Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-28T14:14:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Rozana M. S. Galvão.pdf: 1560472 bytes, checksum: 5434a76f0b516e97d5f0698b73fa8050 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-28T14:14:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Rozana M. S. Galvão.pdf: 1560472 bytes, checksum: 5434a76f0b516e97d5f0698b73fa8050 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T14:14:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Rozana M. S. Galvão.pdf: 1560472 bytes, checksum: 5434a76f0b516e97d5f0698b73fa8050 (MD5) Previous issue date: 2008-02-22 / In this work three Brazilian B. rhodina, and also two strains from Cuba, selected for their ability to produce jasmonate compounds, were submitted to molecular analysis of internal transcribed spacers- ITS regions of rDNA to characterize their genetic variability. rDNA extraction procedures were conducted according classic protocols followed by amplification, via the PCR technique, of conserved ITS regions with the primers ITS1 and ITS4. The PCR products were purified using the GFX purification kit (GE-Healthcare), resolved in “MegaBace” 1000 – DNA Analysis System (GE-Healthcar) and further identified by comparative analysis with ITS regions of rDNA sequences from the databases available at the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Analyses were performed with the BLAST tool and the multiple alignments of sequences with Clustal W program from the computational package BioEdit. Moreover, analysis using the TCS program resulted in the identification of nine haplotypes separated by ten polymorphic sites. AFLP analyses were also implemented using four combinations of oligonucleotide primers which resulted in the generation of 300 polymorphic markers. The mean number of amplified fragments by primer pair was 79 with up to 95% of polymorphic bands. The genetic distance between B. rhodina strains was estimated in 29.19%. Dendogram constructed with Jaccard’s coefficient of similarity showed that analyzed strains were assembled in four groups with high genetic variability found in all strains. / Os microrganismos produzem substâncias químicas como resultado do metabolismo primário e secundário. No metabolismo secundário estão envolvidas vias metabólicas para a síntese de produtos naturais que não são essenciais para o crescimento do organismo produtor. O fungo Botryosphaeria rhodina, tem despertado um interesse crescente devido à produção de uma serie de ácidos graxos ciclopentanos, do tipo ácido jasmônico (AJ), com propriedades reguladoras do crescimento de plantas superiores. Usualmente o AJ é um regulador de crescimento vegetal endógeno, sintetizado de maneira natural por uma grande variedade de plantas, pertence aos reguladores de crescimento vegetal (RCV) denominados jasmonatos, sendo os mais representativos o ácido (-)-jasmônico (-)-AJ e o ácido(+)-7-isojasmônico [(+)-7-isoAJ] os quais se encontram amplamente distribuídos nas plantas. AJ tem inúmeras aplicações conhecidas tais como a utilização do AJ na fabricação de perfumes; na produção do chá preto; na redução do consumo de estimulador de crescimento; na produção de malte em indústrias de cerveja; no aumento da produção de taxol; na produção de flavorizantes alimentícios, entre outros. Os microrganismos produzem substâncias químicas como resultado do metabolismo primário e secundário. No metabolismo secundário estão envolvidas vias metabólicas para a síntese de produtos naturais que não são essenciais para o crescimento do organismo produtor. O fungo B. rhodina, tem despertado um interesse crescente devido à produção de uma serie de ácidos graxos ciclopentanos, do tipo AJ, com propriedades reguladoras do crescimento de plantas superiores. A importância crescente do uso de microrganismos na biotecnologia nos levou a propor a prospecção dos metabólitos produzidos pelos microrganismos existentes em espécies vegetais da Amazônia. Desse modo, foram obtidos isolados de B. rhodina capazes de produzir o ácido jasmônico e seus derivados os quais foram caracterizados geneticamente por meio de seqüenciamento do DNA ribossomal e pela técnica de AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ou Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados). Trinta e quatro linhagens de B. rhodina isoladas como patógenos de plantas tropicais, tais como: citros, manga, mogno africano, mamão, cupuaçu e madeira cortada foram analisadas para verificar a capacidade de produção de AJ utilizando-se a metodologia de Miersch et al., 1989. Os ensaios para produção de AJ e seus derivados foram realizados em meio Miersch (M1) e Miersch Modificado (M2) e, avaliados em placas de Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) e quantificados por meio de Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Após a avaliação da produção de jasmonatos as linhagens foram submetidas à análise molecular de regiões ITS do rDNA para avaliação da diversidade genética. A extração do DNA foi realizada por métodos clássicos, seguido da amplificação das regiões conservadas ITS do rDNA por meio da técnica de PCR, onde foram utilizados os oligonucleotídeos ITS1 e ITS4. A distância genética entre as linhagens variou de 0 a 1,6%. A taxa de transição/transversão foi de 1,2. Os alinhamentos foram submetidos ainda ao Programa TCS, resultando na identificação de nove haplótipos e 10 sítios polimórficos. A matriz de distância genética assim como a árvore filogenética resultante mostrou pouca divergência genética nas regiões de DNA analisadas. Também foi feita a analise das linhagens de B. rhodina por meio de marcadores moleculares AFLP. Para a obtenção dos resultados foram utilizadas quatro combinações de iniciadores nas reações AFLP, possibilitando a geração de 300 marcadores polimórficos. O número médio de bandas obtidas por iniciador foi de 79% e a porcentagem de bandas polimóficas foi de 95%. A distância genética entre as linhagens de B. rhodina foi de 29,19%, e a porcentagem de loci polimórfico foi de 0,95%. Todas as linhagens investigadas foram agrupadas em quatro grupos e foram obtidos indicadores de alta variabilidade genética entre todos os isolados.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-02Bitstream added on 2014-06-13T20:30:11Z : No. of bitstreams: 1 bongiovani_ram_me_sjrp.pdf: 2319132 bytes, checksum: e7d65e5bb475e25f1407badd2bab2ddd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os exopolissacarídeos (EPS) são polímeros produzidos por uma grande variedade de microrganismos e podem possuir propriedades físicas, estruturais e químicas diferentes. Considerando o interesse crescente das indústrias na busca de polissacarídeos que apresentem comportamento reológico compatível com sua aplicação, tanto nos setores de alimentos como farmacêutico, cosmético e têxtil, pesquisas vêm sendo realizadas com a esperança da descoberta de novas moléculas promissoras para tais aplicações. O objetivo deste trabalho foi determinar as características reológicas do exopolissacarídeo (botriosferana) produzido pelo Botryosphaeria rhodina MAMB-05 em três fontes de carbono: glucose (EPSGLU), sacarose (EPSSAC) e frutose (EPSFRU). A análise da composição monossacarídica, após hidrólise ácida, mostrou que todos os polímeros são constituídos exclusivamente por glucose e a cromatografia de filtração em gel indicou baixo grau de polidispersividade. Experimentos com o corante Congo Red evidenciaram a presença de tripla hélice nos três polímeros produzidos pelo fungo B. rhodina MAMB-05. Os três polissacarídeos comportaram-se como fluidos não-Newtoniano com características de soluções pseudoplásticas e tixotrópicas e com diminuição da viscosidade quando em presença de NaCl. As soluções aquosas de EPSGLU, EPSSAC e EPSFRU apresentaram comportamento viscoelástico, com características de gel forte em 5 e 25°C, não sofrendo mudanças no comportamento, mesmo em presença de NaCl, a 25°C. As soluções polissacarídeos mantiveram as características de géis fortes, com propriedades termoestáveis e termorresistentes, entre 5 a 95°C de temperatura. Esses resultados permitiram concluir que os EPS produzidos pelo fungo B. rhodina MAMB-05 possuem propriedades químicas e físicas, passíveis de utilização nas indústrias de alimentos, farmacêutica, cosmética e biomédica. / Exopolysaccharides (EPS) are polymers produced by a great variety of microorganisms and can possess different physical and chemical properties, and structural features. Considering the growing interest in commercial applications of polysaccharides that show rheological compatible behavior within the application, as in the food, pharmaceutical, cosmetic and textile sectors, research have been developed in attempts to discover new promising biomolecules for such applications. The objective of the work presented was to determine the rheological characteristics of the exopolysaccharide botryosphaeran produced by Botryosphaeria rhodina MAMB-05 on three different sole carbon sources: glucose (EPSGLU), sucrose (EPSSUC) and fructose (EPSFRU). The analysis of monosaccharide composition, after acid hydrolysis, showed glucose as the only component and the gel permeation chromatography indicated that the EPSs have an excellent purity grade. All three biopolymers produced by B. rhodina MAMB-05 were found to exist in the triple helix conformational state. The three exopolysaccharides showed non-Newtonian behavior, with pseudoplastic and thixotropic characteristics, and showed a slight decrease in viscosity in presence of NaCl. The three biopolymer gels showed viscoelastic behavior, with characteristics of strong gelling at 5 ºC and 25 ºC, without suffering behavioral changes, even in the presence of NaCl at 25 ºC. The polysaccharide solutions kept the strong gel characteristics possessing thermo-stable and thermo-resistant properties when evaluating the influence of temperature (5 – 95 ºC) over the viscoelastic behavior of solutions. The results concluded that the EPS’s produced by fungus B. rhodina MAMB-05 have physical and chemical properties amenable for use in the food, pharmaceutical, cosmetic and biomedical industries.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2103.pdf: 9010606 bytes, checksum: 6ec32b7b3b1e18e59d2b173d7cd4775b (MD5) Previous issue date: 2007-11-23 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work shows the isolation, identification of microorganisms from the species Khaya ivorensis and the identification of the pathogen that is attacking this plant on Bahia state (Brazil). In total seven strains of microorganisms from K. Ivorensis were isolated, but only six were identified. Two of them, Penicillium spp., Rhizopus spp., were identified according to their characteristics macro and micro morphological structures vegetative and reproductive. Four fungi were identified by the regions ITS 1 and/or ITS 2 of DNAr, by its morphological and microscopic characteristics. In addition, the Blast of the sequences of these regions confirmed the presence of the Pestalotiopsis crassiuscula 96%, Phomopsis sojae 95%, Lasiodiplodia theobromae, and its telemorfo Botryosphaeria rhodina 98%. Literature shows that Botryosphaeria rhodina is common in disease Canker in plant, similar occur in K. ivorensis, suggesting that this fungi is the pathogen in specie studded. After the identification of Khaya pathogen it was studded, yielding to isolation and identification of sixteen compounds from different classes: Des-methyl lasiodiplodin, lasiodiplodin, isocoumarin, two derivatives γ-butirolactones (4-propil-3-carbonyl-2- methyl-4-butanolideo and 4-propil-2-carbonyl-3-methyl-4-butenolideo), 11- hidroxijasmônic acid, 5-hidroximethylfurfural, tirosol, ergosterol, peroxido de ergosterol, steroids (stigmastenon, sitostenon and campestenon), nucleosídeos (5 - inosil, uridine e uracila), manitol and one triglycerides. Both derivatives γ- butirolactonas appear to be new in literature. The isolated compounds were identified by Nuclear Magnetic Ressonance 1D and 2D and Mass Spectrometry. The limonoids methyl angolenasate isolated in large amount from K. ivorensis symptomatic and 7- deacetoxy-7-oxogedunin isolated from Carapa guianensis, were bioassayed against the microorganisms Penicillium ssp., Phomopsis sojae and Botryosphaeria rhodina, in order to analyze if these fungi modify the structure of compounds. However, in some experiments were not observe any difference and in others, only hypothesis can be done by MS analyze. In a complementary study, compounds lasiodiplodin, ergosterol, 5 -inosil and mannitol were assayed as inhibitor of ATP synthesis, and only lasiodiplodin presented good results. / Este trabalho apresenta o isolamento, a identificação de microorganismos da espécie Khaya ivorensis e a identificação do patógeno que vem atacando esta espécie na Bahia. Foram isolados, no total, sete grupos de microorganismos da espécie K. ivorensis, mas apenas seis foram identificadas. Dois deles, Penicillium spp., Rhizopus spp., foram identificados de acordo com suas características macro e micro morfológico das estruturas vegetativas e reprodutivas. Quatro fungos foram identificados pelas regiões ITS 1 e/ou ITS 2 do DNAr, pelas suas características morfológicas e microscópicas e o Blast das seqüências das referidas regiões indicaram ser Pestalotiopsis crassiuscula 96%, Phomopsis sojae 95%, Lasiodiplodia theobromae, além de seu telemorfo Botryosphaeria rhodina 98%. Considerando o potencial de fitopatogênia descrito na literatura para os gêneros encontrados, a freqüência e localização dos fungos isolados, pode-se afirmar que Botryosphaeria rhodina é o agente causal da doença do plantio de K. ivorensis na Bahia. Após a identificação do patógeno de Khaya fez-se o estudo fitoquímico deste fungo, levando ao isolamento e identificação de 19 substâncias de diferentes classes: des-metil lasiodiplodina, lasiodiplodina, isocumarina, dois derivados γ- butirolactonas (4-propil-3-carbonil-2-metil-4-butanolideo e 4-propil-2-carbonil-3-metil- 4-butenolideo), ácido 11-hidroxijasmônico, 5-hidroximetilfurfural, tirosol, ergosterol, peróxido de ergosterol, esteróides (estigmastenona, sitostenona e campestenona), nucleosídeos (5 -inosil, uridina e uracila), manitol e um triglicerideo, dentre estas substâncias os dois derivados γ-butirolactonas possivelmente são novos na literatura. Os compostos isolados foram identificados pelas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear 1D e 2D e por Espectrometria de massas. Foi realizado o experimento de biotransformação com os limonóides angolesato de metila isolado em grande quantidade de K. ivorensis sintomática e 7-desacetoxi-7-oxogedunina isolado de Carapa guianensis, frente aos microorganismos Penicillium ssp., Phomopsis sojae e Botryosphaeria rhodina, para verificar se ocorria ou não a modificação destes compostos junto aos fungos. No entanto, em alguns experimentos não observou-se nenhuma diferença e em outros, apenas supõem-se que tenha ocorrido a modificação. Em um estudo complementar, realizou-se ensaios frente a síntese de ATP com os compostos lasiodiplodina, ergosterol, 5 -inosil e do manitol, sendo que somente a lasiodiplodina apresentou uma boa inibição.

Resumo: Os exopolissacarídeos (EPS) são polímeros produzidos por uma grande variedade de microrganismos e podem possuir propriedades físicas, estruturais e químicas diferentes. Considerando o interesse crescente das indústrias na busca de polissacarídeos que apresentem comportamento reológico compatível com sua aplicação, tanto nos setores de alimentos como farmacêutico, cosmético e têxtil, pesquisas vêm sendo realizadas com a esperança da descoberta de novas moléculas promissoras para tais aplicações. O objetivo deste trabalho foi determinar as características reológicas do exopolissacarídeo (botriosferana) produzido pelo Botryosphaeria rhodina MAMB-05 em três fontes de carbono: glucose (EPSGLU), sacarose (EPSSAC) e frutose (EPSFRU). A análise da composição monossacarídica, após hidrólise ácida, mostrou que todos os polímeros são constituídos exclusivamente por glucose e a cromatografia de filtração em gel indicou baixo grau de polidispersividade. Experimentos com o corante Congo Red evidenciaram a presença de tripla hélice nos três polímeros produzidos pelo fungo B. rhodina MAMB-05. Os três polissacarídeos comportaram-se como fluidos não-Newtoniano com características de soluções pseudoplásticas e tixotrópicas e com diminuição da viscosidade quando em presença de NaCl. As soluções aquosas de EPSGLU, EPSSAC e EPSFRU apresentaram comportamento viscoelástico, com características de gel forte em 5 e 25°C, não sofrendo mudanças no comportamento, mesmo em presença de NaCl, a 25°C. As soluções polissacarídeos mantiveram as características de géis fortes, com propriedades termoestáveis e termorresistentes, entre 5 a 95°C de temperatura. Esses resultados permitiram concluir que os EPS produzidos pelo fungo B. rhodina MAMB-05 possuem propriedades químicas e físicas, passíveis de utilização nas indústrias de alimentos, farmacêutica, cosmética e biomédica. / Abstract: Exopolysaccharides (EPS) are polymers produced by a great variety of microorganisms and can possess different physical and chemical properties, and structural features. Considering the growing interest in commercial applications of polysaccharides that show rheological compatible behavior within the application, as in the food, pharmaceutical, cosmetic and textile sectors, research have been developed in attempts to discover new promising biomolecules for such applications. The objective of the work presented was to determine the rheological characteristics of the exopolysaccharide botryosphaeran produced by Botryosphaeria rhodina MAMB-05 on three different sole carbon sources: glucose (EPSGLU), sucrose (EPSSUC) and fructose (EPSFRU). The analysis of monosaccharide composition, after acid hydrolysis, showed glucose as the only component and the gel permeation chromatography indicated that the EPSs have an excellent purity grade. All three biopolymers produced by B. rhodina MAMB-05 were found to exist in the triple helix conformational state. The three exopolysaccharides showed non-Newtonian behavior, with pseudoplastic and thixotropic characteristics, and showed a slight decrease in viscosity in presence of NaCl. The three biopolymer gels showed viscoelastic behavior, with characteristics of strong gelling at 5 ºC and 25 ºC, without suffering behavioral changes, even in the presence of NaCl at 25 ºC. The polysaccharide solutions kept the strong gel characteristics possessing thermo-stable and thermo-resistant properties when evaluating the influence of temperature (5 - 95 ºC) over the viscoelastic behavior of solutions. The results concluded that the EPS's produced by fungus B. rhodina MAMB-05 have physical and chemical properties amenable for use in the food, pharmaceutical, cosmetic and biomedical industries. / Orientador: Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva / Coorientador: Ana Lúcia Barretto Penna / Banca: Joana Lea Meira Silveira / Banca: Roberto da Silva / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:09:12Z : No. of bitstreams: 1 covizzi_lg_me_sjrp.pdf: 1482206 bytes, checksum: 2f1c1f77dc261f160aba2bc3a1d1ffea (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O uso de células microbianas imobilizadas para aumentar a produção de metabólitos fúngicos em processos fermentativos tem mostrado altos rendimentos. Nesse trabalho foi avaliado pela primeira vez, a imobilização de células do Botryosphaeria rhodina, um fungo ligninolitico produtor constitutivo de lacases. Três suportes foram avaliados: Fibra Acrílica Fina (FAF); Espuma de Poliuretano Expandido (EPE); Espuma de Poliuretano Fibroso (EPF). O EPF foi o melhor suporte por ter mostrado uma imobilização mais homogenia das células. Um planejamento fatorial foi desenvolvido para otimizar a produção de lacases por células livres, na presença de álcool veratrílico (AV). A análise da superfície de resposta mostrou que 18mM como a melhor concentração de AV para a produção de lacases, usando-se 3 mL de homogeinato de células como inóculo (DOλ400nm 0.4-0.6) para 25 mL de meio de cultura em frascos de 125mL, a 180 rmp, durante 126 horas a 28ºC. O perfil de crescimento do fungo, associado a produção de lacase foram comparados na presença e na ausência de AV, usando-se células livres e células imobilizadas do B. rhodina. A imobilização aumentou aproximadamente 3 vezes a produção de lacases e manteve estável o nível de produção durante 6 reciclos. A imobilização de células do B. rhodina mostrou-se útil uma vez que economizou 72horas para atingir a maior produção de lacase, quando comparada com células livres e também aumentou a tolerância do fungo a concentrações mais altas de AV (500mM) / The use of microbial immobilized cells to increase the production of fungal metabolites in fermentation processes has showed higher yields. This work evaluated by the first time, the immobilization of Botryosphaeria rhodina cells, a ligninolytic fungus that produces laccase. Three carriers were evaluated: acrylic fine fiber (FAF), expanded polyurethane foam (EPE), and fiber polyurethane foam (EPF). The EPF was the best carrier because showed a homogeneous immobilization cells. A factorial design was developed in order to optimize the laccase production by free cells in the presence of the laccase inducer veratryl alcohol (VA). The analysis by response surface answer showed 18 mM as the best VA concentration to produce laccase using 3 mL of a cell homogenate (ODλ400nm 0.4-0.6) as inoculum, to 25 mL of culture medium in shaked flasks (125 mL) at 180 rpm, during 126 hours at 28 °C. A growth profile for laccase and fungal biomass production were compared with and without VA using free and immobilized cells of B. rhodina. The cell immobilization increased approximately 3 folds the laccase production and maintained it stable during 6 consecutive recycles. The cell immobilization of B. rhodina showed to be useful once saved 72 hours to achieve the higher laccase production when compared to the one with free cells, and also increased the fungal cell tolerance at higher VA concentrations (500 mM)

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Banca: Aneli de Melo Barbosa / Resumo: O uso de células microbianas imobilizadas para aumentar a produção de metabólitos fúngicos em processos fermentativos tem mostrado altos rendimentos. Nesse trabalho foi avaliado pela primeira vez, a imobilização de células do Botryosphaeria rhodina, um fungo ligninolitico produtor constitutivo de lacases. Três suportes foram avaliados: Fibra Acrílica Fina (FAF); Espuma de Poliuretano Expandido (EPE); Espuma de Poliuretano Fibroso (EPF). O EPF foi o melhor suporte por ter mostrado uma imobilização mais homogenia das células. Um planejamento fatorial foi desenvolvido para otimizar a produção de lacases por células livres, na presença de álcool veratrílico (AV). A análise da superfície de resposta mostrou que 18mM como a melhor concentração de AV para a produção de lacases, usando-se 3 mL de homogeinato de células como inóculo (DOλ400nm 0.4-0.6) para 25 mL de meio de cultura em frascos de 125mL, a 180 rmp, durante 126 horas a 28ºC. O perfil de crescimento do fungo, associado a produção de lacase foram comparados na presença e na ausência de AV, usando-se células livres e células imobilizadas do B. rhodina. A imobilização aumentou aproximadamente 3 vezes a produção de lacases e manteve estável o nível de produção durante 6 reciclos. A imobilização de células do B. rhodina mostrou-se útil uma vez que economizou 72horas para atingir a maior produção de lacase, quando comparada com células livres e também aumentou a tolerância do fungo a concentrações mais altas de AV (500mM) / Abstract: The use of microbial immobilized cells to increase the production of fungal metabolites in fermentation processes has showed higher yields. This work evaluated by the first time, the immobilization of Botryosphaeria rhodina cells, a ligninolytic fungus that produces laccase. Three carriers were evaluated: acrylic fine fiber (FAF), expanded polyurethane foam (EPE), and fiber polyurethane foam (EPF). The EPF was the best carrier because showed a homogeneous immobilization cells. A factorial design was developed in order to optimize the laccase production by free cells in the presence of the laccase inducer veratryl alcohol (VA). The analysis by response surface answer showed 18 mM as the best VA concentration to produce laccase using 3 mL of a cell homogenate (ODλ400nm 0.4-0.6) as inoculum, to 25 mL of culture medium in shaked flasks (125 mL) at 180 rpm, during 126 hours at 28 °C. A growth profile for laccase and fungal biomass production were compared with and without VA using free and immobilized cells of B. rhodina. The cell immobilization increased approximately 3 folds the laccase production and maintained it stable during 6 consecutive recycles. The cell immobilization of B. rhodina showed to be useful once saved 72 hours to achieve the higher laccase production when compared to the one with free cells, and also increased the fungal cell tolerance at higher VA concentrations (500 mM) / Mestre