In this project a number of peptidyl transferase antibiotics were studied, specifically a group of aminohexose cytosine nucleoside antibiotics and their interaction with a selected number of highly conserved ribonucleic acid (RNA) motifs, designed to represent their possible binding site within the ribosome. This group of antibiotics shows a wide range of interesting properties, including antiviral and anti-tumour activity, and as they bind to a particularly conserved region in the ribosome, they are likely to be difficult for microorganisms to develop resistance to. It is hoped that once the mechanism of action of these antibiotics is better understood, that modifications to the antibiotics can be effectively made to create new or hybrid antibiotics with more selective antibacterial, or indeed antiviral or anti-tumour properties. The nuclear magnetic resonance (NMR) structure of the RNA binding, peptidyl tranferase inhibitor antibiotics amicetin, blasticidin S and gougerotin, in their native solution states, have been successfully determined. The structures all exhibit a stable conformation, stabilised by intramolecular hydrogen bonds. Amicetin was observed to be folded, distinctly different from the linear, extended conformation of amicetin previously determined by X-ray crystallography. The structure of blasticidin S was found to be very similar to its X-ray crystal structure. Gougerotin was shown to form a similar conformation to blasticidin S, save that the end chain of gougerotin was bent at right angles to the rest of the molecule, forming a structure similar to that of the major bound X-ray crystal structure of blasticidin S. All the solution structures showed a similar conformation in the analogous regions of their chemical structure, suggesting that hybrid antibiotics could be produced.Two highly conserved RNA motifs of Halobacterium halobium (H. h.) and Escherichia coli (E. coli) 23S ribosomal RNAs were chosen to investigate their interaction with amicetin. The NMR structure of the H. h. and E. coli. 29-mer RNA motifs have been determined; the motifs both form well folded A-form RNA conformations. The E. coli NMR structure differs from the X-ray crystal structure of the motif contained within the ribosome, as a highly conserved adenine residue, which resides in a bulge strongly implicated with amicetin binding, folds into the helix as opposed to being flipped out. Instead, an adjacent cytosine residue partially flips out; whereas in the crystal structure, it is folded within the helix. The NMR stuctures of the H. h. motif differs from the X-ray crystal structure of the motif, contained within the ribosome, as none of the bases are flipped out and a number of non-canonical base pairs are formed in the solution structure. To continue this study, a fully 13C and 15N isotopically labelled version of the H. h. RNA sample has been partially assigned, and an initial structure determination has been performed, using ultra high field 1 GHz spectroscopy.Addition of amicetin to both the H. h. and E. coli 29-mer RNA samples were accompanied by discrete changes to the spectra, suggesting weak interaction between the two components. These can be qualitatively interpreted to changes induced in the local conformation of the RNA motifs and the amicetin arising from the formation of a complex, between the amicetin and the bulge region of the particular motif.

Τα ριβοσώματα, οι μακρομοριακές μεταφραστικές μηχανές που είναι υπεύθυνες για την πρωτεϊνική σύνθεση, αποτελούν έναν από τους κυριότερους κυτταρικούς στόχους των αντιβιοτικών, που χορηγούνται για αντιμικροβιακή θεραπεία. Μελέτες για περισσότερο από 40 χρόνια δείχνουν ότι το κατάλληλο ιοντικό περιβάλλον (μονοσθενή, δισθενή κατιόντα και πολυαμίνες) είναι απαραίτητο για τη σωστή ριβοσωματική λειτουργία, ενώ παράλληλα επηρεάζει τις αλληλεπιδράσεις του με διάφορους προσδέτες. Παρόλα αυτά η μοριακή βάση της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος στο μηχανισμό δράσης των αντιβιοτικών δεν έχει ενδελεχώς μελετηθεί. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση σε συνθήκες που προσομοιάζουν με τις φυσιολογικές του κυττάρου και η μελέτη της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση αυτών. Τα αντιβιοτικά που μελετήθηκαν ήταν: α) η βλαστισιδίνη, ως κλασικός αναστολέας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (ΡΤάσης), β) το μακρολίδιο τυλοσίνη που αναστέλλει την ΡΤάση, αλλά παράλληλα προσδένεται στην αρχή του τούνελ εξόδου και παρεμποδίζει την πολυπεπτιδική αλυσίδα να εξέλθει από το ριβόσωμα, και γ) τα μακρολίδια ερυθρομυκίνη (πρώτης γενεάς), αζιθρομυκίνη (δεύτερης γενεάς) και τελιθρομυκίνη (μακρολίδιο τρίτης γενεάς ή κετολίδιο), η δράση των οποίων έγκειται στην παρεμπόδιση του τούνελ εξόδου. Εξίσου σημαντική φαίνεται να είναι η επίδραση των μακρολιδίων στη συγκρότηση της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας. Ο μηχανισμός δράσης των αντιβιοτικών και η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση τους έγινε αρχικά με κινητικές μελέτες. Το πειραματικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε ήταν η αντίδραση πουρομυκίνης, η οποία μας έδωσε τη δυνατότητα τιτλοδότησης των ενεργών ριβοσωμάτων. Βάσει αυτού μελετήθηκαν τα αντιβιοτικά βλαστισιδίνη και τυλοσίνη που αναστέλλουν άμεσα την ΡΤάση, ενώ για τη μελέτη των υπολοίπων μακρολιδίων διεξήχθησαν πειράματα συναγωνιστικής αναστολής. Ως γνωστό, τα μακρολίδια ερυθρομυκίνη, αζιθρομυκίνη και τελιθρομυκίνη μοιράζονται κοινές θέσεις πρόσδεσης στο ριβόσωμα με την τυλοσίνη. Έτσι, για την εύρεση των σταθερών πρόσδεσης αυτών στο ριβόσωμα έγινε συναγωνισμός με τυλοσίνη. Τα πειράματα συναγωνισμού πραγματοποιήθηκαν, επωάζοντας το ριβόσωμα με μείγμα μακρολιδίου και τυλοσίνης, και τιτλοδοτώντας την απομένουσα δραστικότητα του ριβοσώματος με την αντίδραση πουρομυκίνης απομακρύνοντας την περίσσεια αντιβιοτικών. Σε παράλληλα πειράματα, το ριβόσωμα προεπωάστηκε αρχικά με το μακρολίδιο και στη συνέχεια προστέθηκε τυλοσίνη, η οποία ανιχνεύει το εναπομείναν ριβοσωματικό σύμπλοκο. Επειδή η σταθερά συγγένειας στη δεύτερη περίπτωση βρέθηκε μικρότερη (ισχυρότερη πρόσδεση αντιβιοτικού) συμπεράναμε, ότι ο μηχανισμός πρόσδεσης του αντιβιοτικού είναι βραδύς και ακολουθεί δυο στάδια. Βασιζόμενοι στις τιμές των σταθερών συγγένειας σε πειράματα αναγέννησης του ριβοσωματικού συμπλόκου από την απενεργοποιημένη μορφή του, προσδιορίστηκαν ξεχωριστά όλες οι κινητικές παράμετροι που χαρακτηρίζουν την πρόσδεση του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα. Συγκρίναμε τις παραμέτρους αυτές και γενικότερα την ισχύ πρόσδεσης των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα σε πέντε ιοντικές συνθήκες: (α) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, (β) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 100 μΜ σπερμίνη, (γ) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 50 μΜ σπερμίνη και 2 mM σπερμιδίνη, (δ) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+ ριβοσωματικό σύμπλοκο φωτοσημασμένο με 100 μΜ ΑΒΑ-σπερμίνη, και (ε) 10 mM Mg2+, 100 mM NH4+. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πολυαμίνες βελτιώνουν την πρόσδεση της βλαστισιδίνης, αλλά μειώνουν την πρόσδεση των μακρολιδίων. Η επίδραση των ιόντων Mg2+ προσομοιάζει εκείνης των πολυαμινών, αλλά είναι λιγότερο αποτελεσματική, αφού 100 μΜ σπερμίνης επιφέρουν μεγαλύτερη αναστολή πρόσδεσης, από ότι 10 mM Mg2+. Για να ερμηνευτεί σε μοριακό επίπεδο η επίδραση της σπερμίνης στη συγγένεια των αντιβιοτικών έναντι του ριβοσώματος, οι θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών στο ριβόσωμα προσδιορίστηκαν με φωτοσήμανση συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Οι θέσεις αυτές αποκάλυψαν ότι οι πολυαμίνες προσδένονται σε γειτονικές θέσεις προς τα αντιβιοτικά, επηρεάζοντας την τοπική διαμόρφωση και το φορτίο. Επιβεβαίωση του μηχανισμού δράσης και της επίδρασης των πολυαμινών έγινε με ανάλυση αποτυπώματος. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, τα μακρολίδια προσδενόμενα στο ριβόσωμα προστατεύουν ορισμένα νουκλεοτίδια από την επίδραση χημικών τροποποιητών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αντιβιοτικά διέρχονται μια ενδιάμεση κατάσταση πρόσδεσης στο ριβόσωμα δεσμευόμενα αρχικά στην είσοδο του τούνελ εξόδου και στη συνέχεια εισχωρώντας βαθύτερα σε αυτό. Η φύση της ενδιάμεσης κατάστασης εξαρτάται από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του κάθε μακρολιδίου. Η επίδραση των πολυαμινών στο μηχανισμό πρόσδεσης ελέγχθηκε επαναλαμβάνοντας τα πειράματα χημικής προστασίας παρουσία αυτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μείωση της πρόσδεσης των μακρολιδίων στο ριβόσωμα επιτελείται κυρίως μέσω της επίδρασης των πολυαμινών στη δέσμευση του υδρόφοβου λακτονικού δακτυλίου. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του κάθε αντιβιοτικού επηρεάζουν ποικιλοτρόπως το μέγεθος της επίδρασης αυτής. Στο τελευταίο κομμάτι της διατριβής μελετήθηκε η ισχύς των μακρολιδίων, υπολογίζοντας την αναστολή που προκαλούν στο συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης του γονιδίου της GFP πρωτεΐνης, και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα κινητικά δεδομένα πρόσδεσης των μακρολιδίων στο ριβόσωμα-στόχο. Σε υψηλή συγκέντρωση ιόντων Mg2+ η τυλοσίνη έχει μεγαλύτερη ισχύ, ενώ σε χαμηλή συγκέντρωση ιόντων απουσία ή παρουσία πολυαμινών η αζιθρομυκίνη. Η τελιθρομυκίνη παρουσίασε τη χαμηλότερη ισχύ πρόσδεσης στο ριβόσωμα και αναστολής της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Επιπρόσθετα, ελέγχθηκε πιθανή επίδραση των μακρολιδίων στην πρόσδεση των υποστρωμάτων (tRNAs) στην Α-, Ρ- και Ε- θέση του ριβοσώματος, στη μετατόπιση αυτών από την Α- στην Ρ- θέση και στη μεταφραστική πιστότητα του ριβοσώματος. Βρήκαμε ότι τα μακρολίδια δεν μπορούν να επηρεάσουν αυτά τα στάδια της ριβοσωματικής λειτουργίας. / Ribosomes, the macromolecular translating machines responsible for protein biosynthesis, are the most common targets for many antibacterial agents. Experiments for more than 40 years have demonstrated that a distinct ionic environment (monovalent, divalent cations and polyamines) is essential for ribosomal functions and their interactions with the ligands. Nevertheless, the molecular basis of the ionic environment’s influence on antibiotic mechanism of action has never been precisely elucidated. The aim of this thesis was first to investigate the mechanism of action of several antibiotics –inhibitors of protein synthesis, under ionic conditions close to the cell environment and second, to clarify the role of the ionic environment on their mechanism of action. The antibiotics studied were: a) blasticidin-S, a classic inhibitor of peptidyl tranferase (PTase) activity, b) tylosin which inhibits PTase, but in parallel binds at the entrance of exit tunnel and blocks the passage of the nascent polypeptide chain, and c) erythromycin (a first generation macrolide), azithromycin (a second generation macrolide), and telithromycin (a third generation macrolide, ketolide), that blocks the exit tunnel. The mechanism of action of antibiotics and the influence of ionic environment on antibiotic potency was studied primarily with kinetic methods. The experimental procedure was based on the puromycin reaction, performed under conditions allowing the estimation of the catalytic rate constant. Using this experimental approach we studied the mechanism of action of blasticidin and tylosin which directly inhibit PTase. For studying the other macrolides, experiments employing competitive kinetics were performed. Erythromycin, azithromycin and telithromycin share common binding sites on ribosomes with tylosin. Thus, to estimate the kinetic constants of their interactions with ribosomes, competitive kinetic experiments were carried out in the presence of tylosin. Namely, a posttranslocation ribosomal complex formed from Escherichia coli 70S ribosomes bearing tRNAPhe at the E-site and AcPhe-tRNA at the P-site (complex-C) was incubated with a mixture of each macrolide and tylosin for the desired time intervals. The rest of ribosomal activity was titrated by the puromycin reaction. In parallel experiments, complex-C was pre-incubated with each one of the macrolides and then reacted with tylosin. The rest of complex-C activity was again titrated with the puromycin reaction. Since the affinity constant obtained by the second series of experiments was less than that obtained by the first series of experiments, we concluded that the mechanism of action of antibiotics follows a slow onset inhibition process, which includes two steps. Based on secondary plots and on kinetic plots derived from regeneration of complex-C, we measured the kinetic parameters participating in the kinetic model. Thus, the potency of each antibiotic was determined under five different ionic conditions: (a) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, (b) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 100 μΜ spermine, (c) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 50 μΜ spermine and 2 mM spermidine, (d) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, and ribosomal complex photolabelled with 100μΜ ΑΒΑ-spermine, and (e) 10 mM Mg2+, 100 mM NH4+. Processing of the data led us to the conclusion that polyamines and Mg2+ ions increase the potency of blasticidin, but decrease the potency of macrolides. To explain the diverse action of polyamines and of the ionic environment in general on antibiotic potency, the binding sites of spermine in ribosomes were localized by photoaffinity labeling, using a photoactive analogue of spermine, ABA-spermine. These experiments revealed that polyamines bind at the vicinity of antibiotics, influencing the ionic charge and the local conformation of rRNA. Confirmation of the macrolide mechanism of action and verification of the influence of polyamines on their potency was achieved by footprinting analysis. According to this technique, macrolides bind to ribosomes and protect specific nucleotides from modification by chemical reagents like DMS, CMCT and kethoxal. The results demonstrated that the antibiotics (I) form an encounter complex with complex-C (CI), in which the antibiotics occupy the entrance of the exit tunnel. This intermediate complex is then isomerized slowly to a tighter complex (C*I) with which antibiotics move deeply in the exit tunnel. The exact interactions stabilizing the intermediate complex depend on the characteristic groups of each macrolide. The influence of polyamines was checked by repeating the experiment in the presence of polyamines. The results showed that polyamines reduce the macrolide binding to ribosomes, by affecting mainly the interactions of the hydrophobic lactone ring with the ribosome. The special characteristic groups of each macrolide affect the polyamine action. The potency of macrolides action was also estimated using a coupled transcription-translation system for GFP expression. The results obtained were consistent with those produced by kinetic analysis. In addition, we check for possible macrolide effects on tRNA binding at the A-, P- and E- sites of the ribosome, on translocation, and on translational fidelity. No strong effects were identified excluding the macrolide from these ribosomal functions.