Orientadores: Pedro Luiz Rosalen, Gilson Cesar Nobre Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-20T03:41:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_MyrellaLessio_D.pdf: 7863585 bytes, checksum: 6484dfc8b0f427513cefc0ed74f00801 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Periodontite é a doença multifatorial que envolvem interações entre algumas espécies bacterianas, como Porphyromonas gingivalis W83 e células do hospedeiro. Levando a uma resposta imuno-inflamatória que causa a destruição do tecido ósseo e gengival Neste contexto, fármacos com a habilidade de modular este processo imuno-inflamatório podem auxiliar no tratamento da doença periodontal (DP). A doxiciclina em dose subantimicrobiana (DDS), apresenta propriedades anti-inflamatórias pela sua atuação em algumas vias da inflamação. No entanto, ainda é discutido o efeito desta terapia dobre a susceptibilidade bacteriana por longo tempo. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da DDS como um modulador da resposta imuno-inflamatória do hospedeiro na DP induzidas em ratos e avaliar a susceptibilidade da P. gingivalis cultivadas com DDS por longo tempo. A DP foi induzida em ratos Wistar machos (SPF) submetidos à colocação de ligadura em torno dos primeiros molares inferiores foram randomizados e divididos em 3 grupos experimentais (n=10 animais/grupo/experimento): 1) grupo controle: ratos sem ligadura e sem tratamento; 2) grupo ligadura: ratos com ligadura e tratados com solução NaCl 0,9 %) e 3) grupo ligadura + DDS: ratos com ligadura e tratados com a DDS (5 mg/kg/dia). No tecido gengival, extraídos de animais tratados por 3 dias, foram avaliadas as expressões gênicas de TNF-'alfa' IL-1' beta', IL-17 e PAR2 através de RTPCR. As mandíbulas dos ratos tratados por 15 dias foram usadas para mensuração da reabsorção óssea alveolar (coradas com Hematoxilina e Eosina) e da quantidade de fibras colágenas (coradas com Picrosirius- Vermelho). Para a análise microbiológica, a P. gingivalis (ATCC BAA-308) foi cultivada por 3 meses (45 gerações) em meio de cultura contendo 0,4 ug/mL de DDS e avaliada por meio de concentração inibitória mínima (CIM) para Amoxiciclina, Doxiciclina e Metronidazol. A DDS inibiu significativamente os níveis de RNAm do tecido gengival para os IL-1' beta', IL-17, TNF-'alfa' e PAR2 (P<0,05, ANOVA, teste Tukey). Além disso, a DDS reduziu a perda óssea quando comparada ao grupo ligadura (P<0,05 ANOVA, teste Tukey) e manteve a porcentagem de fibras colágenas com níveis similares ao grupo controle (P>0,05). Na análise da susceptibilidade de P. gingivalis a DDS não apresentou resistência multi-antibiótica para esta cepa, entretanto, houve uma alteração nos valores de CIM para todos antibióticos testados com a P. gingivalis crescida ao longo do tempo. Em conjunto, os dados demonstram que a DDS diminuiu a resposta inflamatória, a reabsorção óssea e a degradação de colágeno no modelo utilizado de DP, indicando sua atividade como moduladora da resposta do hospedeiro na DP. A alteração microbiana com o uso contínuo e de longo período de DDS modificou a sensibilidade da P. gingivalis, entretanto não desenvolveu resistência antibiótica a doxiciclina / Abstract: Periodontitis is a multifactorial disease involving interactions between some bacterial species, as Porphyromonas gingivalis W83, and host cells. Leading to an immune-inflammatory response that causes the destruction of bone and gingival. In this context, drugs with the ability to modulate immuno-inflammatory process that may aid in the treatment of periodontal disease (PD). Doxycycline dose subantimicrobiana (DDS) has anti-inflammatory properties because of its role in some pathways of inflammation. However, it is still discussed the effect of this therapy fold the bacterial susceptibility for a long time. The objective of this study was to analyze the effects of DDS as a modulator of the immune-inflammatory response in the host DP induced in rats and to evaluate the susceptibility of P. gingivalis grown with DDS for a long time. The DP was induced in male Wistar rats (SPF) submitted of ligature around the first molars and divided into three experimental groups (n = 10 animals/group/experiment): 1) control group: rats without ligature and without treatment; 2) ligature group: rats with ligature and treated with 0.9% NaCl solution and 3) ligature + SDD group: rats with ligature and treated with SDD (5 mg/kg/day). In gingival tissue, extracted from animals treated for 3 days, we assessed the gene expression of TNF-'alpha', IL-1'beta', IL-17 and PAR2 by RT-PCR. The jaws of rats treated for 15 days were used for measurement of alveolar bone resorption (stained with Hematoxylin and Eosin) and collagen fibers (stained with Picrosirius-Red). For microbiological analysis, P. gingivalis was grown for 3 months (45 generations) in culture medium containing 0.4 ug/mL of SDD and evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC). SDD significantly inhibited mRNA levels of the gingival tissue for IL-1'beta', IL-17, TNF-'alpha' and PAR2 (p<0.05, ANOVA, Tukey test). In addition, SDD has reduced bone loss when compared to the ligature group (p<0.05 ANOVA, Tukey test) and also maintained the percentage of collagen fibers at levels similar to the control group (p> 0.05). In the analysis of susceptibility to P. gingivalis SDD showed no multi-antibiotic resistance for this strain, however, there was a change in the MIC values for all antibiotics tested with P. gingivalis growth to long-time. Together, these data demonstrate that SDD reduced the inflammatory response, bone resorption and collagen degradation in PD, indicating its activity as a modulator of the host response in PD. Furthermore, SDD affected the sensitivity of P. gingivalis, however not developing antibiotic resistance with 3 months therapy / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

O objetivo do atual trabalho, foi correlacionar os eventos celulares e teciduais com a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG durante a osteogênese ectópica e ortotópica, induzida pela matriz óssea (MO) e dentinária (MD) alogênica. Matrizes alogênicas desmineralizada em HCl a 0,6N, obtidas de fêmur e incisivo de ratos, fori implantada entre as fáscias musculares da coxa e em defeito trans-ósseo de 8mm de diâmetro nos ossos parietais. As análises radiográfica e histomorfométrica da neoformação óssea e, a imunohistoquímica e o western blotting para as proteínas VEGF, BMP, RANKL e OPG, mostraram que: a) o volume da região do enxerto nos sítios ortotópicos reduziu 19% em 42 dias; b) em ambos tipos de enxerto e locais de implantação, ocorreu formação de tecido cartilaginoso e ósseo; c) nos sítios intramusculares, a reabsorção da matriz alogênica e a remodelação do tecido cartilaginoso, ósseo e medular foi mais acelerado, em relação a implantação ortotópico; d) o aumento na densidade de volume dos vasos sanguíneos e no número de osteoblastos/osteócitos e osteoclastos ocorreu simultaneamente e estava associado à maior reabsorção da matriz alogênica e à formação do tecido medular (hematopoiético); e) as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL, OPG foram expressas em condrócitos, osteoblastos ativos, osteócitos recém aprisionados na matriz e em células estromais próximas aos osteoblastos ou às áreas da matriz alogênica reabsorvida; e f) a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG foi maior no grupo MO. O pico de expressão dessas proteínas ocorreu nos períodos de 14 aos 21 dias no grupo da MO e 21 e 28 dias no grupo da MD. Concluímos que, a capacidade osteoindutora da matriz alogênica desmineralizada está relacionado a origem da matriz e ao sítio de implantação e que, as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG estão associadas a maior reabsorção da matriz implantada, promovendo uma rápida e contínua liberação dos morfógenos contidos em seu interior que, induzem temporal e espacialmente a formação óssea/medular. / The aim of the present work was to correlate the cellular and tissue events with the expression of VEGF, BMP-7, RANKL and OPG during ectopic and orthotopic osteogenesis, induced by bone and dentin allogeneic matrix. Allogenic matrices obtained from femur and incisor of rats and demineralized in 0.6 N HCl were implanted into a intramuscular pocket and a 8mm-diameter bone defect in the skull. The radiographic and histomorphometric analysis of new bone formation, and immunohistochemistry and western blotting for VEGF, BMP, RANKL and OPG proteins, showed that: a) the total volume of the graft region in orthotopic site decreased 19% at 42 days b) in both graft types and implantation sites occurred formation of cartilaginous and bone tissues, c) in intramuscular sites, the resorption of allogenic matrix and remodeling of the new formed cartilage and bone were faster, in relation to orthotopic implantation sites; d) the increase in the volume density of blood vessels and in the number of osteoblasts/osteocytes and osteoclasts occurred simultaneously and was associated with greater reabsorption of the allogenic matrix and hematopoietic bone marrow formation; e) VEGF, BMP-7, RANKL, OPG proteins were expressed in chondrocytes, active osteoblasts, newly osteocytes confined and stromal cells located near the osteoblasts or in the surface of the reabsorbed matrix; and f) the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG expression was higher in MO grafts than in the MD. The peak of expression of these proteins each occurred at 14 and 21 days in MO and 21 and 28 days in MD. We concluded that, the osteoinductive capacity of allogeneic demineralized matrix is related to matrix origin and implantation site and that the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG proteins are associated with greater reabsorption of the implanted matrix, promoting rapid and continuous matrix-release morphogens that induces spatially and temporally the bone and bone marrow formation.

Orientador: Rosemary Adriana Chierici Marcantonio / Resumo: Trabalhos in vivo têm utilizado a microtomografia computadorizada para avaliar a qualidade e quantidade de tecido ósseo presente durante o desenvolvimento de doença periodontal induzida. No entanto, ainda não foram estudados quais os melhores e mais confiáveis padrões estabelecidos para o adequado uso da técnica de Micro CT. O objetivo deste estudo foi avaliar a geração de artefatos e ruídos durante o escaneamento de biópsias ósseas bem como, analisar a influência de diferentes parâmetros estabelecidos durante a mensuração de área e volume ósseo, em modelo experimental de doença periodontal induzida em ratos. Para análise dos diferentes parâmetros de escaneamento com o Micro CT foram utilizados 05 animais aleatoriamente selecionados e submetidos a inserção de ligaduras na região subgengival dos segundos molares superiores. Após o período de 7 dias os animais foram eutanasiados e as biópsias ósseas escaneadas utilizando resoluções de 9 µm e 18 µm, com diferentes filtros: alumínio (0,2 mm, 0,5 mm e 1 mm) e cobre+alumínio (Cu 0,04 mm + Al 0,5 mm). Posteriormente foram definidas duas regiões de interesse (ROI's) ao redor dos segundos molares, de modo que foi somente analisado o tecido ósseo. Após determinação da área de interesse, a quantidade de tecido ósseo foi avaliada e quantificada por meio do software CTAn, a partir de 5 valores de thresholds: 255-75, 255-80, 255-85, 255-70, 255-65. Quando diferentes tresholds foram analisados dentro de um mesmo filtro, somente o filtro de ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In vivo studies have used a computerized microtomography (Micro CT) to assess a quality and amount of tissue present in the development of induced periodontal disease. However, have not yet studied which are the most reliable standards established for the proper use of the Micro CT technique. The objective of this study was to evaluate the generation of artifacts during biopsy scanning, as well as the analysis of different parameters defined in an area and bone volume measurement in an experimental model of periodontal disease induced in rats. To analyze the different detection parameters of microcomputers with selected animals and submitted to insertion of ligatures in the subgingival region of the upper second molars. After the 7-day period the animals were used as bone biopsies scanned using resolutions of 9 μm and 18 μm, with different filters: aluminum (0.2 mm, 0.5 mm and 1 mm) and copper + aluminum (Cu 0 04 mm + 0.5 mm). Subsequently, two regions of interest (ROI's) were defined around the second molars, in the way the bone tissue was analyzed. After determining the area of interest, the amount of bone tissue was evaluated and quantified using the CTAn software, from 5 threshold values: 255-75, 255-80, 255-85, 255-70, 255-65. When different thresholds were analyzed within the same filter, only the 0.2 mm Al filter presented statistical difference for all comparisons (9 μm and 18 μm). Already when the different filters with the same threshold were compared, it is only one comparison Al 0.2 mm x Cu + Al presented statistical difference for all ...(Complete abstract electronic access below) / Mestre

Submitted by LUANA ELIS SABINO null (luana_sabino2@yahoo.com.br) on 2017-10-19T17:05:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação mestrado Luana ÚLTIMA CORREÇÃO PÓS TESE _06.09.2017.pdf: 856633 bytes, checksum: c980bbb3ae877cf8b0a44f1d5dea5855 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-10-23T18:07:48Z (GMT) / Submitted by LUANA ELIS SABINO null (luana_sabino2@yahoo.com.br) on 2017-10-26T14:16:53Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Final Mestrado.pdf: 856633 bytes, checksum: c980bbb3ae877cf8b0a44f1d5dea5855 (MD5) Ficha catalográfica.pdf: 111383 bytes, checksum: a8b7568798072418c7b893211ab02930 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: A ficha catalográfica deve ser inserida na página subsequente à folha de rosto. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-10-26T14:19:53Z (GMT) / Submitted by LUANA ELIS SABINO null (luana_sabino2@yahoo.com.br) on 2017-10-26T17:47:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final f.c1.pdf: 968068 bytes, checksum: 7307917532b3a6d10b3fa2716603443c (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-10-26T17:50:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sabino_le_me_arafo.pdf: 968068 bytes, checksum: 7307917532b3a6d10b3fa2716603443c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-26T17:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sabino_le_me_arafo.pdf: 968068 bytes, checksum: 7307917532b3a6d10b3fa2716603443c (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Trabalhos in vivo têm utilizado a microtomografia computadorizada para avaliar a qualidade e quantidade de tecido ósseo presente durante o desenvolvimento de doença periodontal induzida. No entanto, ainda não foram estudados quais os melhores e mais confiáveis padrões estabelecidos para o adequado uso da técnica de Micro CT. O objetivo deste estudo foi avaliar a geração de artefatos e ruídos durante o escaneamento de biópsias ósseas bem como, analisar a influência de diferentes parâmetros estabelecidos durante a mensuração de área e volume ósseo, em modelo experimental de doença periodontal induzida em ratos. Para análise dos diferentes parâmetros de escaneamento com o Micro CT foram utilizados 05 animais aleatoriamente selecionados e submetidos a inserção de ligaduras na região subgengival dos segundos molares superiores. Após o período de 7 dias os animais foram eutanasiados e as biópsias ósseas escaneadas utilizando resoluções de 9 µm e 18 µm, com diferentes filtros: alumínio (0,2 mm, 0,5 mm e 1 mm) e cobre+alumínio (Cu 0,04 mm + Al 0,5 mm). Posteriormente foram definidas duas regiões de interesse (ROI’s) ao redor dos segundos molares, de modo que foi somente analisado o tecido ósseo. Após determinação da área de interesse, a quantidade de tecido ósseo foi avaliada e quantificada por meio do software CTAn, a partir de 5 valores de thresholds: 255-75, 255-80, 255-85, 255-70, 255-65. Quando diferentes tresholds foram analisados dentro de um mesmo filtro, somente o filtro de Al 0,2 mm apresentou diferença estatística para todas comparações (9 µm e 18 µm). Já quando diferentes filtros foram comparados com o mesmo treshold, apenas a comparação Al 0,2 mm x Cu + Al apresentou diferenças estatísticas para todas as comparações, com exceção para comparações entre Al 0,1 mm x Al 0,2 mm (treshold 255-65 com resolução de 18 µm). Diante dos resultados apresentados, conclui-se que, avanços e padronizações utilizadas em análises microtomográficas para a avaliação de perda óssea em doença periodontal induzida devem ser realizadas com objetivo de maior fidelização dos dados, podendo serem assim, compatíveis com outras análises com avaliações histomorfométricas. / In vivo studies have used a computerized microtomography (Micro CT) to assess a quality and amount of tissue present in the development of induced periodontal disease. However, have not yet studied which are the most reliable standards established for the proper use of the Micro CT technique. The objective of this study was to evaluate the generation of artifacts during biopsy scanning, as well as the analysis of different parameters defined in an area and bone volume measurement in an experimental model of periodontal disease induced in rats. To analyze the different detection parameters of microcomputers with selected animals and submitted to insertion of ligatures in the subgingival region of the upper second molars. After the 7-day period the animals were used as bone biopsies scanned using resolutions of 9 μm and 18 μm, with different filters: aluminum (0.2 mm, 0.5 mm and 1 mm) and copper + aluminum (Cu 0 04 mm + 0.5 mm). Subsequently, two regions of interest (ROI's) were defined around the second molars, in the way the bone tissue was analyzed. After determining the area of interest, the amount of bone tissue was evaluated and quantified using the CTAn software, from 5 threshold values: 255-75, 255-80, 255-85, 255-70, 255-65. When different thresholds were analyzed within the same filter, only the 0.2 mm Al filter presented statistical difference for all comparisons (9 μm and 18 μm). Already when the different filters with the same threshold were compared, it is only one comparison Al 0.2 mm x Cu + Al presented statistical difference for all comparisons, except for comparisons between Al 0.1 mm x 0.2 mm (threshold 255 - 65 with resolution of 18 μm). It was concluded that advances and standardization in microtomographic analysis to evaluate bone loss in induced periodontal disease should be performed with the objective of greater fidelity of the data, thus being compatible with other analyzes with histomorphometric evaluation.

O objetivo do atual trabalho, foi correlacionar os eventos celulares e teciduais com a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG durante a osteogênese ectópica e ortotópica, induzida pela matriz óssea (MO) e dentinária (MD) alogênica. Matrizes alogênicas desmineralizada em HCl a 0,6N, obtidas de fêmur e incisivo de ratos, fori implantada entre as fáscias musculares da coxa e em defeito trans-ósseo de 8mm de diâmetro nos ossos parietais. As análises radiográfica e histomorfométrica da neoformação óssea e, a imunohistoquímica e o western blotting para as proteínas VEGF, BMP, RANKL e OPG, mostraram que: a) o volume da região do enxerto nos sítios ortotópicos reduziu 19% em 42 dias; b) em ambos tipos de enxerto e locais de implantação, ocorreu formação de tecido cartilaginoso e ósseo; c) nos sítios intramusculares, a reabsorção da matriz alogênica e a remodelação do tecido cartilaginoso, ósseo e medular foi mais acelerado, em relação a implantação ortotópico; d) o aumento na densidade de volume dos vasos sanguíneos e no número de osteoblastos/osteócitos e osteoclastos ocorreu simultaneamente e estava associado à maior reabsorção da matriz alogênica e à formação do tecido medular (hematopoiético); e) as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL, OPG foram expressas em condrócitos, osteoblastos ativos, osteócitos recém aprisionados na matriz e em células estromais próximas aos osteoblastos ou às áreas da matriz alogênica reabsorvida; e f) a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG foi maior no grupo MO. O pico de expressão dessas proteínas ocorreu nos períodos de 14 aos 21 dias no grupo da MO e 21 e 28 dias no grupo da MD. Concluímos que, a capacidade osteoindutora da matriz alogênica desmineralizada está relacionado a origem da matriz e ao sítio de implantação e que, as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG estão associadas a maior reabsorção da matriz implantada, promovendo uma rápida e contínua liberação dos morfógenos contidos em seu interior que, induzem temporal e espacialmente a formação óssea/medular. / The aim of the present work was to correlate the cellular and tissue events with the expression of VEGF, BMP-7, RANKL and OPG during ectopic and orthotopic osteogenesis, induced by bone and dentin allogeneic matrix. Allogenic matrices obtained from femur and incisor of rats and demineralized in 0.6 N HCl were implanted into a intramuscular pocket and a 8mm-diameter bone defect in the skull. The radiographic and histomorphometric analysis of new bone formation, and immunohistochemistry and western blotting for VEGF, BMP, RANKL and OPG proteins, showed that: a) the total volume of the graft region in orthotopic site decreased 19% at 42 days b) in both graft types and implantation sites occurred formation of cartilaginous and bone tissues, c) in intramuscular sites, the resorption of allogenic matrix and remodeling of the new formed cartilage and bone were faster, in relation to orthotopic implantation sites; d) the increase in the volume density of blood vessels and in the number of osteoblasts/osteocytes and osteoclasts occurred simultaneously and was associated with greater reabsorption of the allogenic matrix and hematopoietic bone marrow formation; e) VEGF, BMP-7, RANKL, OPG proteins were expressed in chondrocytes, active osteoblasts, newly osteocytes confined and stromal cells located near the osteoblasts or in the surface of the reabsorbed matrix; and f) the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG expression was higher in MO grafts than in the MD. The peak of expression of these proteins each occurred at 14 and 21 days in MO and 21 and 28 days in MD. We concluded that, the osteoinductive capacity of allogeneic demineralized matrix is related to matrix origin and implantation site and that the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG proteins are associated with greater reabsorption of the implanted matrix, promoting rapid and continuous matrix-release morphogens that induces spatially and temporally the bone and bone marrow formation.