Cryopreservation of fish embryos was studied using zebrafish embryo as a model system. Cryoprotectant toxicity, chilling sensitivity and embryo membrane permeability were investigated with a view to developing optimum protocols for cryopreservation of the embryos using controlled slow cooling, non-freezing storage and vitrification. Methanol was found to be the most effective cryoprotectant for controlled slow cooling and non-freezing storage of zebrafish embryos with 11 %heart beat stage embryos surviving after controlled slow cooling to -25°C. Zebrafish embryos were found to be very chilling sensitive with early developmental stages being the most sensitive to chilling injury. Embryo developmental stages after closure of the blastopore (>12-h), especially post heart beat stages were much more resistant to cryoprotectant toxicity and chilling injury. Heart beat stage (27-h) embryos proved to be the best embryo developmental stage for controlled slow cooling and non-freezing storage. Dechorionated embryos are more sensitive to cryoprotectant toxicity and chilling injury. The sensitivity to chilling injury of zebrafish embryos limited the use of controlled slow cooling and non-freezing storage for long term cryopreservation. The attempts at cryopreservation of zebrafish embryos using vitrification produced no embryo survival, although up to 32 % embryos remained morphologically intact immediately after vitrification. Poor cryoprotectant permeation, dehydration and consequently ice formation within the egg are probably the main factors on effecting embryo survival. The results of zebrafish embryo permeability studies demonstrated that the chorion of the embryos was permeable to water and cryoprotectants, whilst the vitelline (plasma) membrane was an effective permeability barrier. The inability to achieve sufficient penetration of the vitelline membrane by cryoprotectants poses severe problems for long term cryopreservation, which need to be overcome, possibly by permeabilisation of the vitelline membrane, before successful cryopreservation can be achieved.

Les azoles sont des fongicides présents dans les milieux aquatiques et connus pour inhiber des activités enzymatiques de cytochromes P450 (CYP). L'objectif de ce travail de thèse est de caractériser le mécanisme d'action d'un fongicide pharmaceutique, le clotrimazole sur la stéroïdogenèse testiculaire chez le poisson zèbre au travers l'étude d'un réseau de gènes fonctionnels le long de l'axe cerveau-hypophyse-gonade, et d'évaluer la capacité du clotrimazole à perturber la spermatogenèse. Nous montrons que le clotrimazole est capable d'affecter la stéroïdogenèse de manière différente in vitro et in vivo (i) des expositions d'explants testiculaires in vitro conduisent à l'inhibition de la synthèse de 11-kétotestostérone (11-KT), montrant une action directe de la molécule sur le testicule et (ii) l'exposition in vivo provoque une augmentation de l'expression de gènes impliqués dans le processus de la stéroïdogenèse. Nous avons ainsi mis en évidence un système de compensation biologique au niveau de l'organisme, avec un rôle prépondérant de la voie Fsh/FshR dans la médiation des effets du clotrimazole. Enfin, des effets sur la spermatogenèse ont été observés in vivo suite à une exposition chronique au clotrimazole, avec notamment une augmentation de la masse gonadique et du nombre de cellules de Leydig. Les effets tissulaires observés sont cohérents avec des effets mesurés au niveau moléculaire. L'ensemble de ces données montre l'intérêt de la démarche expérimentale utilisée pour caractériser le mécanisme d'action du clotrimazole. Ce travail ouvre de nombreuses perspectives, en premier lieu sur l'étude de l'impact fonctionnel du clotrimazole sur la reproduction.