Aufgabe dieser Arbeit war es zu klären, welche morphologischen Besonderheiten es bei den Blutzellen der untersuchten Spezies gibt und diese zu beschreiben. Im Ergebnis der Arbeit wird ein Atlas zur lichtmikroskopischen Morphologie der Blutzellen von 19 ausgewählten herbivoren Zootierarten vorgelegt. / The major goal of this work was to investigate and categorise the special morphological features of blood cells drawn from nineteen herbivorous animals species. As a result of the investigations an atlas will be presented to this area of research, including a comprehensive catalogue of the light microscopic morphology of animal blood cells; herewith offering an important tool for actual research projects in the field of clinical diagnostics.

Introduction: The intracellular protozoan Toxoplasma gondii is a uniquely successful parasite that globally exploits a wide host range encompassing essentially all warm-blooded animals including both mammalian and avian species. Felidae are the only definitive hosts in the facultative heteroxenous life cycle. Pathogenesis of T. gondii infection has been studied mainly in mammals. There is only rare information on the immune reaction in chickens although birds are known to be important hosts. Considering that the host’s peripheral blood cells serve as target and thus interact with the intracellular parasite during distribution in the infected host, invasion and intracellular replication of the tachyzoites of T. gondii in different mononuclear cell populations isolated from chicken peripheral blood (erythrocytes, thrombocytes, monocyte-derived macrophages (MM)) were studied. Objectives: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), namely thrombocytes and erythrocytes as well as MM were characterized concerning their capability to host T. gondii. Primary cell infection models were established in order to assess parasite replication. In MM two different strains, ME49 (strain type II) and NED (strain type III), were compared for their replication rate. Cellular response to infection with ME49 was studied in primary MM. Furthermore, the response of the primary macrophages to infection with the ME49 strain was observed by evaluation of gene expression of IL-1ß, IL-12p40, Lipopolysaccharide induced TNF-α factor (LITAF) and inducible nitric oxide synthase (iNOS). Gene transcription data were normalized to those of GAPDH and G6PDH. Parasite replication as well as the fold change of cytokines were statistically evaluated. Results: Primary cultures containing at least 80 % of the respective target cells and suitable for long-term observations were produced by the procedures established in the current study. It was demonstrated that cultivation at 40°C (representing the physiological body temperature in chickens) and using of primary avian cells instead of mammalian cell lines such as Vero or HD11 as host cells distinctly affected parasite replication. T. gondii tachyzoite numbers significantly increased in MM (300 percent at 48 h p.i., ME49) during long-term investigation over 72 h but with initial and final decrease. In comparison, the number of parasite stages increased 1000 percent in Vero and 300 percent in HD11 by only robust increases (ME49), respectively. In contrast, the number of parasite stages significantly decreased in primary erythrocytes and thrombocytes down to less than 20 percent not increasing again. No significant differences were detected between strain type II (ME49) and III (NED) regarding their replication potential in MM. The mRNA expression for cytokines and iNOS of MM infected with viable ME49 tachyzoites was significantly different from uninfected MM and MM incubated with heat-inactivated ME49 tachyzoites. Especially at 8 to 24 h p.i., parasite replication coincided with upregulation of gene expression (IL-1ß, LITAF, iNOS) in infected MM. For infection with heat-inactivated tachyzoites, mRNA regulation increased directly after infection with subsequent decrease between 4 to 12 h p.i. and in this entirely, level of fold change for IL-1 ß was significantly higher (5 times as high), but lower for iNOS (approximately half). In comparison, mRNA upregulation of IL-12p40 was delayed for both with only one peak for infection with heat-inactivated tachyzoites at 8 h p.i., but repeated increase (8, 24, 36 h p.i.) for viable ME49 being in total almost twice as high (at 36 h p.i.). Conclusion: Primary chicken MM are a suitable host cell system to study immune reaction to T. gondii tachyzoite infection, while erythrocytes and thrombocytes are not supporting parasite replication. Avian MM are likely an important vehicle for distributing the parasite from blood vessels into different organs and thus promote infection. In addition to this putative Trojan horse function, MM react to pathogen invasion by pro-inflammatory upregulation of IL-1ß, IL-12p40, LITAF and iNOS. Activation of these mediators points to contribution of MM to immunity against T. gondii in chicken. These seemingly contradictory findings during T. gondii infection of MM needs further investigation. It was hypothesized that nucleated avian erythrocytes and thrombocytes might also serve as host cells, however, no parasite replication could be demonstrated in these cells. Nevertheless, they may though play a role in the progress and systemic distribution of infection which should be investigated in more detail.:1 INTRODUCTION ............................................................................... 1 1.1 TOXOPLASMA GONDII................................................................................... 1 1.1.1 Structures and life cycle .............................................................................. 1 1.1.2 Life cycle .................................................................................................... 3 1.1.3 Genotypes.................................................................................................. 4 1.2 ZOONOSIS .................................................................................................... 5 1.3 RELEVANT DIFFERENCES OF AVIAN SPECIES FROM MAMMALS AS IH ..... 7 1.4 T. GONDII INFECTION IN CHICKENS ............................................................. 8 1.5 AIMS AND FOCUSES OF THIS STUDY .......................................................... 9 2 RESULTS........................................................................................ 10 2.1 1 ST PUBLICATION ...................................................................................... 10 2.2 2ND PUBLICATION ....................................................................................... 19 2.3 3RD PUBLICATION: ...................................................................................... 29 3 DISCUSSION .................................................................................. 38 3.1 ESTABLISHMENT OF PRIMARY BLOOD CELL CULTURES ......................... 38 3.2 CHICKEN ERYTHROCYTES AND THROMBOCYTES.................................... 40 3.3 MONOCYTE-DERIVED MACROPHAGES (MM) ............................................ 41 3.4 T. GONDII STRAIN DIVERSITY .................................................. .................. 44 3.5 PRIMARY CELLS AS A TOOL FOR T. GONDII RESEARCH ......................... 46 3.6 OUTLOOK..................................... ............................................................... 47 3.7 CONCLUSIONS ............................................................................................ 48 4 SUMMARY........................................................................ .............. 49 5 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................ .......... 51 6 REFERENCE LIST................................................................ .......... 53 / Einleitung: Der intrazellulär-lebende Protozoe Toxoplasma gondii ist einzigartig erfolgreich. Er nutzt weltweit eine große Bandbreite verschiedener Wirtsspezies, zu denen im Wesentlichen alle warmblütigen Tiere, vor allem Säugetiere und Vögel, zählen. Feliden sind die alleinigen Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus. Die Pathogenese der T. gondii-Infektion wurde hauptsächlich im Säugetier betrachtet. Über die Immunantwort im Huhn gibt es nur wenige Informationen, obwohl Vögel als Wirtsspezies eine große Bedeutung haben. Wegen der Schlüsselrolle, welche den peripheren Blutzellen des Wirtes im Verlauf der Infektion hinsichtlich der Verteilung des eindringenden Parasiten im Wirt zukommt, wurden Invasion und Vermehrung von T. gondii-Tachyzoiten in verschiedenen mononukleären Zellpopulationen (Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten-abstammende Makrophagen (MM)) betrachtet. Ziele der Arbeit: Periphere mononukleärer Blutzellen (PBMCs), im Detail Erythrozyten, Thrombozyten und MM, sollten hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit für T. gondii charakterisiert werden. Zur Prüfung der Parasitenvermehrung wurden Infektionsmodelle mit Primärzellen etabliert. In MM wurden zudem zwei verschiedene Stämme (ME49, Typ II und NED, Typ III) in ihrer Replikationsrate verglichen und die zelluläre Immunantwort (ME49) untersucht. Die Immunantwort der MM wurde mittels Genexpressionsanalyse von IL-1 ß, IL-12p40, Lipopolysaccharid-induzierter TNF-α Faktor (LITAF) und der induzierbaren Stickstoffmonooxid-Synthase (iNOS) untersucht und die Infektion lebender mit Hitze-inaktivierten Tachyzoiten (ME49) verglichen (über 36 h p.i.). Die Transkription der Zielgene wurde gegen GAPDH und G6PDH normalisiert und diese Daten sowie die der Parasitenvermehrung statistisch evaluiert. Ergebnisse: Die hier entwickelten Methoden resultieren in Primärzellkulturen mit ausreichender Reinheit (Anteil Zielzellen ≥ 80 Prozent) und Verwendbarkeit. Die Bedeutung von 40°C (physiologische Körpertemperatur Huhn) als Kultivierungstemperatur sowie der Verwendung von Primärzellen anstatt immortalisierter Zelllinien (Vero, HD11) für die Parasitenvermehrung von T. gondii konnten gezeigt werden. Der signifikante Anstieg der Tachyzoitenzahl in MM über 72 h Betrachtung (etwa 300 Prozent 48h p.i., ME49) war begleitet von initialem und finalem Abfallen. Im Vergleich dazu haben Vero-Kulturen (1000 Prozent Vermehrung, ME49) und HD11 (300 Prozent Vermehrung, ME49) einen linearen Anstieg. Infizierte Erythrozyten und Thrombozyten zeigen im Gegensatz zu MM einen signifikanten Abfall (≤ 20 Prozent bei 12 h p.i.) der Parasitenstadien ohne erneuten Wiederanstieg. In MM wurden für die beiden untersuchten Tachyzoiten-Stämme (ME49, NED) keine signifikanten Unterschiede in der arasitenvermehrung festgestellt. Die Genexpressionsanalyse der Zytokine und iNOS zeigte im Vergleich signifikante Unterschiede zwischen uninfizierten bzw. mit Hitze-inaktivierten Tachyzoiten infizierten MM zu den mit lebenden Stadien infizierten MM. Insbesondere im Zeitraum 8 bis 24 h p.i. überschneiden sich diese Feststellungen zur Hochregulation der Genexpression (IL-1 ß, LITAF, iNOS) mit der detektierten Parasitenvermehrung in lebend-infizierten MM. Hitze-inaktivierte Tachyzoiten steigern die Genexpression direkt nach der Infektion mit anschließendem Abfall (4 bis 12 h p.i.), wobei im Vergleich für IL-1 ß ein signifikant höherer Anstieg (5 facher fold change), aber ein deutlich niedrigerer für iNOS (etwa halber fold change) festgestellt wurde. Die Regulation von IL-12p40 war verspätet mit nur einem Anstieg (8 h p.i.) bei Infektion mit Hiltze-inaktivierten Tachyzoiten, aber wiederholtem Anstieg (8, 24, 36 h p.i.) bei lebenden ME49 (etwa zweifacher fold change). Schlussfolgerungen: Primäre Hühner-MM sind als Wirtszell-System im Infektionsversuch mit T. gondii-Tachyzoiten gut geeignet für Studien zur Immunantwort. Im Gegensatz dazu sind Erythrozyten und Thrombozyten durch fehlende Parasitenvermehrung ungeeignet. Die Empfänglichkeit der MM für Tachyzoiten weist auf Ihre besondere Bedeutung im Verlauf der Verbreitung des Parasiten im Wirtsorganismus hin. Unabhängig von dieser Funktion als Trojanisches Pferd sind MM gleichzeitig von Bedeutung für die Vermittlung der Immunantwort, wie die Hochregulation von IL-1 ß, IL-12p40, LITAF and iNOS als Mediatoren einer proinflammatorischen Aktivierung zeigen. Diese zunächst gegensätzlich erscheinenden Erkenntnisse benötigen weitere Betrachtung. Darüber hinaus sollte die Bedeutung von Erythrozyten und Thrombozyten für den Verlauf der T. gondii-Infektion im Wirt trotz fehlender Wirtszelleignung genauer untersucht werden.:1 INTRODUCTION ............................................................................... 1 1.1 TOXOPLASMA GONDII................................................................................... 1 1.1.1 Structures and life cycle .............................................................................. 1 1.1.2 Life cycle .................................................................................................... 3 1.1.3 Genotypes.................................................................................................. 4 1.2 ZOONOSIS .................................................................................................... 5 1.3 RELEVANT DIFFERENCES OF AVIAN SPECIES FROM MAMMALS AS IH ..... 7 1.4 T. GONDII INFECTION IN CHICKENS ............................................................. 8 1.5 AIMS AND FOCUSES OF THIS STUDY .......................................................... 9 2 RESULTS........................................................................................ 10 2.1 1 ST PUBLICATION ...................................................................................... 10 2.2 2ND PUBLICATION ....................................................................................... 19 2.3 3RD PUBLICATION: ...................................................................................... 29 3 DISCUSSION .................................................................................. 38 3.1 ESTABLISHMENT OF PRIMARY BLOOD CELL CULTURES ......................... 38 3.2 CHICKEN ERYTHROCYTES AND THROMBOCYTES.................................... 40 3.3 MONOCYTE-DERIVED MACROPHAGES (MM) ............................................ 41 3.4 T. GONDII STRAIN DIVERSITY .................................................. .................. 44 3.5 PRIMARY CELLS AS A TOOL FOR T. GONDII RESEARCH ......................... 46 3.6 OUTLOOK..................................... ............................................................... 47 3.7 CONCLUSIONS ............................................................................................ 48 4 SUMMARY........................................................................ .............. 49 5 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................ .......... 51 6 REFERENCE LIST................................................................ .......... 53

Aufgabe dieser Arbeit war es zu klären, welche morphologischen Besonderheiten es bei den Blutzellen der untersuchten Spezies gibt und diese zu beschreiben. Im Ergebnis der Arbeit wird ein Atlas zur lichtmikroskopischen Morphologie der Blutzellen von 19 ausgewählten herbivoren Zootierarten vorgelegt. / The major goal of this work was to investigate and categorise the special morphological features of blood cells drawn from nineteen herbivorous animals species. As a result of the investigations an atlas will be presented to this area of research, including a comprehensive catalogue of the light microscopic morphology of animal blood cells; herewith offering an important tool for actual research projects in the field of clinical diagnostics.