Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées au monde et est d’une importance considérable pour l’alimentation humaine, fournissant environ un cinquième des calories consommées par l’Homme. Le rendement en grain chez les céréales dépend majoritairement du nombre et de la taille des grains. Chez le riz (Oryza sativa), le gène GW2 a été isolé dans un locus à effet quantitatif majeur pour la taille et le poids du grain. Ce gène code pour une enzyme E3 ligase de type RING, qui régule négativement la taille et le poids du grain de riz. L’homologue de GW2 chez le blé tendre, le gène TaGW2, est exprimé par trois copies TaGW2-A,TaGW2-B et TaGW2-D, portées par chacun des génomes homéologues A, B et D. Les trois copies présentent des profils d’expression distincts au cours du développement du grain. TaGW2-A a été cartographié dans une région de QTLs pour le rendement, sur le chromosome 6AS ; et du polymorphisme dans sa séquence promotrice et intronique a été retrouvé associé au poids de 1000-grains dans une core collection mondiale de blé tendre. Afin de rechercher la fonction de TaGW2, l’extinction stable des trois copies TaGW2 a été entreprise par ARN interférence. De manière surprenante, les plantes transgéniques montrent des réductions significatives des dimensions et du poids du grain de blé (- 22,5 et - 30% du volume et de la masse du grain, respectivement), ainsi que du nombre de cellules de l’albumen (- 25%), comparé aux plantes témoins dans nos conditions ; suggérant que TaGW2 est un régulateur positif de la taille finale du grain chez le blé tendre. La protéine TaGW2-A a été caractérisée aux niveaux moléculaire et biochimique : elle est une E3 ubiquitine ligase fonctionnelle in vitro, et s’accumule dans la cellule au niveau du nucléole, du nucléoplasme et du cytoplasme. Sa fonction E3 ligase semble notamment influencer sa localisation subcellulaire. Afin de déterminer la ou les voie(s) de signalisation dans la(es)quelle(s) intervient TaGW2, une banque ADNc de grains de blé a été construite et criblée par double-hybride avec 320 acides aminés de la protéine TaGW2-A. Les premiers interacteurs potentiels identifiés suggèrent d’une part un rôle de TaGW2 dans la régulation de la division cellulaire, et d’autre part une fonction E3 Nedd8 ligase, en plus de son activité E3 ligase. / Wheat, Triticum aestivum, is one of the world’s major cereal crops and is of considerable importance to human nutrition, supplying one-fifth of the calories consumed by humans. For important food crops such as wheat, rice and maize, grain yield mainly depends on grain number and size. In rice (Oryza sativa), GW2 was isolated from a major quantitative trait locus for grain size and weight, and encodes an E3 RING ligase that negatively regulates these yield components. Wheat has TaGW2 homologs in A, B and D genomes; and copies show distinct expression pattern during whole grain development in wheat. TaGW2-A was mapped in a genomic region on 6AS, encompassing previous reported QTLs for yield; and polymorphisms in TaGW2-A (promoter and intron 7) were associated with thousand-grain weight, in a worldwide wheat core collection. To investigate TaGW2 function, RNA interference was used to down-regulate TaGW2 transcripts levels. Surprisingly, transgenic wheat lines significantly showed decreased grain weight and size-related dimensions, and endosperm cell number compared to controls. The present study thus suggests that TaGW2 is a positive regulator of the final grain size in wheat, conversely to GW2 in rice. Biochemical and molecular analyses of the protein TaGW2-A revealed that 1) TaGW2-A is a functional E3 ubiquitine ligase in vitro, 2) TaGW2-A accumulates in the nucleolus, the nucleoplasm, and the cytosol, 3) E3 ubiquitine ligase activity seems to impact TaGW2-A subcellular localization. To investigate the TaGW2 signalling pathway(s), cDNA library from whole wheat grains was built and screened with the bait protein TaGW2(1-320). Preliminary results from the interactomic study suggest that TaGW2 may regulate cell division. Moreover, TaGW2 may also function as an E3 Nedd8 ligase, besides its E3 ubiquitin ligase function.

Le blé est la seconde céréale la plus cultivée dans le monde et constitue un apport majeur de l’alimentation quotidienne. L’effort consenti à continuellement améliorer les qualités meunière et boulangère du blé tendre, s’est fait au détriment du caractère nutritionnel du grain. Ainsi la plupart des produits industriels dérivés des grains de blé sont produits à partir de farines blanches raffinées qui ne contiennent ni le germe ni les sons. Cependant, dans ces différents tissus qui sont éliminés et qui servent essentiellement à nourrir les animaux, se concentrent les principaux micronutriments tels que les vitamines, les minéraux, les fibres et des substances phytochimiques. Les différentes enquêtes épidémiologiques ont bien mis en évidence les conséquences négatives de la déplétion en micronutriments des produits céréaliers raffinés. Dans l’objectif d’une alimentation plus saine voir même préventive, la consommation d’aliments enrichis en micronutriments naturellement présents dans le grain de blé tendre semble être une démarche efficace. Dans cette optique, ce travail de thèse a permis de consolider et d’accroitre les connaissances concernant les voies d’amélioration des teneurs en vitamines des grains de blés tendres ainsi que des produits industriels qui en sont dérivés. En premier, nous nous sommes intéressés au développement d’une méthode simple et rapide basée sur la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide pour la détermination simultanée de sept vitamines hydrosolubles dans divers matériels végétaux. Les vitamines présentes dans les différents matériels végétaux furent séparées en moins de 15 min grâce à l’utilisation d’une colonne C18 en phase inverse, et analysées en mode ElectroSpray positif et MRM. La réponse pour toutes les vitamines a été linéaire sur l’ensemble des concentrations étudiées (0.05 to 9 μg/mL) avec des coefficients de corrélation compris entre 0.991 et 1. Les limites de quantification de la méthode analytique ont été évaluées entre 0.09 et 3.5 μg/g. Les précisions intra-journalière et inter-journalière étaient satisfaisantes. La deuxième partie de nos travaux a concerné l’impact des procédés de transformation du grain (production d’une nouvelle fraction de mouture et grillage) sur la teneur en vitamines. Afin de réaliser cette objectif, la méthode développée a été appliquée pour l’analyse simultanée des concentrations en vitamines hydrosolubles contenues dans différentes farines semi-complètes ainsi que dans les pâtons, pains et pains grillés qui en sont dérivés. En parallèle, les concentrations endogènes des vitamines E, de la Lutéine et du β-sitostérol ont également été évaluées dans le même matériel. Nous avons mis en évidence que les concentrations en acide nicotinique, pyridoxale, pyridoxine et acide pantothénique étaient significativement plus élevées dans les gros sons que dans les autres fractions de moutures, alors que les concentrations en β-sitostérol, lutéine, α-tocotriénol, α-tocophérol et thiamine (20.87 μg/g DM)étaient plus importantes dans la fraction de mouture enrichie. L’étape de grillage induit une augmentation significative en α-tocophérol (+216%), β-γ-tocophérol (+52%), α-tocotriénol (+83%), β-γ-tocotriénol (+32%), acide nicotinique (+55%), nicotinamide (+97%) et en pyridoxine (+77%). L’ensemble de ces résultats nous a permis de montrer qu’un enrichissement de farine blanche par la fraction de mouture dite enrichie pourrait potentiellement permettre d’accroître les produits qui en dérive en vitamine E. De plus le grillage pourrait libérer des composés bioactifs, augmentant ainsi leur biodisponibilité et la valeur nutritionnelle des pains. (...) / Wheat is the second largest crop cultivated around the world and constitutes a major part of the daily diet in Europe. During the course of improving the baking quality of wheat cultivar, most of the nutritional attributes have been underestimated. It is therefore unfortunate that most of wheat-based food products are mostly produced from refined white flour from which peripheral tissues (germ and envelopes) are removed. However, these tissues, which are eliminated and serve mainly for animal feeding, contain most of the vitamins, minerals, fiber and phytochemicals of the grain. It is becoming evident that many of the health benefits associated with the consumption of whole grain cereal products, relate to the enhanced intake of micronutrients, phytochemicals and dietary fiber. In the context of consuming wheat derived foods with enhanced nutritional value, as part of a healthy diet, this thesis provide results which strengthen the knowledge of vitamins accumulation in common wheat and in wheat-based food products. Firstly, we have developed a simple and rapid method based on liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the simultaneous screening of seven water soluble vitamins in various wheat-based food materials. The vitamins present in the test materials were separated in less than 15 min by using a reverse-phase C18 column, and analyzed by positive ion electrospray selected reaction monitoring MS/MS. The MS response for all the vitamins was linear over the working range (0.05 to 9 μg/mL) with correlation coefficients ranging between 0.991 and 1. Limits of quantification in the different food materials ranged from 0.09 to 3.5 μg/g. Intra-day and inter-day precision was found satisfactory. The second part of our research, have focused on monitoring the levels of vitamins upon the wheat-based foods processing operations, such as production of new wheat milling fraction (consisting in enriched fraction) and breadmaking toasted bread. In order to achieve this goal, the developed method was applied for the simultaneous analysis of the water-soluble vitamin natural content of different semi-coarse wheat flours and in their corresponding baking products. In addition the vitamin E, Lutein and β-sitosterol natural content was also measured in the same materials. It was shown that the concentration of nicotinic acid, pyridoxal, pyridoxine, pantothenic acid were significantly higher in the coarse bran than in the other milling fractions, while the concentration of β-sitosterol, lutein, α-tocotrienol, α-tocopherol and thiamin (20.87 μg/g DM) were the highest in the enriched fraction. The toasting step induced a significant increased of α-tocopherol (+216%), β-γ-tocopherol (+52%), α-tocotrienol (+83%), β-γ-tocotrienol (+32%), nicotinic acid (+55%), nicotinamide (+97%) and of pyridoxine (+77%). Furthermore, it was demonstrated that the enriched fraction could be a functional ingredient in order to enrich wheat-based products in fat soluble vitamins and that the toasting process could release bound bioactive compounds and led to enhance the nutritional quality of bread. (...)

Le blé dur (Triticum durum Desf, BD), tout comme le blé tendre (Triticum aestivum L. em Thell, BT), est une céréale très touchée par la septoriose, une maladie foliaire causée par le champignon hémibiotrophe Zymoseptoria tritici. D'une part, ce présent travail a permis d'étudier l'interaction compatible du blé-Z. tritici. L'étude de l'interaction compatible chez les pathosystèmes BD/St-08-46 et BT/TO1193 a révélé l'induction des mêmes voies de défense chez les deux pathosystèmes étudiés mais avec différentes intensités. Ensuite, l'étude de l'interaction de Z. tritici avec un cultivar résistant de blé dur a mis en évidence l'association de résistance au champignon est liée à l'inhibition de la pénétration directe, la sporulation et l'activité des enzymes fongiques de dégradation des parois cellulaires de la plante (endo-β-1,4-xylanase, endo-β-1,3-glucanase et protéase). Ces derniers sembleraient être fortement liés à la sévérité de Z. tritici aussi bien chez le dur que le blé tendre. En plus, on a pu démontrer moyennant des analyses qRT-PCR l'intervention de plusieurs gènes dans la résistance du blé dur à la septoriose à savoir les gènes PR2 (β-1,3-glucanase), Chi 4 precursor (précurseur de chitinase de la classe IV), Pox (peroxydase), Msr (méthionine sulfoxide réductase) et Bsil1 (inhibiteur de protéases). D'autre part, le potentiel des stimulateurs de défenses naturelles de plantes (SDPs) à protéger aussi bien le blé dur que le blé tendre contre les maladies fongiques a été évalué. Trois extraits naturels dont les matières actives sont l'acide ascorbique (AA), des oligosaccharides de parois cellulaires de plantes (Oligos) et algue brune (Ascophyllum nodosum, A. nod) ont été testés pour la première fois sur le blé. Leur effet antifongique (direct) ainsi que l'effet inducteur des mécanismes de défense du blé (indirecte) ont été bien caractérisés moyennant des analyses moléculaires, biochimiques et cytologiques. En effet, seul l'AA a montré un effet direct sur la germination des spores et la croissance mycélienne du Z. tritici associé à l'induction des mécanismes de défense du blé. Par contre, les protections obtenues par l'Oligos et l'A. nod semblent être exclusivement liées à leurs propriétés inductrices de la défense qui ont permis de ralentir le développement du champignon ainsi que d'inhiber l'activité des CWDEs fongiques et la sporulation. D'ailleurs, il s'est avéré que les SDPs testés sembleraient agir sur les mêmes mécanismes de défense chez les deux espèces de blé. Ils pourraient induire l'activation (i) des protéines PR, (ii) les enzymes antioxidants (peroxydase et catalase), (iii) les protéines PAL et LOX (enzymes clés de la voie des phénylpropanoides et la voie des octadécanoides, respectivement) et (iv) l'accumulation des H₂O₂ et le dépôt des polyphénols au niveau des sites de pénétration du champignon, ont été mis en évidence. Egalement, ils pourraient emprunter les mêmes voies utilisées par le cultivar résistant Salim en réponse à l'infection par le champignon et pourraient même induire une réponse plus importante des gènes de défense du blé dur tels que les gènes PR2, Pox, Msr, ATPase et Bsil. De même, deux applications (préventif et curatif) des SDPs testés a révélé une protection intéressante contre la maladie associée, dans le cas de l'A. nod et des AA, à une augmentation de la teneur en chlorophylle et l'amélioration de la quantité et de la qualité du rendement du cultivar sensible Karim. Par contre, pour le cultivar résistant Salim l'application des SDPs semble être inutile. En conclusion, l'application des SDPs au bon stade et avec les bonnes concentrations sur des cultivars sensibles pourraient aboutir à des résultats d'efficacité et rendement similaires à celles des cultivars résistants. Ainsi, elle pourrait remplacer l'utilisation des cultivars résistants, surtout avec l'absence de cultivars complètement résistants disponibles pour l'agriculteur en Tunisie. / The durum wheat (Triticum durum Desf, DW) as well as the bread wheat (Triticum aestivum L. em Thell, BW) is strongly affected by septoria leaf blotch (STB) caused by the hemibiotrophic fungus Zymoseptoria tritici. First, the present work was used to study of the compatible interaction wheat-Z-tritici. The study of the compatible interaction among pathosystems BD/St-08-46 Z-tritici strain an BT/TO1193 Z-tritici strain revealed the induction of defense pathways in both studied pathosystems, but with slight differences. Then, the study of the interaction of Z. tritici with a resistant durum wheat cultivar showed the fungus resistance of association is related to the inhibition of the direct penetration, sporulation and the avtivity of the fungal enzymes degrading plant cell walls (endo-β-1,4-xylanase, endo-β-1,3-glucanase and protease). They seem to be strongly related to the severity of Z. tritici in both BW and DW. In addition, this study revealed the involvement of several genes in the resistance of DW against Z. tritici such as PR2 genes (β-1,3-glucanase), Chi 4 precursor (precursor of Class IV chitinase), Pox (peroxidase), Msr (methionine sulfoxide reductase) and Bsil (protease inhibitor). On the other hand, the potential of resistance inducers (RIs) to protect BW and DW against STB disease was evaluated. Three natural extracts based on ascorbic acid (AA), plant cell wall oligosaccharides (Oligos) and brown algae (Ascophyllum nodosum, A. nod.) were tested for the first time on wheat. Their antifungal effect (direct) and the effect of inducing wheat defense mechanisms (indirect) have been well characterized through molecular, biochemical and cytological. We recorded that only AA exhibited a direct effect on spore germination and hyphal growth of Z. tritici associated to the induction of wheat defense mechanisms. However, conferred protection by Oligos and A. nod appears to be exclusively related to their plant defense inducing properties witch promoted the decrease of fungal CWDE activities and sporulation. Moreover, tested SDPs seem to enhance same defense pathways in both wheat species. They could induce the activation of (i) PR proteins, (ii) the antioxidant enzymes (catalase and peroxidase), (iii) the protein PAL and LOX (key enzymes of the phenylpropanoid and octadecanoid pathways, respectively) and (iv) the cytological accumulation of H₂O₂ and polyphenols, were highlighted. Also, they seem to use same pathways involved in durum wheat resistance mecanisms and may even induce a higher response of defense-related genes as PR2, Pox, Msr, ATPase, and Bsil. In general, protection conferred by tested RIs seems to be dependent on their composition, but it remains constant whatever of the wheat species. Similarly, in filed tested RIs conferred as interesting protection against STB associated, in the case of the A. nod and AA, with increased chlorophyll content and improving yield quantity and quality of the susceptible cultivar Karim, while in the resistant cultivar Salim, the application of RIs seems to be useless. In conclusion, protection conferred by tested RIs seems to be dependent on their composition, but it remains constant whatever of the wheat species. The use of RIs may improve the resistance level and yield of susceptible cultivars in order to obtain similar results to the resistant cultivars. Thus, it could replace the use of resistant cultivars especially with the lack of completely resistant cultivars available to farmers in Tunisia.

Mieux connaitre les facteurs qui gouvernent l’apparition des évènements de recombinaison (crossing-overs ; CO) chez le blé tendre (Triticum aestivum L.) est primordial car ce processus est l’outil principal du sélectionneur pour permettre le brassage de la diversité génétique et l’introgression de régions d’intérêt dans des variétés agronomiques. L’utilisation de techniques de cytogénétique développées sur l’orge a permis de comparer la mise en place de la synapse lors de la méiose chez des lignées de blé tendre délétées de tout ou partie du bras long du chromosome 3B et qui avaient été préalablement montrées comme présentant un nombre de chiasmas réduit par rapport à la variété euploïde. Les analyses cytogénétiques couplées à des études bioinformatiques de la séquence montrent que le synapsis a lieu quasiment normalement chez les mutants et que la délétion de certains gènes connus comme impactant le déroulement de la méiose pourrait expliquer le phénotype observé. De plus, le développement de ressources génomiques (SNP, séquence) à destination des sélectionneurs a permis la réalisation de cartes génétiques haute densité des 21 chromosomes ancrées sur la séquence du génome. Tous les chromosomes montrent le même profil de recombinaison avec un accroissement dans les parties distales et une réduction drastique dans les parties centromériques et péri-centromériques. L’exploitation de plus de 250 CO localisés dans des fenêtres de moins de 25 kb sur le chromosome 3B utilisé comme modèle pour l’étude de l’impact de la séquence sur la recombinaison, montre que les profils de recombinaison ancestrale et actuelle sont conservés et que les CO ont lieu préférentiellement dans les parties promotrices des gènes exprimés en méiose ce qui suggère que la conformation chromatinienne influence la recombinaison. Finalement, ces données ont aussi été l’opportunité de détecter des motifs liés à la recombinaison qui présentent des similarités avec celui ciblé par la protéine PRDM9 qui conduit à la recombinaison chez l’humain. Cela suggère que les mécanismes de contrôle de la recombinaison sont conservés chez les eucaryotes. / Better knowledge of the factors that drive recombination (crossovers; COs) in bread wheat (Triticum aestivum L.) is of main interest since this process is the main tool allowing breeders to admix the genetic diversity and to introgress regions of interest in agronomic varieties. We used cytogenetic techniques previously developed on barley to compare the establishment of synapsis during meiosis in deletion lines missing part or whole of the long arm of chromosome 3B of bread wheat and which were previously shown as having a reduced chiasmata number compared to euploid varieties. Cytogenetic analysis combined with bioinformatics studies showed that the synapsis occurs almost normally in mutants and that deletion of some genes known to impact meiosis behavior may explain the observed phenotype. In addition, development of genomic resources (SNPs, sequence) for wheat breeders allowed simultaneous elaboration of high density genetic maps for the 21 chromosomes anchored on genome sequence. All chromosomes present the same recombination pattern with an increase of recombination in the distal parts and reduction in centromeric/pericentromeric regions of the chromosomes. Analysis of more than 250 COs mapped in windows lower than 25kb located on chromosome 3B used as model to study the impact of sequence features on recombination showed that current and ancestral recombination patterns are conserved and that COs preferentially occur in the promoter part of gene expressed in meiosis suggesting that chromatin conformation impacts recombination. Finally, these data were the opportunity to detect recombination-associated motif which presents similarities with the motif targeted by the PRDM9 protein driving recombination in human. This suggests that the control of recombination mechanisms is conserved among eukaryotes.

La teneur et la composition en protéines de réserve du grain de blé tendre (Triticum aestivum L.) sont les principaux déterminants de sa valeur d’usage et de sa qualité nutritionnelle. La composition en protéines de réserve du grain est déterminée par la teneur en assimilâts azotés et soufrés par grain via des lois d’échelle qui pourraient être les propriétés émergentes de réseaux de régulation. Plusieurs facteurs de transcription intervenant dans cette régulation ont été mis en évidence, mais les voies et mécanismes impliqués sont encore très peu connus. Le constat est identique en ce qui concerne l’impact de la nutrition azotée et soufrée sur ce réseau de régulation. Le développement des outils de génomique fonctionnelle et de bioinformatique permet aujourd’hui d’aborder ces régulations de manière globale via une approche systémique mettant en relation plusieurs niveaux de régulation. L’objectif du travail présenté est d’explorer les réseaux de régulation –omiques impliqués dans le contrôle de l’accumulation des protéines de réserve dans le grain de blé tendre et leur réponse à l’approvisionnement en azote et en soufre. Une approche d’inférence de réseaux basée sur la découverte de règles a été étendue, implémentée sous la forme d’une plateforme web. L’utilisation de cette plateforme a permis de définir des sémantiques multiples afin d’inférer dans un cadre global, des règles possédant différentes significations biologiques. Des facteurs de transcription spécifiques de certains organes et certaines phases de développement ont été mis en évidence et un intérêt particulier a été apporté à leur position dans les réseaux de règles inférés, notamment en relation avec les protéines de réserve. Les travaux initiés dans cette thèse ouvrent un champ d’investigation innovant pour l’identification de nouvelles cibles de sélection variétale pour l’amélioration de la valeur technologique et de la qualité nutritionnelle du blé. Ils devraient ainsi permettre de mieux maîtriser la composition en protéines de réserve et ainsi produire des blés adaptés à des utilisations ciblées ou carencé en certaines fractions protéiques impliquées dans des phénomènes d’allergénicité et d’intolérance du gluten, ce dans un contexte d’agriculture durable et plus économe en intrants. / Grain storage protein content and composition are the main determinants of bread wheat (Triticum aestivum L.) end-use value. Scaling laws governing grain protein composition according to grain nitrogen and sulfur content could be the outcome of a finely tuned regulation network. Although it was demonstrated that the main regulation of grain storage proteins accumulation occurs at the transcriptomic level in cereals, knowledge of the underlying molecular mechanisms is elusive. Moreover, the effects of nitrogen and sulfur on these mechanisms are unknown. The issue of skyrocketing data generation in research projects is addressed by developing high-throughput bioinformatics approaches. Extracting knowledge on from such massive amounts of data is therefore an important challenge. The work presented herein aims at elucidating regulatory networks involved in grain storage protein synthesis and their response to nitrogen and sulfur supply using a rule discovery approach. This approach was extended, implemented in the form of a web-oriented platform dedicated to the inference and analysis of regulatory networks from qualitative and quantitative –omics data. This platform allowed us to define different semantics in a comprehensive framework; each semantic having its own biological meaning, thus providing us with global informative networks. Spatiotemporal specificity of transcription factors expression was observed and particular attention was paid to their relationship with grain storage proteins in the inferred networks. The work initiated here opens up a field of innovative investigation to identify new targets for plant breeding and for an improved end-use value and nutritional quality of wheat in the context of inputs limitation. Further analyses should enhance the understanding of the control of grain protein composition and allow providing wheat adapted to specific uses or deficient in protein fractions responsible for gluten allergenicity and intolerance.

Le raisonnement de la fertilisation azotée du blé a, depuis 40 ans, été largement orienté par le consensus autour de la méthode du bilan, avec comme principes fondamentaux : une nutrition azotée non limitante tout au long du cycle et l’estimation, de manière indépendante, des différents termes de l’équation du bilan pour caractériser la fourniture du sol et les besoins en azote de la plante. Au regard des enjeux de réduction des pollutions environnementales, de l’évolution des exigences qualitative du marché, ainsi que des difficultés de mise en oeuvre de la méthode, on s’interroge sur l’opportunité de renouveler ce paradigme. Pour proposer une nouvelle méthode qui réponde aux divers enjeux concernant l’azote, qui valorise au mieux les connaissances disponibles et dont la mise en oeuvre est cohérente avec les moyens des acteurs, nous avons mis en oeuvre une démarche de conception innovante, structurée en 3 étapes : un diagnostic des usages des outils actuels, une phase de conception, incluant des ateliers de conception et la mise au point de règle de décision à l’aide d’un modèle, et un test d’usage du prototype conçu.Le diagnostic des usages a mis en évidence plusieurs obstacles à la mise en oeuvre de la méthode du bilan, dont la fixation de l’objectif de rendement, ce qui a orienté la phase de conception vers l’exploration d’un concept de méthode de fertilisation azotée permettant de s’en affranchir. La méthode mise au point est basée sur le suivi régulier de l’état de nutrition azotée de la plante, l’acceptation de carences en azote non préjudiciables et des règles de décision tenant compte des conditions météorologiques au moment de l’apport. Nous montrons que la conception a rendu nécessaire la production de nouvelles connaissances, mais aussi la diversification des ressources et des compétences habituellement mobilisées. Ce travail enrichit les méthodes de conception d’outils d’aide à la décision en montrant comment l’articulation des 3 étapes permet de sortir du paradigme qui domine la fertilisation azotée depuis des décennies et d’élaborer un outil palliant les défauts des outils actuels. / Decisions about nitrogen fertilizer application on wheat have, for the last 40 years, been based on the balance sheet method, with the following underlying principles: non-limiting nitrogen nutrition throughout the crop cycle, and independent estimation of the various terms of the equation, to characterize soil nitrogen supply and plant nitrogen needs. Environmental pollution, changes in the qualitative requirements of the market and difficulties implementing this method have raised questions about whether it might be appropriate to switch to new ways of managing nitrogen fertilizer. We developed a new method meeting the diverse constraints relating to nitrogen use, making the best use of available knowledge and easily applicable by users, through a 3-steps innovative design approach: a diagnosis of the use of current tools, a design phase including design workshops, production of new knowledge, a modelbased prototyping, and the testing of a prototype method.The diagnosis of uses identified several barriers to the implementation of the balance sheet method, including the need to set a target yield. This directed the design phase towards the exploration of new ways of managing nitrogen fertilizer that did not require the fixing of a target yield. The method developed is based on the regular monitoring of plant nitrogen nutrition, the toleration of periods of nitrogen deficiency that are not prejudicial and the use of decision rules taking weather conditions at the time of nitrogen application into account.This design required the generation of new knowledge and a diversification of the resources and skills usually mobilized. This work enriches the methods for designing decision support tools and shows how a combination of 3 steps can be used to develop a tool for managing nitrogen fertilizer applications completely different from the dominant paradigm of the last 40 years, and compensating the defects of current methods.