Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes. / Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes. / Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes. / Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-02T14:36:17Z No. of bitstreams: 1 Gustavo Alves do Nascimento.pdf: 1681544 bytes, checksum: acfb4a02e8653a17d32122ce9e6a41e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T14:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gustavo Alves do Nascimento.pdf: 1681544 bytes, checksum: acfb4a02e8653a17d32122ce9e6a41e5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The bovine papillamatosis is a disease caused by papillomavirus that can generate damage for producers and farmers. In extreme cases it can affect all the herd. Diagnostic methods for bovine papillomavirus are essential to the sector because traditional methods of morphological observations are not very effective. The use of devices technological to recognize specific biological molecules may help treatment and prevention of bovine viral diseases. The biosensor incorporates a biological recognition element through electrochemical reactions that generate electrical signals that can be quantified and interpreted. Thus, this work aimed to develop molecular diagnostic methods for detection of bovine viral diseases through the construction of biosensors. One of the biosensor was constructed from pencil graphite type 4B and the other model biosensor was composed to three screen-printed electrodes. In both biosensors proposed, a DNA probe specific for the BPV was immobilized on the working electrode by electrodeposition or by adsorption and then a target sequence was hybridized with the probe immobilized. The hybridization redox signals were analyzed using differential pulse voltammetry. The results showed that biosensors could differentiate hybridization of non-hybridization. The hybridization occurrence showed decrease on the redox signal and represented the positive diagnostic for BPV infection. The two biosensors (pencil graphite and screen-printed electrodes) showed high sensitivity which detection limits were 3.84 nM and 4.35 nM, respectively. The biosensor also detected viral DNA extracted from bovine blood using screen-printed electrodes. The data obtained with the biosensors showed viability for the diagnosis of various bovine papillomavirus types, thereby allowing the development of a new portable detection system for viruses. / Enfermidades virais bovina, com destaque para o papilomatose bovina, trazem prejuízos para os produtores, podendo acometer todo o rebanho. Métodos de diagnósticos para o papilomavírus bovino (BPV) vêm sendo indispensáveis para o setor, pois os métodos tradicionais de observação morfológica são pouco eficazes. O uso de dispositivos capazes de reconhecerem moléculas biológicas específicas, como os biossensores, pode auxiliar no tratamento e prevenção de doenças virais bovina. O presente trabalho visou o desenvolvimento de métodos diagnósticos para detecção molecular de enfermidades bovinas de origem viral através da construção de biossensores. Um dos biossensores foi construído a partir de lápis grafite tipo 4B e outro modelo de biossensor foi constituído por eletrodos impressos. Nos dois biossensores propostos, um sonda de DNA específica para o BPV foi imobilizada no eletrodo de trabalho por eletrodeposição ou por adsorção e em seguida uma sequência alvo foi hibridizada com a sonda imobilizada. Os sinais redox da hibridização foram analisados pela técnica de voltametria de pulso diferencial. Os resultados mostraram que os biossensores puderam diferenciar a hibridização da não-hibridização. A ocorrência da hibridização apresentou diminuição no sinal redox e representou a positividade para a infecção do BPV. Os dois biossensores propostos (lápis grafite e eletrodos impressos) apresentaram elevada sensibilidade cujos limites de detecção foram 3,84 nM e 4,35 nM, respectivamente. O biossensor detectou também DNA viral extraído a partir de sangue bovino utilizando os eletrodos impressos. Os dados obtidos com os biossensores mostraram viabilidade para o diagnóstico de vários tipos de papilomavírus bovino, permitindo com isso o desenvolvimento de um novo sistema de detecção portátil para os vírus.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-08T15:55:50Z No. of bitstreams: 1 Vanda Lucia da Cunha Monteiro.pdf: 2562841 bytes, checksum: a00a188e7c5dc2c8b041adfbeca80f48 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T15:55:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanda Lucia da Cunha Monteiro.pdf: 2562841 bytes, checksum: a00a188e7c5dc2c8b041adfbeca80f48 (MD5) Previous issue date: 2007-02-08 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The bovine viral papillomatosis is an infect-contagious disease with high prevalence in dairy bovines, causing considerable economical losses in this sector. Aiming to contribute with therapeutic research for this pathology, this work had as objective evaluating the efficacy of Thuya occidentalis in the treatment of cutaneous papillomatosis in dairy bovines by the clinical, histopathological and molecular aspects. This research was divided in 4 experiments. Were used in the experiments females of Holstein Friesian crossbred, nuliparous, primiparous and multiparous, exhibiting different types of cutaneous papilloma (typical, atypical, engastated atypical, filamentous and mixing) and of degrees defined for this study: light (25% of the body affected), moderate (with 50% of the body affected) and intensive (with more than 50% of affected body). The animals were kept in a semi intensive system of raising and were randomly distributed in groups with tem animals each. In the experiments I and II the animals were divided into 4 groups, were the groups 1 and 2 received solution of sodium chloride at 0.9% and cereal alcohol, respectively, being these considered controls, and the groups 3 and 4 received the phytotherapic medicines Thuya occidentalis (Simões®) mothre tincture (T.M.) at 30% and Thuya occidentalis mother tincture at 30% with propolis, respectively. The animals received, daily by oral via, 10mL of the products during 63 days. For histopathological evaluation, 50% of the animals were submitted to cutaneous biopsy of the lesions on the zero moment (M0) and the final moment (FM). In the present experiments, the partial and total regression were not observed in any group, once during the clinical and histopathological evaluations, in all moments and groups, the papillomas did not presented macroscopic alterations of remission, color and consistence. In the histopathological analysis it was observed epithelial and conjunctive hyperplasic alterations, with extensive vegetative growth of the epithelium with wide and deep epidermal crest, results that characterize development phase with viral replication and synthesis, being a characteristic finding of papillomatosis. It may be concluded that cutaneous papillomatosis in dairy bovines shows predilection for specific areas. The papillomas were most present on lateral abdomen, dewlap and snout, showing mixing lesions followed by basal and that the use of tinctures at 30% of Thuya occidentalis (Simões®) and Thuya occidentalis with propolis, on the experimental conditions used in this studies, do not cause remission of papillomas in dairy bovines. In experiment III there was used the homeopathic medicine Thuya occidentallis CH6. The animals were distributed at random in 3 groups. The groups 1 and 2 received NaCl 0.9% solution and alcohol cereal, respectively, being these considered controls, and the 3rd group received Thuya occidentalis CH6 in the treatment formula. For the three groups the administration was daily, being 10mL by oral via during 63 days. For histopathologycal evaluation, the animals were submitted to cutaneous biopsy of the papilloma lesions in the zero moment (0M) and final moment (FM). According to the achieved data, the partial or total remission occurred only in group 3 (Thuya occidentalis CH6), where were observed warts fall in 20% of the animals of this group, besides partial regression of the remaining animals, with macroscopic alterations of color and size, findings confirmed by the histopathological exam. In the histopathological analysis there was observed reduction of the thorny layer in all animals of the treated group (G3), showing reduction of epithelial layers with conjunctive tissue of dermal papilla showing active fibroblast and capillaries and rare lymphocytic inflammatory cells. Concluding that Thuya occidentallis CH6 contributes to the treatment of pedunculated papiloma in bovine, being indicated in the presence of this infection. Studies with Thuya occidentalis CH6 must have continuity with bovine carrying basal papillomas in a period of treatment superior to 63 days. The experiment IV had as objective to identify the Bthe Polimerase Chain Reaction (PCR). Using the general (FAP59/64 e MY 11/09) and the specific primers for BPV-2 there was obtained an assertiveness of 33 (82.5%) of the 40 analyzed samples. According to the obtained results it is concluded that the presence of BPV in Pernambuco State-Brazil is in agreement with the world findings, enhancing the importance of the diagnose and control of the infection and, consequently, adoption of an specific therapy. These results emphasize the therapeutic properties of the homeopathic medicine Thuya occidentallis CH6, concluding that its use contributes to the treatment of cutaneous papillomatosis in bovine, emphasizing the necessity of studies for period superior to 63 days with the phytotherapic Thuya occidentalis in bovine carrying cutaneous papilllomatosis, and the serum dosage of AST, GGT, urea and creatinine showed that the plant used in this study, during 63 days, was not able to cause hepatic and renal alterations in bovine with cutaneous papillomatosis. / A papilomatose viral bovina é uma enfermidade infecto-contagiosa que apresenta alta prevalência em bovinos leiteiros, causando consideráveis perdas econômicas para este setor. Com o objetivo de contribuir com a pesquisa terapêutica para esta virose, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia de Thuya occidentalis, no tratamento da papilomatose cutânea em bovinos leiteiros, por meio dos aspectos clínicos, histopatológicos e moleculares. Esta pesquisa foi dividida em 4 experimentos. Foram incluídas nos experimentos fêmeas mestiças de holandês nulíparas, primíparas e multíparas, apresentando diferentes tipos de papilomas cutâneos (típicos, atípicos, atípicos engastados, filamentosos e mistos) e de graus assim definidos para este estudo: leve (25% do corpo acometido), moderado (50% do corpo acometido) e intenso (mais de 50% do corpo acometido). Os animais mantiveram-se em sistema semi-intensivo de criação e foram distribuídos aleatoriamente em grupos, com dez animais cada. Nos experimentos I e II, os animais foram divididos em 4 grupos, onde os grupos 1 e 2 receberam solução de cloreto de sódio a 0.9% e álcool de cereal, respectivamente, sendo estes considerados controles, e os grupos 3 e 4 receberam os medicamentos fitoterápicos Thuya occidentalis (Simões®) tintura mãe (T.M.) a 30% e Thuya occidentalis tintura mãe a 30% com própolis, respectivamente. Os animais receberam, diariamente por via oral, 10mL dos produtos durante 63 dias. Para avaliação histopatológica, 50% dos animais foram submetidos à biópsia cutânea das lesões no momento zero (M0) e no momento final (MF). Nos presentes experimentos, as regressões parcial e total não foram observadas em nenhum grupo, uma vez que durante as avaliações clínicas e histopatológicas, em todos os momentos e grupos, os papilomas não apresentaram alterações macroscópicas de remissão, coloração e consistência. Nas análises histopatológicas verificaram-se alterações hiperplásicas epiteliais e conjuntivas, com extenso crescimento vegetativo do epitélio com cristas epidérmicas extensas e profundas, estes resultados caracterizam fase de desenvolvimento com replicação e síntese viral, sendo um achado característico de papilomatose. Pode-se concluir que a papilomatose cutânea em bovinos leiteiros apresenta predileção por áreas específicas. Os papilomas estavam mais presentes no abdômen lateral, barbela e focinho,apresentando lesões mistas seguidas de basais e que o uso das tinturas a 30% de Thuya occidentalis (Simões®) e Thuya occidentalis com própolis, nas condições experimentais utilizadas nestes estudos, não provocam remissão de papilomas em bovinos leiteiros. No experimento III utilizou-se o medicamento homeopático Thuya occidentallis CH6. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos. Os grupos 1 e 2 receberam solução de NaCl 0.9% e álcool de cereal, respectivamente, sendo estes considerados controles, e o grupo 3 recebeu a Thuya occidentalis CH6 na forma de tratamento. Para os três grupos a administração foi diária, sendo 10 mL por via oral, durante 63 dias. Para avaliação histopatológica, os animais foram submetidos à biópsia cutânea dos papilomas, no momento zero (M0) e no momento final (MF). De acordo com os dados obtidos, as regressões parcial e total ocorreram apenas no grupo 3 (Thuya occidentalis CH6), observando-se queda das verrugas em 20% dos animais deste grupo, além de regressão parcial em 80% nos animais restantes, com alterações macroscópicas de coloração e tamanho, achado este confirmado pelo exame histopatológico. Na análise histológica observou-se redução da camada espinhosa em todos os animais do grupo tratado (G3), evidenciando-se redução nas camadas epiteliais, com tecido conjuntivo da papila dérmica apresentado fibroblastos ativos e capilares e raras células inflamatórias linfocitárias. Concluindo-se que a Thuya occidentalis CH6 contribuiu no tratamento de papilomas pedunculados em bovinos, podendo ser indicada na presença desta infecção. Estudos com a Thuya occidentalis CH6 devem ter continuidade com bovinos portadores de papilomas basais, com período de tratamento superior a 63 dias. O experimento IV teve como objetivo identificar o BPV-2 em amostras de verrugas cutâneas de bovinos, utilizando a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Utilizando-se os primers gerais (FAP59/64 e MY 11/09) e específico para BPV-2 obteve-se uma positividade de 33 (82,5%) das 40 amostras analisadas. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que a presença da BPV no Estado de Pernambuco está em concordância com os achados mundiais, destacando-se a importância do diagnóstico no controle da infecção e, conseqüentemente, adoção de uma terapia específica. Estes resultados enfatizam as propriedades terapêuticas do medicamento homeopático Thuya occidentallis CH6, concluindo-se que o seu uso contribuiu no tratamento da papilomatose cutânea em bovinos, ressaltando a necessidade de estudos por períodos superiores a 63 dias com a Thuya occidentalis fitoterápica em bovinos portadores de papilomatose cutânea, e as dosagens séricas de AST, GGT, uréia e creatinina revelaram que a planta utilizada neste estudo, durante 63 dias, não foi capaz de causar alterações hepáticas e renais em bovinos com papilomatose cutânea.