El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, β−aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmovilizados por técnicas de formación de enlaces covalentes (en el caso de enzimas) y por atrapamiento (tanto para enzimas como para células). Se establecieron dos métodos enzimáticos para la síntesis del aminoácido aromático esencial L-fenilalanina (Phe). El primer método de síntesis se realizó usando como biocatalizador L-aspartato transaminasa (AAT) de corazón porcino inmovilizado. Se optimizaron los métodos de inmovilización de AAT en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados resultantes se emplearon en la síntesis de Phe. La inmovilización en Eupergit® C y LentiKats® permitió mejorar la estabilidad del enzima AAT, así como alcanzar rendimientos de reacción de síntesis de Phe superiores al 70%. Además se estableció un método de síntesis multienzimática “one-pot”, para lo que se acoplaron las reacciones catalizadas por los enzimas aspartasa (AspB) y transaminasa (AT). Se determinó la compatibilidad de los enzimas en las condiciones de reacción (pH 7,5 y 37°C) y se establecieron las concentraciones óptimas de los sustratos (0,15 M de fumarato, 0,3 M de NH4Cl y 0,1 M de fenilpiruvato) y de los enzimas (0,3 U de AspB/mL y 2 U de AT/mL). En estas condiciones, se alcanzó un rendimiento global de reacción de 80%. Para la síntesis de L-aspartato (Asp) se utilizó el enzima L-aspartato amonio liasa o aspartasa (AspB) de Bacillus sp. YM55-1 parcialmente purificado. El enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados se emplearon en la síntesis de altas concentraciones de Asp (≥ 60 g/L). Además, el enzima inmovilizado se reutilizó eficientemente en la síntesis del aminoácido, manteniendo alrededor del 90% de su actividad inicial al cabo de 5 ciclos de reacción en todos los casos. La síntesis de las aminas aromáticas 1-feniletilamina (FEA) y 3-amino-1-fenilbutano (AFB) se llevó a cabo utilizando biocatalizadores (células y/o enzima parcialmente purificado) con actividad ω−transaminasa (ω−TA). Se estableció un método de permeabilización de las membranas de células ω−TA utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB). Las células ω−TA se inmovilizaron en el soporte LentiKats® con un 100% de retención de su actividad catalítica. El enzima ω−TA se inmovilizó en varios soportes, obteniéndose los mejores resultados en Eupergit® CM y LentiKats®. La inmovilización en LentiKats®, tanto de células (no permeabilizadas y permeabilizadas) como del enzima, permitió la reutilización de los catalizadores hasta en 5 y 10 ciclos de síntesis de AFB, manteniendo alrededor del 80 y 70% de la actividad inicial, respectivamente. Por último, se comprobó que el enzima aspartasa mutado (AspB-C6) a partir de AspB, cataliza la reacción de aminación regioselectiva del ácido crotónico para producir β−aminobutirato. Este enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C y MANA-agarosa según los métodos de inmovilización establecidos para el enzima AspB en los mismos soportes. Se obtuvieron rendimientos de inmovilización similares pero las actividades retenidas fueron significativamente inferiores para AspB-C6 que para AspB. / The objective of this thesis is to establish biocatalytic methods for the synthesis of the amino acids L-aspartate, L-phenylalanine and β−aminobutyrate, as well as the aromatic amines 1-phenylethylamine and 3-amine-1-phenylbutane, by using biocatalysts with transaminase and ammonia-lyase activity immobilized by covalent attachment techniques (for enzymes) and entrapment (for enzymes and cells). Two methods for the synthesis of the essential aromatic amino acid L-phenylalanine (Phe) were established. The first method was carried out by using L-aspartate transaminase (AAT) from porcine heart as biocatalyst. The immobilization of the enzyme AAT on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports was optimized, and the three immobilized enzymatic derivatives were used for the synthesis of Phe. AAT immobilized on Eupergit® C and LentiKats® allowed improving the stability of the enzyme as well as reaching reaction yields of Phe over 70%. Moreover, a multi-enzymatic one-pot method for the synthesis of Phe was established by coupling of two consecutive enzymatic reactions catalyzed by aspartase (AspB) and transaminase (AT). The compatibility of both enzymes under the reaction conditions (pH 7,5 and 37°C) was shown; and, the optimum concentration of substrates (0,15 M fumarate, 0,3 M NH4Cl and 0,1 M phenylpyruvate) and enzymes (0,3 U of AspB/mL and 2 U of AT/mL) were established. In these conditions, the global reaction yield was 80%. L-aspartate was synthesized by using the enzyme L-aspartate ammonia-lyase or aspartase (AspB) from Bacillus sp. YM55-1. The enzyme was immobilized on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports. The immobilized biocatalysts were used for the synthesis of highly concentrated Asp (≥ 60 g/L). Furthermore, the immobilized biocatalysts were efficiently reused in 5 cycles of Asp synthesis, maintaining over 90% of activity and reaching over 90% of conversion in all the cases. The synthesis of the aromatic amine 3-amine-phenylbutane (APB) was carried out by means of cells with ω−transaminase (ω−TA) activity as well as the partially purified enzyme ω−TA. A permeabilization method of the cell membranes with cetrimonium bromide (CTAB) was performed. Cells were immobilized in LentiKats® with 100% retention of the catalytic activity. The enzyme ω−TA was immobilized on several supports, and the best results were obtained with Eupergit® CM and LentiKats® supports. The cells (non-permeabilized and permeabilized) and the enzyme immobilized in LentiKats®, allowed reusing the biocatalysts up to 5 and 10 cycles of synthesis of APB, maintaining around 80 and 70% of the initial activity respectively. Finally, it was shown that the mutated aspartase (AspB-C6) from AspB, catalyzes the regioselective amination of crotonic acid to yield β−aminobutyrate. This enzyme was immobilized on Eupergit® C and MANA-agarose supports, according to the immobilization methods established for AspB on the same supports. The immobilization yields were similar; however the retained activities were lower than those obtained for AspB.

El presente estudio tuvo como objetivo determinar la capacidad de remoción de nitratos (N-NO3⁻) y fosfatos (PO₄³¯) en Aguas Residuales Municipales (ARM) por microalgas libres e inmovilizadas. Se utilizaron cepas provenientes de los afluentes de la Planta de Recuperación de las Aguas del Río Surco (Lima, Perú) y se evaluó su capacidad de remoción de N-NO3⁻ y PO₄³¯ durante 10 días, a nivel laboratorio, en ARM con tratamiento primario, tanto de forma libre como inmovilizadas en discos de alginato de sodio al 4%. Los cepas obtenidas se identificaron como Chlorella sp y Chlamydomonas sp. Ambas tuvieron un buen crecimiento en ARM, especialmente Chlamydomonas sp, la cual reportó los mayores valores en los parámetros cinéticos de crecimiento. El cultivo de Chlorella sp. libre fue el que registró uno de los valores más altos de porcentaje (71.25%) y tasa de remoción (0.43 mg/l/día) de N-NO3⁻, y los máximos valores de dichos parámetros para PO43- (83.69%; 0.09 mg/l/día), así como para el índice de eficacia (EI) de ambos nutrientes, comparado con los de Chlamydomonas sp. Los cultivos inmovilizados de ambas especies reportaron valores altos de remoción, entre 56% a 67% para N-NO3⁻ y 78% a 81% para PO43-, este último fue removido en 24 horas en la mayoría de los cultivos. La inmovilización fue el principal factor que afectó la capacidad de remoción de nutrientes. Ambas cepas mostraron ser eficientes en la remoción de nutrientes en ARM, especialmente de PO43-, con valores cercanos a los máximos reportados para ambas especies en estudios previos.The aim of this investigation was to determinate the nitrate (N-NO3⁻) and phosphate (PO43-) removal capacity of free and immobilized microalgae in Municipal Wastewater (MW). Strains were isolated from Planta de Recuperación de las Aguas del Río Surco (Lima, Perú) influent. Their N-NO3⁻ and PO43- removal capacity were evaluated during 10 days in MW with primary treatment in batch cultures with free and immobilized cells in 4% sodium alginate discs. Strains were identified as Chlorella sp and Chlamydomonas sp. Both showed good growth in MW, especially Chlamydomonas sp., which reported the highest value of kinetic growth parameters. Free Chlorella sp. culture reported one of the highest values of N-NO3- removal percentage (71.25%) and rate (0.43 mg/l/día), and the maximum values of PO43- removal parameters (83.69%; 0.09 mg/l/día) and efficacy index (EI) for both nutrients compared with Chlamydomonas sp. Immobilized cultures reported high values of nutrient removal, between 56% to 67% for N-NO3⁻ and 78% to 81% for PO43-. In most microalgae cultures, high percentages of PO43- (76-80%) were removed in 24 hours. Method of culture (free or immobilized) was the main factor affecting the nutrient removal capacity. Strains were efficient in nutrient removal in MW, especially for PO43-, with values close to the maximum ones reported for both species in previous studies.

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Actualmente los enólogos se enfrentan a la necesidad de mejorar el proceso fermentativo y las cualidades sensoriales del vino en un sector cada vez más competitivo y global. Entre estos retos, destaca la necesidad de producir vinos más atractivos y complejos desde el punto de vista aromático. En este contexto, las levaduras vínicas no-Saccharomyces podrían representar una herramienta adecuada dado su potencial para formar compuestos volátiles. En este trabajo se ha evaluado la capacidad de estas levaduras para producir ésteres de acetato, y su posible inclusión en cultivos iniciadores mixtos, capaces no sólo de llevar a cabo la fermentación alcohólica sino de introducir características aromáticas diferenciales en los vinos así obtenidos. Como resultado del escrutinio inicial se seleccionó la cepa Hanseniaspora vineae 1471 por su destacada producción de acetato de 2-feniletilo así como por sus buenas características enológicas. Posteriormente se diseñaron cultivos iniciadores mixtos con Saccharomyces cerevisiae, confirmándose las propiedades de H. vineae 1471, y la posibilidad de modular la concentración de acetato de 2-feniletilo variando las proporciones iniciales de estas levaduras en el cultivo mixto. Así mismo, empleando mostos naturales no estériles, se confirmó el crecimiento de H. vineae 1471, inoculada de forma secuencial, a pesar de la presencia de una microbiota nativa elevada, y la obtención de vinos con concentraciones incrementadas de acetato de 2-feniletilo. Por último la inmovilización de H. vineae 1471 en geles de alginato cálcico resultó una técnica adecuada para controlar su permanencia y producción de acetato de 2-feniletilo durante la fermentación. / Viana Garrido, F. (2011). Levaduras no-Saccharomyces para modular el aroma secundario de los vinos: incremento del acetato de 2-feniletilo mediante cultivos iniciadores mixtos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/12891

[ES] En esta Tesis Doctoral, se han desarrollado varias rutas catalíticas para la obtención de productos químicos de alto valor añadido y de interés para la industria alimentaria, farmacéutica o petroquímica del plástico, bajo los principios de la Química Verde y mediante catalizadores heterogéneos químicos y enzimáticos. En concreto, se ha desarrollado la hidrólisis enzimática de la naringina (un flavonoide ampliamente presente en los residuos cítricos) para la obtención de los flavonoides prunina y naringenina, que presentan aplicación farmacológica y alimentaria. Para ello, se ha purificado de manera simple y en un solo paso la naringinasa comercial del hongo Penicillium decumbens y se ha obtenido una enzima purificada que permite la obtención selectiva del flavonoide cítrico prunina. Ambas enzimas, la comercial y la purificada, se han inmovilizado covalentemente sobre un soporte orgánico (óxido de grafeno) y una zeolita bidimensional (ITQ2) modificada con grupos aldehído en su superficie. Se han caracterizado los derivados enzimáticos obtenidos mostrando una alta estabilidad térmica y una mayor afinidad por el sustrato que la enzima libre. Los derivados enzimáticos se han implementado con éxito en la hidrólisis de la naringina y se han obtenido altas conversiones y selectividades. Además, la naringinasa inmovilizada sobre la zeolita ITQ-2 se ha aplicado al tratamiento de zumo de pomelo para reducir su sabor amargo (el cual es debido en parte a la presencia de naringina) mediante un proceso en reactor continuo de lecho fijo. Se ha mostrado que es posible mantener durante al menos 300 h la actividad catalítica del enzima inmovilizado, obteniéndose altas cantidades de azúcares liberados, la consecuente pérdida del sabor amargo y, además, aumentando la capacidad antioxidante del zumo de pomelo. Se ha desarrollado un proceso quimioenzimático para la obtención de alcoholes quirales con aplicación farmacológica, mediante un proceso en continuo y en dos pasos (oxidación-reducción). En un primer paso, se ha llevado a cabo la oxidación de Oppenauer del alcohol racémico utilizando la zeolita Zr-Beta y, como aceptor de hidruros, acetona, obteniéndose la correspondiente cetona proquiral e isopropanol como subproducto. En un segundo paso, se ha realizado la reducción enantioselectiva de la cetona proquiral utilizando la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) inmovilizada electrostáticamente sobre la zeolita ITQ-2 y el isopropanol producido en el primer paso como regenerador del cofactor enzimático, obteniéndose altos rendimientos y enantioselectividades a los alcoholes quirales (R o S). Se ha mostrado que ambos sistemas catalíticos son altamente activos, selectivos y estables, siendo posible mantener durante al menos 100 h rendimientos mayores del 90 % en reactores continuos de lecho fijo por separado. Finalmente, se han combinado ambas etapas en continuo que se han mantenido operativas durante al menos 40 h obteniéndose rendimientos al alcohol quiral mayores del 90 %. Se ha desarrollado un proceso quimioenzimático en continuo y en dos etapas para la obtención de diésteres del 2,5-bis(hidroximetil)furano (BHMF), útiles como plastificantes en la industria de polímeros. La primera etapa consiste en la reducción quimioselectiva del HMF utilizando un catalizador de cobalto, obteniéndose altos rendimientos y selectividades al BHMF. En un segundo paso, se ha esterificado/transesterificado el BHMF, utilizando una lipasa inmovilizada. Se ha llevado a cabo la optimización de ambas etapas por separado en reactores discontinuos y continuos de lecho fijo. La optimización del disolvente y el compuesto dador de acilo han permitido obtener rendimientos de aproximadamente el 90 % de diésteres en el proceso quimioenzimático global, manteniéndose la actividad y selectividad del proceso en continuo durante al menos 60 h. / [CA] En aquesta Tesi Doctoral s'han desenvolupat diverses rutes catalítiques per a l'obtenció de productes químics d'alt valor afegit i d`interés per a la indústria alimentària, farmacéutica i petroquímica del plàstic, baix els principis de la Química Verda i mitjançant catalitzadors heterogenis químics i enzimàtics. En concret, s'ha desenvolupat la hidròlisi enzimàtica de la naringina (un flavonoide àmpliament present en els residus cítrics) per a l'obtenció dels flavonoides prunina i naringenina, que presenten aplicació farmacològica o alimentària. Per tant, s'ha purificat de manera simple i només en un pas la naringinasa comercial del fong Penicillium decumbens i s'ha obtingut un enzim purificat que permet l'obtenció selectiva del flavonoide cítric prunina. Aquestes enzims, el comercial i el purificat, s'han immobilitzat covalentment sobre un suport orgànic (òxid de grafé) i una zeolita bidimensional (ITQ-2) modificada amb grups aldehid en la seva superfície. S'han caracteritzat els derivats enzimàtics obtinguts mostrant una alta estabilitat tèrmica i una major afinitat pel substrat que l'enzim lliure. Els derivats enzimàtics s'han implementat amb èxit en la hidrólisis de la naringina i s'han obtingut altes conversions i selectivitats. A més, la naringinasa immobilitzada sobre la zeolita ITQ-2 s'ha aplicat al tractament de suc d'aranja per a reduir el seu sabor amarg (en part degut a la presència de naringina) mitjançant un procés en reactor continu de llit fix. S'ha mostrat que es pot mantenir durant almenys 300 h l'activitat catalítica de l'enzim immobilizat, obtenintse altes quantitats de sucres alliberats, la conseqüent pèrdua del sabor amarg i, a més, augmentant la capacitat antioxidant del suc d'aranja. S'ha desenvolupat un procés quimioenzimàtic per a l'obtenció d'alcohols quirals amb aplicació farmacològica, mitjançant un procés en continu i en dos passos (oxidació-reducció). En un primer pas, s'ha dut a terme l'oxidació de Oppenauer de l'alcohol racèmic utilitzant la zeolita Zr-Beta i, acetona com a acceptor d'hidrurs, obtenint-se la corresponent cetona proquiral i isopropanol com subproducte. En un segon pas, s'ha realitzat la reducció enantioselectiva de la cetona proquiral utilitzant l'enzim alcohol deshidrogenasa (ADH) immobilitzada electrostàticament sobre la zeolita ITQ-2 i el isopropanol produït en el primer pas com a regenerador del cofactor enzimàtic, obtenint-se alts rendiments i enantioselectivitats als alcohols quirals (R o S). S'ha mostrat que tots dos sistemes catalítics són altament actius, selectius i estables, així, es possible mantenir durant almenys 100 h rendiments majors del 90 % en reactors continus de llit fix per separat. Finalment, s'han combinat totes dues etapes en continu que s'han mantingut operatives durant almenys 40 h, obtenint-se rendiments a l'alcohol quiral majors del 90 %. S'ha desenvolupat un procés quimioenzimàtic en continu i en dues etapes per a l'obtenció de diésters del 2,5-bis(hidroximetil)furà (BHMF), útils com a plastificants en la indústria de polímers. La primera etapa consisteix en la reducció quimioselectiva del HMF utilitzant un catalitzador de cobalt, obtenint-se alts rendiments i selectivitats al BHMF. En la segona etapa, s'ha esterificat/transesterificat el BHMF, utilitzant l'enzim lipasa immobilitzada. S'ha dut a terme l'optimització de totes dues etapes per separat en reactors discontinus i continus de llit fix. La optimització del disolvent i el compost dador de grups acil han permet obtindre rendiments d'aproximadament el 90 % de dièsters en el procés quimioenzimàtic global, mantenint-se l'activitat i selectivitat del procés en continu durant almenys 60 h. / [EN] In this Doctoral Thesis, several catalytic routes have been developed with the aim of obtaining chemical products of high added value and of interest to the food, pharmaceutical and plastic petrochemical industries, under the principles of Green Chemistry and through heterogeneous catalysts both chemical and enzymatic. Specifically, enzymatic hydrolysis of naringin (a flavonoid which is widely present in citric wastes) has been developed to obtain prunin and naringenin flavonoids, which have food and pharmaceutical applications. For this purpose, the commercial naringinase from the fungus Penicillium decumbens has been purified in a simple way in one step, and it has been obtained a purified enzyme which allows obtaining selectively the citric flavonoid prunin. Both enzymes, the commercial and the purified one, have been covalently immobilized over an organic support (graphene oxide) and over a bidimensional zeolite (ITQ-2) modified with aldehyde groups on its surface. The enzymatic derivatives have been characterized, and it has been shown that they have high thermal stability and more affinity for the substrate than the free enzyme. The enzymatic derivatives have been used successfully in the hydrolysis of naringenin, showing high conversions and selectivities. Additionally, the immobilized naringinase over the ITQ-2 zeolite has been used to treat the grapefruit juice to reduce the bitter taste (which is in part due to the presence of naringin) through a process in a fixed bed continuous reactor. It has been shown that is possible to maintain the catalytic activity through 300 hours, obtaining high quantities of released sugars, the lose of the bitter taste and, what is more, increasing the antioxidant capacity of the grapefruit juice. A chemoenzymatic process has been developed with the aim of obtaining chiral alcohols with pharmaceutical applications, through a continuous process in two steps (oxidation-reduction). The first step is the Oppenauer oxidation of a racemic alcohol using Zr-Beta zeolite and acetone as hydride acceptor, and as a result, the corresponding prochiral ketone and isopropanol as by-product are obtained. The second step is the enantioselective reduction of the prochiral ketone using the alcohol dehydrogenase enzyme (ADH) electrostatically immobilized on the ITQ-2 zeolite and the isopropanol produced in the first step, which regenerates the cofactor; this process presents both a high yield and enantioselectivities to the chiral alcohols (R or S). It has been shown that both catalytic systems are highly actives, selectives and stables: with both of them it is possible to keep a yield higher than 90 % during at least 100 h in continuous reactors with fixed bed. Finally, both steps have been combined in continuous, and this reaction has been kept during at least 40 h with a yield to the chiral alcohol higher than 90 %. A chemoenzymatic process in a continuous fixed bed reactor has been developed in two steps to obtain diesters of 2,5-bis(hydroxymethyl)furan (BHMF), which are useful as plasticizers in the polymer industry. The first step consists of the chemoselective reduction of the HMF using a catalyst based on cobalt, which allow obtaining high yield and selectivities to BHMF. In the second step, the BHMF has been esterified/transesterified using the immobilized lipase. Both steps have been optimized separately in discontinuos and continuous reactors. The optimization of the solvent and acyl donor allowed to obtain yields of diesters of around 90 % in the global chemoenzymatic process, while the activity and selectivity of the continuous process was maintained during at least 60 h. / Carceller Carceller, JM. (2019). Desarrollo de procesos enzimáticos y quimio-enzimáticos utilizando catalizadores heterogéneos para la síntesis de productos de Química Fina [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/129871

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El desarrollo de nuevos materiales para la mejora de sistemas analíticos basados en receptores moleculares -principalmente proteínas y ácidos nucleicos- altamente sensibles, con gran capacidad de trabajo y de manejo sencillo, tiene un gran potencial frente a los principales retos planteados hoy en día, como asistencia en tiempo real, detección multianalito, selectividad elevada y portabilidad, entre otros. Los sistemas analíticos desarrollados en la presente tesis se caracterizan por trabajar a escala micro y nanométrica, requerir la inmovilización controlada del elemento de reconocimiento biológico (biorreceptor o sonda) en la superficie, e incorporar un cierto grado de automatización, siendo el objetivo último y fundamental la aplicación de los desarrollos más prometedores a problemáticas concretas. En consecuencia, durante la realización del trabajo de tesis, se han planteado metodologías para la modificación química de diferentes materiales (silicio y derivados, óxido de tántalo y polímeros orgánicos) y la inmovilización de sondas de biorreceptores para el desarrollo de sistemas de detección óptica de dianas, en formato con y sin marcaje. En este sentido, una parte de la tesis aborda la puesta a punto de sistemas de ensayo a escala micrométrica utilizando como plataformas analíticas discos compactos. En este caso, se trata de modificar convenientemente los polímeros que componen ambas caras de los CDs (policarbonato y polimetilmetacrilato) para imprimir micromatrices de reactivos de captura. La lectura de resultados se efectúa a partir de las señales generadas por los trazadores, utilizando un lector de CDs de audio-video estándar. Esta metodología, se ha aplicado a la detección de gripe aviaria en muestras de saliva, así como a la detección de polimorfismos de una sola base (SNPs) para sondas de ADN. En otra aproximación se ha trabajado con materiales derivados de silicio y óxido de tántalo. Sus propiedades dieléctricas y su rigidez los hacen ideales para el d / González Pedro, MV. (2012). Estudio de estrategias de inmovilización de biomoléculas sobre soportes rígidos para aplicación en microbiosensores [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/16874

Tesis por compendio / [EN] The present PhD thesis is focused on the study of new approaches able to improve the performance of microarrays. Aspects such as the nature of the surfaces and the probes, functionalization of the substrates, probe printing, immobilization and target detection were considered in the fabrication process. Within all these features, modulation of the surface behavior and probe anchoring were the most challenging aspects, as the interface is key for the immobilization of the receptors and the later detection, which will determine the performance of the final device. In this work, two microarray types have been developed, one for oligonucleotides and another one for antibodies. Then, a characterization of the reached achievements is done. All the routes have in common the use of light to catalyze the attachment of bioreceptors on the surface substrates, employing click-chemistry reactions. In the first chapter, the state of the art of microarray technology is overviewed, with special focus in the main aspects of microarray design. In the second chapter, the goals for this PhD thesis are settled. These general objectives are addressed in the following experimental chapters. In the third chapter, the effect of hydrophobicity and probe multi-point attachment on the microarray performance are studied. Thus, modulation of glass slide surfaces with alkenyl and alkynyl motifs for the anchoring of mono and multithiolated oligonucleotide probes by thiol-ene and thiol-yne photocoupling reactions, respectively, was accomplished. Surfaces modified with the most hydrophobic silane (alkynyl), or anchoring polythiolated probes, revealed better performances. These microarray systems were applied to the discrimination of SNPs and to detect bacterial genome PCR products. In the fourth chapter, a rational design for the preparation of microarrays of antibodies, is done. The immobilization approach displays the oriented anchoring of thiol-bearing antibody fragments to alkenylated glass slides by thiol-ene photocoupling reaction. Multiplexed detection of cardiac biomarkers is demonstrated. The designed microarray shows higher recognition capacity in comparison to whole antibody microarrays. In the fifth chapter, improvement of a novel methodology for the anchoring of thiolated oligonucleotides has been developed. Due to the interest on modifying highly hydrophobic surfaces, a new photoinduced reaction is set up. Thanks to the features of the named "fluor-thiol photocoupling reaction", immobilization of thiolated probes to surfaces containing C-F bonds in a fast, easy and biocompatible with aqueous media way, was achieved. Hydrophobicity of the surfaces was controlled to get successful hybridizations. Because of the high hydrophobicity of the surfaces, a huge confinement of the probes is accomplished, which allows the approximation of the analytes only where the probe is linked, keeping a high repulsion in the remaining surface. The perfluorinated glass slides improved the immobilization densities and detection capacity, regarding to the alkenylated and alkynylated surfaces, and allowed the discrimination of SNPs and detection of bacterial PCR products, as well. In the sixth chapter, other surfaces different than glass are explored. Thus, polyvinylidene fluoride membranes were employed as substrates for the development of oligonucleotide microarrays. Therefore, a fast, easy and mild functionalization process by UV irradiation and organosilane chemistry, was developed. Then, alkenyl functionalized and non-functionalized membranes were applied to microarray technology by covalent anchoring through thiol-ene and fluor-thiol photocoupling reactions, respectively. Promising results were obtained with both surfaces. / [ES] La presente tesis tesis doctoral se centra en el estudio de nuevas aproximaciones capaces de mejorar el rendimiento de los microarrays. Aspectos como la naturaleza de las superficies y las sondas, la funcionalización de los sustratos, la impresión, la inmovilización y la detección de las sondas se consideraron en el proceso de fabricación. Dentro de todas estas características, la modulación de la superficie y el anclaje de la sonda fueron los aspectos más desafiantes, ya que la interfaz es clave para la inmovilización de los receptores y la posterior detección, lo que determinará el rendimiento del dispositivo final. En este trabajo, se han desarrollado dos tipos de microarrays, uno para oligonucleótidos y otro para anticuerpos. Luego, se ha realizado una caracterización de los logros alcanzados. Todas las rutas tienen en común el uso de la luz para catalizar la unión de los biorreceptores en los sustratos de la superficie, empleando reacciones de la química clic. En el primer capítulo, se facilita una visión general del estado del arte de la tecnología de microarrays con un enfoque especial en los aspectos principales del diseño de microarrays. En el segundo capítulo, se establecen los objetivos de esta tesis doctoral. Estos objetivos generales se abordan en los siguientes capítulos experimentales. En el tercer capítulo, se estudia el efecto de la hidrofobia y el uso de sondas con múltiples puntos de unión, en el rendimiento del microarray. De este modo, se llevó a cabo la modulación de superficies vidrio con grupos alquenilo y alquinilo para el anclaje de sondas de oligonucleótidos mono y multitioladas mediante las reacciones de foto anclaje del tiol-eno y tiol-ino, respectivamente. Las superficies modificadas con el silano más hidrofóbico (alquinilo) y las sondas politioladas ancladas, revelaron mejores rendimientos. Estos sistemas de microarrays se aplicaron a la discriminación de SNPs y a la detección de productos de PCR de bacterias. En el cuarto capítulo, se realiza un diseño racional para la preparación de microarrays de anticuerpos. El enfoque de inmovilización muestra el anclaje orientado de los fragmentos de anticuerpos que contienen tiol sobre superficies de vidrio alqueniladas mediante reacción de foto anclaje del tiol-eno. De esta forma, se demuestra la detección multiplexada de biomarcadores cardíacos. El microarray diseñado muestra una mayor capacidad de reconocimiento en comparación con los microarrays de anticuerpos completos. En el quinto capítulo, se ha desarrollado una nueva metodología para mejorar el anclaje de oligonucleótidos tiolados. Dado el interés en modificar superficies altamente hidrófobas, se establece una nueva reacción fotoinducida. Gracias a las características de la llamada "reacción de fotoacoplamiento de fluor-tiol", se logró la inmovilización de sondas tioladas a superficies que contienen enlaces C-F de una manera rápida, fácil y biocompatible con medios acuosos. La hidrofobicidad de las superficies se controló para obtener hibridaciones exitosas. Debido a la alta hidrofobicidad de las superficies, se logra un gran confinamiento de las sondas, lo que permite la aproximación de los analitos solo donde está unida la sonda, manteniendo una alta repulsión en la superficie restante. Las superficies de vidrio perfluoradas mejoraron las densidades de inmovilización y la capacidad de detección, con respecto a las superficies alqueniladas y alquiniladas, y también, permitieron la discriminación de SNPs y la detección de productos de PCR bacterianos. En el sexto capítulo, se exploran otras superficies diferentes al vidrio. Por lo tanto, membranas de fluoruro de polivinilideno se emplearon como sustratos para el desarrollo de microarrays de oligonucleótidos. Para ello, se desarrolló un proceso de funcionalización rápido, fácil y suave, mediante el empleo de irradiación UV y la química de los organosilanos. / [CA] La present tesi doctoral es centra en l'estudi de noves aproximacions capaces de millorar el rendiment dels microarrays. Aspectes com ara la naturalesa de les superfícies i les sondes, la funcionalització dels substrats, la impressió, la immobilització i la detecció de les sondes es van considerar en el procés de fabricació. Dins de totes aquestes característiques, la modulació de la superfície i l'ancoratge de la sonda van ser els aspectes més desafiadors, ja que la interfície és clau per a la immobilització dels receptors i la posterior detecció, la qual cosa determinarà el rendiment del dispositiu final. En aquest treball, s'han desenvolupat dos tipus de microarrays, un per a oligonucleòtids i un altre per a anticossos. Després, s'ha realitzat una caracterització dels resultats aconseguits. Totes les rutes tenen en comú l'ús de la llum per a catalitzar la unió dels biorreceptores en els substrats de la superfície, emprant reaccions de la química clic. En el primer capítol, es facilita una visió general de l'estat de l'art de la tecnologia de microarrays amb un enfocament especial en els aspectes principals del disseny de microarrays. En el segon capítol, s'estableixen els objectius d'aquesta tesi doctoral. Aquests objectius generals s'aborden en els següents capítols experimentals. En el tercer capítol, s'estudia l'efecte de la hidrofòbia i l'ús de sondes amb múltiples punts d'unió, en el rendiment del microarray. D'aquesta manera, es va dur a terme la modulació de superfícies de vidre amb grups alquenil i alquinil per a l'ancoratge de sondes de oligonucleòtids mono i multitiolades mitjançant les reaccions de foto ancoratge del tiol-doble enllaç i tiol-triple enllaç, respectivament. Les superfícies modificades amb el silà més hidrofòbic (alquinil) i les sondes politiolades ancorades, van revelar els millors rendiments. Aquests sistemes de microarrays es van aplicar a la discriminació de SNPs i a la detecció de productes de PCR de bacteris. En el quart capítol, es realitza un disseny racional per a la preparació de microarrays d'anticossos. L'enfocament d'immobilització mostra l'ancoratge orientat dels fragments d'anticossos que contenen el grup tiol sobre superfícies de vidre alquenilades mitjançant reacció de foto ancoratge del tiol-doble enllaç. D'aquesta forma, es demostra la detecció multiplexada de biomarcadors cardíacs. El microarray dissenyat mostra una major capacitat de reconeixement en comparació amb els microarrays d'anticossos complets. En el cinqué capítol, s'ha desenvolupat una nova metodologia per a millorar l'ancoratge de oligonucleòtids tiolats. Donat l'interés de modificar superfícies altament hidròfobes, s'estableix una nova reacció fotoinduïda. Gràcies a les característiques de l'anomenada "reacció de fotoacoplament de fluor-tiol", es va aconseguir la immobilització de sondes tioladas a superfícies que contenen enllaços C-F d'una manera ràpida, fàcil i biocompatible amb medis aquosos. La hidrofobicitat de les superfícies es va controlar per a obtindre bones hibridacions reeixides. A causa de l'alta hidrofobicidad de les superfícies, s'aconsegueix un gran confinament de les sondes, la qual cosa permet l'aproximació dels anàlits únicament on està unida la sonda i manté una alta repulsió en la superfície restant. Les superfícies de vidre perfluorades van millorar les densitats d'immobilització i la capacitat de detecció, respecte a les superfícies alquenilades i alquinilades, i també van permetre la discriminació de SNPs i la detecció de productes de PCR bacterians. En el sisé capítol, s'exploren altres superfícies diferents al vidre. Per tant, membranes de fluorur de polivinilidé es van emprar com a substrats per al desenvolupament de microarrays d'oligonucleòtids. Per a això, es va desenvolupar un procés de funcionalització ràpid, fàcil i suau, mitjançant l'ús d'irradiació UV i la química dels organosilan / Agradecer al Ministerio de Economía y Competitividad de España, por su programa de becas doctorales FPI / Jiménez Meneses, P. (2020). Study of substrate modulation and bioreceptor anchoring for the development of high performance microarrays [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137993 / Compendio

La nueva normalidad a raíz del COVID-19 exige un cambio en todos los sectores productivos a nivel mundial. En este sentido el sector construcción no se exime de establecer nuevos procedimientos al costo de obras, tales como las obras de vivienda multifamiliares, para lo cual se presenta una guía con la finalidad de medir el impacto de la pandemia. El proceso para la elaboración de la guía tiene como inicio el diagnóstico de la variación de costos, para lo cual se tuvo información de tres obras de viviendas multifamiliares. El análisis de los tres casos de estudio se realiza a las partidas con mayor relevancia de la especialidad de estructuras para, posteriormente evaluar su comportamiento entre las etapas pre y post inmovilización social, pudiendo de esa forma determinar el impacto por la pandemia. Teniendo en cuenta que esta investigación es de nivel explicativo, por analizar la causa y el efecto, la rigurosidad estadística está presente con el apoyo de los expertos que dieron sus opiniones en base a la guía, lo que permite mejorar la metodología y otros elementos para la perfección de esta. Determinar el impacto en los costos de la especialidad de estructuras para obras de viviendas multifamiliares trae consigo el análisis a los recursos: mano de obra, materiales, equipos y subcontratos. Asimismo, la variación en sus costos se relación con la implementación de lineamientos para la vigilancia y prevención y control de la salud de los trabajadores con riesgo de exposición establecidos mediante Resolución Ministerial Nº 448.2020.MINSA. / The new normality as a result of COVID-19 demands a change in all productive sectors worldwide. In this sense, the construction sector is not exempt from establishing new procedures and modifications to the cost of constructions, such as multifamily housing works, for which a guide is presented in order to measure the impact of the pandemic. The process for the elaboration of the guide has started with the diagnosis of the variation of costs, for which information was obtained from three multifamily housing projects. The analysis of the three case studies is carried out on the most relevant items of the specialty of structures in order to evaluate their behavior between the pre and post social immobilization stages, thus being able to determine the impact of the pandemic. Considering that this research is of explanatory level, by analyzing the cause and effect, the statistical rigor is present with the support of the experts who gave their opinions based on the guide, which allows improving the methodology and other elements for the perfection of this one. Determining the impact on the costs of the specialty of structures for multifamily housing projects involves the analysis of resources: labor, materials, equipment and subcontracts. Likewise, the variation in costs is related to the implementation of guidelines for the surveillance and prevention and control of the health of workers at risk of exposure established by Ministerial Resolution No. 448.2020.MINSA / Tesis

El presente trabajo de investigación busca Identificar de qué manera afecta el congestionamiento causado por la demora en la disposición de mercancías en Abandono y/o inmovilizadas a los Depósitos Temporales autorizados por la SUNAT en la Intendencia Aduana Marítima del Callao, en el 2019; para ese efecto nuestro estudio se divide en cuatro (4) capítulos, los cuales son detallados a continuación: El primer capítulo se centra en el plan de investigación, por medio del cual planteamos la situación problemática, los problemas, los objetivos principales y específicos; y la formulación de la hipótesis de trabajo de la investigación. El segundo capítulo da a conocer los antecedentes de la investigación nacionales e internacionales, el marco conceptual y el análisis del sector a investigar. El tercer capítulo se centra en la metodología de la investigación, donde detallamos el tipo, propósito, categorías, delimitaciones, diseño de la investigación y tamaño de muestra. Asimismo, en este capítulo desarrollamos las entrevistas de profundidad, las cuales serán de utilidad para el recojo de información. Finalmente, el cuarto capítulo se enfoca en el análisis y discusión de resultados de nuestra investigación para así encontrar los hallazgos y realizar tanto las conclusiones como las recomendaciones finales por medio del análisis de documentos y de la información obtenida mediante las entrevistas de profundidad desarrolladas en nuestro estudio. / This research work seeks to identify how the congestion caused by the delay in the disposal of goods in Abandonment and/or immobilized in the Temporary Deposits authorized by SUNAT in the Callao Maritime Customs Administration, until 2019; therefore, our study is divided into four (4) chapters, which are detailed below. The first chapter focuses on the research plan, through which we pose the question, the problem and the objectives, both main and specific, and the formulation of the initial research hypothesis. The second chapter discloses the research background, both national and international, and the conceptual framework, and the analysis of the sector to be investigated. The third chapter focuses on the research methodology, where we detail the type, purpose, categories, delimitation, design and sample size of the research. Likewise, in this chapter we develop in-depth interviews, which will be useful for gathering information. Finally, the fourth chapter focuses on the analysis and discussion of the results of our research in order to find the findings and make both the conclusions and the final recommendations through the analysis of documents and the information obtained through the in-depth interviews carried out in our study. / Tesis