El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, β−aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmovilizados por técnicas de formación de enlaces covalentes (en el caso de enzimas) y por atrapamiento (tanto para enzimas como para células). Se establecieron dos métodos enzimáticos para la síntesis del aminoácido aromático esencial L-fenilalanina (Phe). El primer método de síntesis se realizó usando como biocatalizador L-aspartato transaminasa (AAT) de corazón porcino inmovilizado. Se optimizaron los métodos de inmovilización de AAT en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados resultantes se emplearon en la síntesis de Phe. La inmovilización en Eupergit® C y LentiKats® permitió mejorar la estabilidad del enzima AAT, así como alcanzar rendimientos de reacción de síntesis de Phe superiores al 70%. Además se estableció un método de síntesis multienzimática “one-pot”, para lo que se acoplaron las reacciones catalizadas por los enzimas aspartasa (AspB) y transaminasa (AT). Se determinó la compatibilidad de los enzimas en las condiciones de reacción (pH 7,5 y 37°C) y se establecieron las concentraciones óptimas de los sustratos (0,15 M de fumarato, 0,3 M de NH4Cl y 0,1 M de fenilpiruvato) y de los enzimas (0,3 U de AspB/mL y 2 U de AT/mL). En estas condiciones, se alcanzó un rendimiento global de reacción de 80%. Para la síntesis de L-aspartato (Asp) se utilizó el enzima L-aspartato amonio liasa o aspartasa (AspB) de Bacillus sp. YM55-1 parcialmente purificado. El enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados se emplearon en la síntesis de altas concentraciones de Asp (≥ 60 g/L). Además, el enzima inmovilizado se reutilizó eficientemente en la síntesis del aminoácido, manteniendo alrededor del 90% de su actividad inicial al cabo de 5 ciclos de reacción en todos los casos. La síntesis de las aminas aromáticas 1-feniletilamina (FEA) y 3-amino-1-fenilbutano (AFB) se llevó a cabo utilizando biocatalizadores (células y/o enzima parcialmente purificado) con actividad ω−transaminasa (ω−TA). Se estableció un método de permeabilización de las membranas de células ω−TA utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB). Las células ω−TA se inmovilizaron en el soporte LentiKats® con un 100% de retención de su actividad catalítica. El enzima ω−TA se inmovilizó en varios soportes, obteniéndose los mejores resultados en Eupergit® CM y LentiKats®. La inmovilización en LentiKats®, tanto de células (no permeabilizadas y permeabilizadas) como del enzima, permitió la reutilización de los catalizadores hasta en 5 y 10 ciclos de síntesis de AFB, manteniendo alrededor del 80 y 70% de la actividad inicial, respectivamente. Por último, se comprobó que el enzima aspartasa mutado (AspB-C6) a partir de AspB, cataliza la reacción de aminación regioselectiva del ácido crotónico para producir β−aminobutirato. Este enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C y MANA-agarosa según los métodos de inmovilización establecidos para el enzima AspB en los mismos soportes. Se obtuvieron rendimientos de inmovilización similares pero las actividades retenidas fueron significativamente inferiores para AspB-C6 que para AspB. / The objective of this thesis is to establish biocatalytic methods for the synthesis of the amino acids L-aspartate, L-phenylalanine and β−aminobutyrate, as well as the aromatic amines 1-phenylethylamine and 3-amine-1-phenylbutane, by using biocatalysts with transaminase and ammonia-lyase activity immobilized by covalent attachment techniques (for enzymes) and entrapment (for enzymes and cells). Two methods for the synthesis of the essential aromatic amino acid L-phenylalanine (Phe) were established. The first method was carried out by using L-aspartate transaminase (AAT) from porcine heart as biocatalyst. The immobilization of the enzyme AAT on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports was optimized, and the three immobilized enzymatic derivatives were used for the synthesis of Phe. AAT immobilized on Eupergit® C and LentiKats® allowed improving the stability of the enzyme as well as reaching reaction yields of Phe over 70%. Moreover, a multi-enzymatic one-pot method for the synthesis of Phe was established by coupling of two consecutive enzymatic reactions catalyzed by aspartase (AspB) and transaminase (AT). The compatibility of both enzymes under the reaction conditions (pH 7,5 and 37°C) was shown; and, the optimum concentration of substrates (0,15 M fumarate, 0,3 M NH4Cl and 0,1 M phenylpyruvate) and enzymes (0,3 U of AspB/mL and 2 U of AT/mL) were established. In these conditions, the global reaction yield was 80%. L-aspartate was synthesized by using the enzyme L-aspartate ammonia-lyase or aspartase (AspB) from Bacillus sp. YM55-1. The enzyme was immobilized on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports. The immobilized biocatalysts were used for the synthesis of highly concentrated Asp (≥ 60 g/L). Furthermore, the immobilized biocatalysts were efficiently reused in 5 cycles of Asp synthesis, maintaining over 90% of activity and reaching over 90% of conversion in all the cases. The synthesis of the aromatic amine 3-amine-phenylbutane (APB) was carried out by means of cells with ω−transaminase (ω−TA) activity as well as the partially purified enzyme ω−TA. A permeabilization method of the cell membranes with cetrimonium bromide (CTAB) was performed. Cells were immobilized in LentiKats® with 100% retention of the catalytic activity. The enzyme ω−TA was immobilized on several supports, and the best results were obtained with Eupergit® CM and LentiKats® supports. The cells (non-permeabilized and permeabilized) and the enzyme immobilized in LentiKats®, allowed reusing the biocatalysts up to 5 and 10 cycles of synthesis of APB, maintaining around 80 and 70% of the initial activity respectively. Finally, it was shown that the mutated aspartase (AspB-C6) from AspB, catalyzes the regioselective amination of crotonic acid to yield β−aminobutyrate. This enzyme was immobilized on Eupergit® C and MANA-agarose supports, according to the immobilization methods established for AspB on the same supports. The immobilization yields were similar; however the retained activities were lower than those obtained for AspB.

A nivel país conviven diferentes sistemas productivos intensivos y extensivos con actividades agroindustriales que generan gran cantidad de residuos orgánicos (RO) de diferente origen, algunos de ellos de difícil manejo, los cuales podrían utilizarse como enmiendas orgánicas (EO). La aplicación eficiente de los RO depende de muchos factores que están interrelacionados, como sus propiedades intrínsecas y las propiedades del suelo donde se aplica. Por ello, la hipótesis general fue: ―la aplicación eficiente y ambientalmente segura de RO agroindustriales, requiere conocer las características particulares del producto a aplicar, las características del suelo y la dinámica de los cambios posteriores a la aplicación, así como los efectos sobre el desarrollo y la nutrición del trigo‖. El objetivo general fue estudiar diferentes RO agroindustriales generados en el sudoeste bonaerense, su factibilidad de reutilización y aplicación al suelo, y su posterior efecto sobre el desarrollo y nutrición del cultivo de trigo. Para ello, se caracterizaron 17 RO con diferente grado de biotransformación, para poder utilizarlos como EO. Se pudo comprobar que la combinación de análisis químicos y espectrométricos otorgan información relevante para entender el comportamiento de los RO al ser aplicados al suelo. La dinámica de las transformaciones de las fracciones orgánicas y la disponibilidad de macronutrientes depende de las características del RO, principalmente su relación C:N y del tipo de suelo, mayormente dado por su granulometría. Las biotransformaciones fueron útiles para modificar a nivel molecular la composición del RO y así aumentar su potencialidad de uso como EO. Se observaron resultados positivos para el cultivo de trigo ante la aplicación de RO más estables, identificados principalmente por una relación C:N menor a 38:1. Como otra alternativa de aprovechamiento, se posiciona la extracción de sustancias húmicas (SH) de los RO. Su aplicación foliar en trigo como bioestimulante mejoró la producción del cultivo en un año con estrés hídrico, donde la dosis tuvo mayor relevancia que la composición de las SH aplicadas. / In the country, different intensive and extensive production systems coexist with agro-industrial activities that generate a large amount of organic residues (OR) of different origin, some of them difficult to manage, which could be used as organic amendments (OA). The efficient application of OR depends on many factors that are interrelated, such as its intrinsic properties and the properties of the soil where it is applied. Therefore, the general hypothesis was: "the efficient and environmentally safe application of agro-industrial OR requires knowing the particular characteristics of the product to be applied, the characteristics of the soil and the dynamics of the changes after the application, as well as the effects on the development and nutrition of wheat. The general objective was to study different agroindustrial OR generated in the southwestern of Buenos Aires, its feasibility of reuse and application to the soil, and its subsequent effect on the development and nutrition of the wheat crop. For this, 17 OR with different degrees of biotransformations were characterized, in order to use them as OA. It was possible to verify that the combination of chemical and spectrometric analyzes provide relevant information to determine the behavior of OR when applied to the soil. The dynamics of the transformations of the organic fractions and the availability of macronutrients depend on the characteristics of the OR, mainly its C:N ratio and the type of soil, mainly given by its granulometry. Biotransformations were useful to modify the composition of OR at the molecular level and thus increase its potential for use as OA. Positive results were observed for the wheat crop when applying more stable OR, mainly identified by a C:N ratio of less than 38:1. As another use alternative, the extraction of humic substances (HS) from the OR is positioned. Its foliar application in wheat as a biostimulant improved crop production in a year with water stress, where the dose was more relevant than the composition of the HS applied.

El hongo comestible Agaricus blazei Murrill es reconocido y muy pretendido por sus propiedades medicinales, pero su cultivo aún no se desarrolló en Argentina. Para su cultivo se emplea la misma metodología que para el champiñón (Agaricus bisporus), obteniéndose rendimientos aún bajos y variables según las diferentes cepas, sustratos y manejo técnico. Este método, incluye la preparación de un compost mediante un proceso fermentativo bifásico, y tiene importantes desventajas: ciclo de producción prolongado, importante requerimiento de espacio y mano de obra, gran inversión inicial y potencial perjuicio ambiental. De modo que los objetivos del estudio realizado durante la ejecución de esta tesis, fueron: 1) Formular y optimizar medios de cultivo y sustratos compostados y no compostados, a base de cáscara de semilla de girasol (residuo local abundante), para la producción eficiente de A. blazei. 2) Determinar la posibilidad de reemplazar como material de cobertura del sustrato a la turba Sphagnum por vermicompost. 3) Determinar la degradación de los componentes de los materiales lignocelulósicos empleados en los distintos sustratos para el cultivo de estos hongos. 4) Evaluar el efecto de la incorporación separada de sales de Zn2+ y Cu2+ en el sustrato, cama de cobertura o en el agua de riego, sobre la productividad y su bioabsorción y biodisponibilidad por el hongo. 5) Evaluar la evolución de la actividad de lacasas en los sustratos con fórmulas diferentes en un ciclo de producción. 6) Determinar la efectividad del sustrato gastado remanente del cultivo de A. blazei en la degradación del herbicida metsulfurón metilo. Como principales resultados, se encontró ventajoso el uso de un medio nutritivo basado en caldo de compost, a un pH 6,5, por sobre el tradicional, a base de caldo de papa, para la conservación o propagación del micelio de A. blazei. Se confirmó la posibilidad de preparar compost para el cultivo exitoso de A. blazei utilizando como sistemas contenedores, durante el compostaje, a un tanque metálico de 200 L y tanques plásticos de 400 L ó 600 L. A su vez, se corroboró la posibilidad de emplear cáscara de girasol como parte fundamental en la fórmula del compostaje para la obtención del sustrato para el cultivo de A. blazei por el método tradicional, con rendimientos similares e incluso mejores a los informados. También, se observó que el vermicompost, empleado como cama de cobertura, tiene un efecto estimulador en la inducción de los carpóforos. Se demostró la posibilidad de cultivar A. blazei sobre sustratos sin compostar con rendimientos cercanos a los informados en sustratos compostados. De manera interesante, el sustrato gastado de hongo, además de mejorar los rendimientos en comparación al sustrato que contenía solo cáscara de girasol, produjo un efecto preventivo de la contaminación, tanto cuando se mezcló con cáscara de girasol sola como cuando se lo usó suplementado. Se observó que la mayor degradación de la materia orgánica del compost/sustrato ocurre durante el cultivo, un 50 % superior a la ocurrida durante el compostaje, y que los componentes lignocelulosos más utilizados durante el cultivo de A. blazei fueron la hemicelulosa y la lignina. Pudo verificarse una mayor degradación del sustrato en aquellos que tuvieron mayor productividad. Por otro lado, el agregado de 100 ó 200 ppm de Zn2+ durante la preparación de la cama de cobertura en un sustrato compostado, o al sustrato o cama de cobertura en sustratos sin compostar, mejoró significativamente los parámetros productivos de A. blazei. A su vez, se encontró que la acumulación y biodisponibilidad de Cu2+ incrementaban proporcionalmente con la concentración del elemento agregado, en cualquiera de sus formas de aplicación. En cuanto a la actividad de lacasas durante el cultivo se pudo observar una diferencia según el tipo de sustrato ensayado, lo que señala una estrategia de degradación y crecimiento diferenciada por parte del hongo. Por último, se determinó que el extracto enzimático obtenido de un sustrato compostado, a base a cáscara de girasol y forraje de trigo, remanente del cultivo de dos oleadas de hongos A. blazei, y con una incubación a 25 C de por lo menos 72 h, es capaz de atenuar el efecto fitotóxico del metsulfurón metilo (5 x 10-3 ppm) sobre el crecimiento de B. napus. / The edible mushroom Agaricus blazei Murrill is recognized and very requested by its medicinal properties, but its cultivation was not developed until now in Argentina. The cultivation methodology employed is the same that the one used for the white button mushroom (Agaricus bisporus), and low and variables yields are obtained depending on the different strains, substrates and technical handling. This procedure includes the preparation of compost by means of a two-phase fermentative process, which has important disadvantages: a long production cycle, an important space and work force is required, a great initial investment and is a source of potential environmental damage. The objectives of the study carried out during the execution of this thesis, were: 1) to formulate and optimize cultivation media and composted and non-composted substrates, containing sunflower seed hulls (abundant local residue), for the efficient production of A. blazei. 2) to determine for the possible substitution of the Sphagnum peat moss by vermicompost as a casing material. 3) to determine the degradation evolution of the ignocellulosic material components employed in the different substrates for the cultivation of these mushrooms. 4) to evaluate the effect of the separated incorporation of Zn2+ and Cu2+ salts either in the substrate, casing or in the water for watering, on both the productivity and in the A. blazei fruitbody accumulation and their bioavailability from it. 5) to evaluate the laccase activity evolution in the substrates with different formulations during a production cycle. 6) to determine the effectiveness of the A. blazei spent mushroom compost in the degradation of the herbicide metsulfuron methyl. As main results, it was found valuable the use of a compost broth based medium, at pH 6,5, over traditional potato broth based, for the conservation or propagation of the A. blazei mycelium. The possibility of obtaining compost for successful cultivation of A. blazei using as system containers a metallic tank of 200 L and plastic tanks of 400 L or 600 L was confirmed. For the first time, it is demonstrated the possibility of using sunflower seed hulls as fundamental part in the compost formula for the obtaining of the substrate for the A. blazei cultivation for the traditional method, with similar and even better yields to the reported ones. In addition, it was observed that the vermicompost, employed as casing material, has a stimulating effect in the induction of the cap differentiation. The possibility of cultivating A. blazei on non-composted substrates, with yields near to the informed ones in composted substrates, was also demonstrated. Interestingly, the spent mushroom compost, besides improving the yields in comparison to the substrate containing just sunflower seed hulls, showed a contamination preventive effect, so much when it was mixed half part with sunflower seed hulls as when it was used supplemented. It was observed that the major organic matter degradation in the compost/substrate happens during cultivation, and it was 50 % superior to the one occurred during the composting, and that the main used lignocellulosic components during the A. blazei cultivation were hemicellulose and lignin. Larger degradation could still occur in substrates leading to better yield. On the other hand, the addition of 100 or 200 ppm of Zn2+ during the preparation of the casing in a composted substrate, or to the substrate or casing, in non-composted substrates, improved significantly the productive parameters in A. blazei cultivation. In turn, it was found that the accumulation and bioavailability of Cu2+ increased proportionally with the concentration of the added element, irrespective of the application modes. As for the laccases activity, during the cultivation a difference according to the type of substrate employed could be observed, what points out a different strategy for substrate utilization and mushroom growth. Lastly, it was determined that the enzymatic extract obtained from a compost, based on sunflower seed hulls and wheat forage, resulting from the cultivation of A. blazei during two flushes, and with a 25 C incubation of at least 72 h, is able to markedly attenuate the phytotoxic effect of the metsulfuron methyl (5 x 10-3 ppm) on the growth of B. napus.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En general los procesos de biotransformación originan metabolitos inocuos para el organismo y mayoritariamente excretables por la orina. Nitrofurantoína y Nifurtimox son compuestos lipofílicos, por lo cual deben ser oxidados para transformarse en compuestos hidrosolubles y así excretables por la orina. Al respecto, no existen antecedentes de la existencia de vías metabólicas que provoquen modificaciones oxidativas de estos fármacos y así puedan adquirir la polaridad suficiente para ser excretados por la orina. Sin embargo, la reducción enzimática de Nitrofurantoína y Nifurtimox genera un nitro anión radical (NO2.-) intermediario que en presencia de O2, es capaz de sufrir reciclaje redox y generar especies reactivas del oxígeno (ROS), responsables de la inducción de estrés oxidativo celular. En este trabajo se estudió la nitrorreducción y el posible metabolismo oxidativo de Nitrofurantoína y Nifurtimox, ambos fenómenos catalizados por el sistema citocromo P450. Para ello utilizamos una preparación enriquecida en retículo endoplásmico hepático de rata (microsomas). La incubación de los microsomas con ambos fármacos y NADPH indujo lipoperoxidación microsómica, fenómeno que fue inhibido por GSH y un extracto hidroalcohólico de Buddleja globosa (matico). Por otra parte, al aumentar la concentración tanto de Nitrofurantoína como de Nifurtimox, la lipoperoxidación disminuyó de una forma bimodal; así, a concentraciones µM la pendiente de disminución fue 20 y 10 veces mayor que a concentraciones mM de Nitrofurantoína y Nifurtimox, respectivamente. Más aún, ambos fármacos se unieron a la monooxigenasa citocromo P450 de una forma concentración-respuesta e inhibieron competitivamente la hidroxilación de naftaleno, reacción catalizada por el sistema citocromo P450. Los resultados demuestran que tanto Nitrofurantoína como Nifurtimox podrían ser nitrorreducidos y además oxidados por el sistema oxidativo del citocromo P450. Por otra parte, dado que el estrés oxidativo fue inhibido por antioxidantes, una terapia asociada podría disminuir los efectos adversos asociados a la nitrorreducción de estos fármacos; sin embargo se necesitan nuevos experimentos que confirmen este postulado, entre ellos la identificación de metabolitos polares resultantes de la biotransformación oxidativa de estos fármacos

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En general los procesos de biotransformación de fármacos originan metabolitos excretables por la orina. Nitrofurantoína y Nifurtimox son compuestos lipofílicos, sin embargo no existen antecedentes acerca de la eliminación de metabolitos de estos fármacos en orina. Su administración induce diversos efectos adversos asociados a la nitrorreducción que ellos sufrirían in vivo, reacción que genera un nitro anión radical (NO2.-) intermediario que sufre reciclaje redox con O2, generando ROS. Naftaleno es un xenobiótico metabolizado por oxidación a través del sistema citocromo P450; además, induce estrés oxidativo por esta vía metabólica. En este trabajo realizamos un estudio comparativo entre el metabolismo de naftaleno y, Nitrofurantoína y Nifurtimox catalizado por el sistema citocromo P450. Para ello utilizamos una preparación enriquecida en retículo endoplásmico hepático de rata (microsomas). La incubación de los microsomas con ya sea naftaleno, Nitrofurantoína o Nifurtimox y NADPH indujo lipoperoxidación microsómica, fenómeno que fue inhibido por GSH y un extracto hidroalcohólico de Buddleja globosa (matico) de una forma concentración-respuesta. La lipoperoxidación microsómica inducida por los 3 xenobióticos ensayados tuvo un comportamiento bimodal y fue dependiente de la concentración de los xenobióticos; naftaleno aumentó la lipoperoxidación y, Nitrofurantoína y Nifurtimox, la disminuyeron. Así, la primera pendiente positiva obtenida en presencia de naftaleno fue 2 veces mayor que la segunda; asimismo, la pendiente negativa obtenida a concentraciones µM de ya sea Nitrofurantoína o Nifurtimox fue 20 y 10 veces mayor que la obtenida a concentraciones mM, respectivamente. Además, los 3 xenobióticos: a) disminuyeron el contenido de tioles microsómicos en condiciones de biotransformación, b) se unieron a la monooxigenasa citocromo P450 de una forma concentración-respuesta, c) inhibieron la O-desmetilación de p-nitroanisol, reacción catalizada por el sistema citocromo P450, fenómeno que fue prevenido parcialmente por GSH y DTT. Nuestros resultados muestran que Nitrofurantoína y Nifurtimox pueden ser nitrorreducidos y además, oxidados por el sistema citocromo P450; sin embargo, se requieren nuevos experimentos que permitan confirmar este postulado. Por otra parte, ya que el estrés oxidativo inducido por la nitrorreducción fue inhibido por antioxidantes, la administración de una terapia asociada podría ayudar a disminuir los efectos adversos descritos para estos fármacos. / In general, the drug biotransformation produces metabolites which are excreted by urine. Nitrofurantoin and Nifurtimox are lipophilic compounds; there are no date however, related with the elimination of metabolites of these drugs in urine. The administration of both drugs induce several adverse effects which are associated to it′s nitro-reduction in vivo; this reaction would generate a nitro anion radical (NO2 .-); in the presence of O2 this intermediate suffer redox reaction, so conducing to the formation of ROS. Naphtalen is oxidized by cytochrome P450 system inducing oxidative stress. Thus, in this work, we realized a comparative study between naphtalen and, Nitrofurantoin and Nifurtimox biotransformation catalyzed by cytochrome P450 system. In this study we used a preparation enriched in endoplasmic reticulum of rat liver (microsomes). The incubation of microsomes with naphtalen, Nitrofurantoin or Nifurtimox, and NADPH induced microsomal lipoperoxidation, phenomenon which was inhibited by GSH and a hydroalcoholic extract of Buddleja globosa (matico) as a concentration-response manner. The microsomal lipoperoxidation induced by the 3 xenobiotics assayed was conduced as a concentration-dependent and bimodal manner; but naphtalen increased the lipoperoxidation and, Nifrofurantoin and Nifurtimox diminished it. Thus, naphtalen first slope obtained was 2 fold higher than the second slope and, the negative slope obtained to μM drug concentrations of either Nitrofurantoin or Nifurtimox was 20 fold higher than that observed to mM drug concentrations. In biotransformation conditions the 3 xenobiotics: a) diminished the microsomal thiol content and the cytochrome P450 monooxygenase microsomal content ; b) inhibited the p-nitroanisole O-demethylation catalyzed by cytochrome P450 system, phenomenon which was partially inhibited by GSH and DTT. Nitrofurantoin and Nifurtimox could be nitro-reduced and also oxidized by cytochrome P450 system; however, new experiments are required to confirm this postulate. Because oxidative stress induced by the nitro-reduction of Nitrofurantoin and Nifurtimox was inhibited by antioxidant compounds, the administration of an associated therapy may be considered to diminish the adverse effects described for these drugs