leading factors in the synthesis of the metabolite, followed by aeration and also due to the agitation. The best results showed a 30 % reduction in surface tension (% RTS) for the environment, reaching values of 30 mN/m; 3.0 g /L of biomass and emulsifying index greater than 65 %. The metabolite synthesized still remained stable for different salt concentrations (1, 5 and 10 % w/ v) and alkaline pH (8-10). / O presente trabalho avalia a produ??o de biossurfactantes a partir de manipueira, um res?duo agroindustrial a ser utilizado como fonte de carbono. Empregando um planejamento fatorial 24-1 (fra??o meia), 10 ensaios foram realizados utilizando Pseudomonas aeruginosa AP029-GVIIA em cultivo descont?nuo submerso em incubador rotat?rio (shaker). Foi analisada a influ?ncia dos fatores (temperatura, agita??o, raz?o de aera??o e concentra??o do substrato) em dois diferentes n?veis para a s?ntese do biossurfactante. Amostras foram coletadas em intervalos regulares durante o cultivo at? 132 horas de fermenta??o. Buscou-se o melhor resultado acompanhando a produ??o atrav?s do consumo de substrato, massa seca, redu??o da tens?o superficial (m?todo do anel) e ?ndice de emulsifica??o. O comportamento cin?tico do micro-organismo foi avaliado para a fonte de carbono utilizada. Os resultados mostraram que a manipueira ? bastante assimil?vel e potencial substrato na produ??o do biotensoativo, onde se observou 91% de consumo pelo micro-organismo em estudo. A temperatura de cultivo revelou ser um dos fatores preponderantes na s?ntese do metab?lito, acompanhada pela raz?o de aera??o e agita??o. Os melhores resultados mostraram redu??o de 30% da tens?o superficial (%RTS) em rela??o ao meio inicial, alcan?ando valores de 31 mN/m; 3,0 g/L de biomassa e ?ndice de emulsifica??o superior a 65%. O metab?lito sintetizado ainda se mostrou est?vel para diferentes concentra??es salinas (1, 5 e 10% m/v) e pH alcalino (8-10).