The ability of bacteria to detect their surroundings and enact an appropriate response is critical for survival. Translation of external signals into a coherent response requires specific control over the transcription of DNA into RNA. Much of the regulation at this step is accomplished by transcriptional regulators, proteins that bind to DNA and alter gene expression. A wide-spread variety of regulators in bacteria is the AraC-family. These regulators are divided into two conserved domains and respond to a variety of compounds owing to different N-terminal domains. A subfamily of these regulators, GATase1-like AraC-family transcriptional regulators (GATRs), is described. These proteins contain an N-terminal domain with structural characteristics similar to enzymes that synthesize amine-containing compounds. Members of this subfamily of transcriptional regulators are found in a wide range of bacteria, however, few are characterized. A relatively high number of GATRs are encoded in the Burkholderia thailandensis genome. Therefore, we utilized this bacterium as a model to explore the function and diversity of these regulators. GATRs in B. thailandensis divided into two groups based on bioinformatics analysis. The first group includes three members which we identified that contribute to the positive regulation of glycine betaine (GB) catabolism. GB can be utilized as a nutrient source or as a potent osmoprotectant. The regulation of this pathway in B. thailandensis differs from previously established models due to the interplay of these regulators. Homologs of two other GATRs in this group were identified that regulate carnitine and arginine catabolism. The second group of GATRs contains uncharacterized members with no known functions. A genetic strategy for engineering constitutive GATRs was developed and employed to investigate the transcriptional regulons of these GATRs. This approach yielded the identification of a novel GATR that represses expression of an operon producing a formaldehyde detoxification system, and is the first example of a GATR that functions as a repressor.

Burkholderia pseudomallei (Bp) is a major public health concern in the endemic regions of southeast Asia and northern Australia, yet the organism has a worldwide distribution and cases are likely under-reported. In northeast Thailand the mortality rate associated with Bp infection is over 40%. The inherent resistance of Bp to multiple antibiotics impairs treatment, and relapse is seen in more than 25% of survivors. Beyond its public health significance, Bp is considered a potential biological warfare agent by the U.S. DHHS and was recently listed as a Tier 1 select agent. Despite enhanced research and vaccine efforts, traditional vaccine strategies employing attenuated bacterial strains, recombinant proteins, or purified polysaccharides have failed to elicit complete protection against aerosol challenge with Bp. We have previously shown that immunization with outer membrane vesicles (OMVs) derived from Bp can protect mice from lethal melioidosis. In this work we characterize the interactions of OMVs with antigen presenting cells in order to elucidate innate immune responses to the OMV vaccine. Vaccine-mediated antibody responses and protective efficacy were characterized in BALB/c mice. We also tested the safety and immunogenicity of the OMV vaccine in non-human primates (NHP). We show that Bp OMVs interact with dendritic cells and macrophages and are internalized by these antigen presenting cells (APCs).Internalization is dependent on actin polymerization and cholesterol present in APC membranes. OMVs also upregulate MHC class I and II on APCs, as well as promote the production of pro-inflammatory cytokines in a TLR2/4 dependent manner. Immunization of mice with Bp OMVs by the s.c. and i.m. routes induced the production of OMV-specific IgM and IgG and significantly protected mice against aerosol challenge. Addition of alum and MPL did not significantly change the antibody profiles of immunized mice and did not significantly enhance vaccine mediated protection. OMVs were well tolerated in a large animal NHP model. There were no adverse clinical reactions, and NHPs mounted significantly increased levels of OMV-specific IgG and OMV specific CD4+ T cell responses. These results suggest that Bp OMVs can stimulate innate and adaptive immune responses and may represent a safe and efficacious vaccine against melioidosis / acase@tulane.edu

Dockingbasierte Ansätze zählen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Abschätzung der Bindungsaffinität zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollständig gelöstes Problem für Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gewidmet. Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Berücksichtigung der Absättigung vergrabener Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-Lösungen. Nicht-abgesättigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinität abträglichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinitätsdaten in Scoringfunktionen vernachlässigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur Häufigkeit vergrabener nicht-abgesättigter HBA und HBD in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB“-Filterfunktion) entwickelt, die unerwünschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde für die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Absättigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen für eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abgesättigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollständige Absättigung durch entsprechende Proteinpartner wird für ca. 48 % der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 % weisen weniger als drei hauptsächlich schwache, nicht-abgesättigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolekülen in die Häufigkeitsanalyse sind sogar für ca. 61 % aller Komplexe alle wasserstoffbrückenbindenden Gruppen abgesättigt. Im Gegensatz zu DSX werden für SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erhöhte Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 Å Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power“ bezeichneten Kriteriums für die Top-3-Posen (Erfolgsrate für die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 Å Pose unter den besten drei Docking-Lösungen) von 63.1 % auf 64.2 % beobachtet. In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer Überlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-Lösungen berücksichtigt. Die adäquate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist für die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinitäts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zunächst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash“-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der Häufigkeit ungünstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der Häufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash“-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerwünschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 % der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ungünstigen Beiträge pro Komplex für 50 % aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch können diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zurückzuführen sein bzw. durch günstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash“-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power für SFCscore. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-Lösungen von 61.4 % auf 86.9 % erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). Die „Clash“-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash“- und der „vnaHB“-Filterfunktion überlegen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinitätsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gelegt. Dadurch soll eine adäquate Berücksichtigung ungünstiger Beiträge zur Bindungsaffinität ermöglicht werden, die für die Richtigkeit und Zuverlässigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden binäre Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-Lösungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verfügbarkeit von Affinitätsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash“-Deskriptor, und die Decoy-Datensätze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsfähigsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten“ RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power für das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabhängigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegenüber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatensätzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). Das „beste“ Modell zeichnet sich durch die zuverlässige Vorhersage richtig-positiver Docking-Lösungen für einige wenige Komplexe aus, für die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose für diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung für die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren für die Klassifizierung von Docking-Lösungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-berücksichtigter Beiträge zur Bindungsaffinität stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator“-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei. Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein für die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolinsäure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen günstige Wechselwirkungsbereiche für Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einführung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erhöhten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke zu Gly116 zurückzuführen ist. Selektivitätsverbesserungen gegenüber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere für das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivitätsindex (1): 45, Selektivitätsindex (2n): 4.2; mit Selektivitätsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) führt zu einer verbesserten Löslichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition. Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Größere konformelle Änderungen werden lediglich für den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien für 1 erforderlich macht. Günstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits für Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits für Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl für Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erhöhte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring führt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter Löslichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen für weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern. / Docking-based approaches belong to important virtual screening components and aim at predicting both the ligand position and conformation within the protein binding site as well as the binding affinity. To date scoring functions are still not fully reliable in correctly identifying near-native ligand conformations generated by docking. Thus, the first part of the current work is dedicated to the development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses. A first project focused on considering the saturation of hydrogen bond acceptors (HBA) and donors (HBD) for the evaluation of docking poses. Since structural and affinity data are missing, current scoring functions neglect unpaired buried HBA and HBD, which strongly disfavour high-affinity binding. Based on a detailed frequency analysis of unpaired buried HBA and HBD within high-quality protein-ligand complexes of the Hartshorn dataset, an empirical filter function (“vnaHB” filter function) was developed to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with scoring functions. The practical benefit of the filter function was investigated for the scoring functions SFCscore and DSX using pre-generated docking poses of the Cheng dataset. As shown in the frequency analysis, the saturation of buried polar groups is of utmost importance for high-affinity binding, as unpaired buried HBA and HBD are extremely rare. A complete saturation by proper protein counterparts is observed for about 48 % of all complexes under study, whereas approximately 92 % have less than three, mostly weak unpaired buried HBA or HBD (e.g. ether functions). Including also the saturation by water molecules reveals that actually for about 61 % of all complexes every hydrogen bonding group is saturated. Unlike DSX, the application of the filter function with SFCscore results in higher success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the top scored poses, a criterion termed “Docking Power”. For the best SFCscore function (SFCscore::229m) the Docking Power with respect to the top three poses increases from 63.1 % to 64.2 %. A further project focused on considering repulsive intermolecular contacts due to sterical overlap of the protein-ligand binding partners for the evaluation of docking poses. Although an inclusion of such repulsive contacts in scoring is of utmost importance for the identification of protein-bound ligand conformations, it remains challenging because of missing structural and affinity data. Based on the Lennard-Jones potential of the AMBER force field a new descriptor accounting for repulsive protein-ligand contacts (“clash” descriptor) was developed and used for analysing the frequency of unfavourable protein-ligand contacts among high-quality structures of the Hartshorn dataset. An empirical filter function (“clash” filter function) derived from the frequency distribution was applied to pre-generated docking poses of the Cheng dataset to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with SFCscore and DSX. As shown in the frequency analysis, mostly weakly repulsive contacts occur within protein-ligand complexes. For 75 % of the complexes of the Hartshorn dataset repulsive potentials of less than 0.462 kcal/mol are observed. Indeed, unfavourable contributions add up to not more than 0.8 kcal/mol to 2.5 kcal/mol per complex for 50 % of all structures; values in this range may be attributed to inaccuracies of crystal structures or could be counterbalanced by favourable protein-ligand interactions. The application of the “clash” filter function shows significant improvements of the Docking Power of SFCscore. For the best SFCscore function (SFCscore::frag) the success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the three top scored poses increases from 61.4 % to 86.9 %, which is comparable to the Docking Power of the best scoring functions (e.g. DSX, GlideScore::SP) currently available in literature (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). The “clash” filter function alone is also superior to the combination of the “clash” and the “vnaHB” filter function. Another focus of the work was the inclusion of decoy data (structure and affinity data of weakly active and inactive ligands) in scoring function development. Thus, unfavourable contributions to the binding affinity should be adequately considered, which appears essential for improving accuracy and reliability of the predictions. Within the scope of this work a binary classification model was developed for the evaluation of docking poses, allowing the inclusion of decoy poses without affinity data. The random forest algorithm (RF), SFCscore descriptors, the new “clash” descriptor, and the decoy datasets of Cheng and Huang (training data) provide the basis of the best-performing model. The practical benefit of the “best” RF model was investigated after combination with the scoring function DSX based on the Docking Power for identifying a near-native pose on rank 1 using the independent Cheng/Huang (only complexes not used for training) and the CSAR-2012 dataset. With respect to the standalone application of DSX, improvements of the Docking Power regarding both test sets are achieved (Cheng/Huang test set: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012 test set: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). A key feature of the “best” model are reliable predictions of true positive docking poses for those complexes for which DSX fails to identify a near-native ligand conformation. A visual comparison of the best RF and DSX pose highlights advantages of the RF model regarding the recognition of interactions crucial for protein-ligand binding. The importance analysis of SFCscore descriptors for the classification of docking poses as well as the investigation of failures after model application provide useful hints for further improvements. Thus, more property-balanced training data, the further development of established SFCscore descriptors, and the implementation of new descriptors accounting for neglected contributions to the binding affinity constitute possible starting points for future improvements. The second part of this work is dedicated to the application of docking-based methods for the development of new inhibitors of the "`Macrophage Infectivity Potentiator"'-(MIP) proteins of Legionella pneumophila and Burkholderia pseudomallei. The MIP protein of Legionella pneumophila constitutes an important virulence factor and thus an attractive target for the treatment of legionellosis. Within the scope of this work the pipecolic acid sulfonamide 1, one of the best small-molecule MIP inhibitors to date (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM), was systematically optimised. After hot spot analysis of the binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing MIP inhibition. The results of the hot spot analysis show favourable interaction fields for donor groups and hydrophobic substituents in meta position as well as acceptor groups in para position of the benzyl ring of 1. Introducing a nitro function in para position of the benzyl ring of 1 (2h) results in an increased MIP inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), which is likely due to the formation of an additional hydrogen bond to Gly116. An improvement in the selectivity compared to the structurally related human FKBP12 protein is achieved particularly with the para amino derivative of 1 (2n) (selectivity index (1): 45, selectivity index (2n): 4.2, where the selectivity index = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (2s) leads to improved solubility and comparable MIP inhibition. The MIP protein of Burkholderia pseudomallei plays an important role in the pathogenesis of melioidosis and thus constitutes an attractive target for the development of new drugs against this disease. Within the scope of this work the currently best small-molecule MIP inhibitor 1 was optimised. Starting with a structural comparison of Burkholderia pseudomallei MIP and Legionella pneumophila MIP, as well as a hot spot analysis of the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing for MIP inhibition. The structural comparison reveals a high homology of the two binding pockets. Major conformational changes are observed for the binding pocket region formed by Ala94, Gly95, Val97 and Ile98, which necessitates different optimisation strategies for 1. Favourable interaction fields for the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket are found for donor groups or hydrophobic substituents in para position of the benzyl ring (region A) of 1 as well as for acceptor or donor groups in para or meta/para position of the trimethoxyphenyl ring (region B). On the basis of the docking studies promising candidates could be identified for variations in both regions. Initial MIP inhibition measurements of synthesised derivatives indicate increased inhibition compared to 1. Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (yielding a more soluble derivative) leads again to comparable MIP inhibition. Further syntheses and tests of promising ligands are currently being planned by the collaboration partners. The results of the inhibition measurements should demonstrate their suitability as MIP inhibitors and provide useful information for future structure-based drug design cycles.

Die Melioidose und die Legionärskrankheit werden von den beiden Erregern Burkholderia pseudomallei bzw. Legionella pneumophila verursacht. Eine hohe Mortalitätsrate trotz langwieriger Behandlungen sowie die zunehmende Resistenz vieler Bakterien gegenüber den eingesetzten Antibiotika verdeutlichen die Notwendigkeit alternativer Behandlungsmethoden. Als neues Angriffsziel gilt das bereits in vielen Pathogenen gefundene „macrophage infectivity potentiator“-Protein, kurz Mip, das als Virulenzfaktor die Infektion forciert. Bei Legionella pneumophilia ist LpMip dafür verantwortlich, dass das Bakterium in die Lunge eindringen kann. Dabei überwindet der Erreger mit Hilfe des Mips die Epithelzellschicht und die extrazelluläre Matrix. Für BpMip ist der Sachverhalt der Invasion noch Gegenstand aktueller Forschung. Beide Mips zeigen eine hohe Sequenzhomologie zu humanem FKBP12 (FK506-bindende Proteine) und gehören deshalb zur Superfamilie der Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen), die die Fähigkeit besitzen, die cis/trans-Isomerisierung von Peptidbindungen der Aminosäure Prolin zu katalysieren. Die bereits bekannten FKBP12- und Mip-Inhibitoren Rapamycin und FK506 sind aufgrund ihrer immunsuppressiven Wirkung nicht zur Behandlung der beiden Krankheiten einsetzbar. Im Vorfeld dieser Arbeit konnte durch Synthese des literaturbekannten nicht-immunsuppressiven FKBP12-Inhibitors eine Leitstruktur gewonnen werden, die sowohl die PPIase-Aktivität von LpMip als auch von BpMip inhibiert. Zunächst konnten in dieser Arbeit durch Optimierung des Synthesewegs die Inhibitoren enantiomerenrein hergestellt werden. Ebenso wurde verifiziert, dass das S-Enantiomer das aktivere Konfigurationsisomer ist. Daneben wurde durch Synthese der Verbindung 8a/S-8a die anti-PPIase-Aktivität und die Löslichkeit im PBS-Puffer verbessert sowie die Zytotoxizität im Vergleich zu S-1a gesenkt Diese Verbindung zeigte jedoch eine schlechte Aktivität im Infektionsassay. In weiteren Kooperationen mit dem Biozentrum Würzburg und dem Dstl wurden die Inhibitoren ebenfalls erfolgreich an den Mips von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Francisella tularensis undYersinia pestis getestet. In dieser Arbeit wurden erstmals Mip-Inhibitoren an Burkholderien in einer In-vivo-Studie untersucht. Die Wirksamkeit der Inhibitoren im Tiermodell soll in Folgestudien bewiesen werden. Damit ist eine aussichtsreiche Basis für zukünftige alternative Behandlungsmethoden der gram-negativer Bakterien gelegt. / Development of macrophage infectivity potentiator inhibitors

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La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Celle-ci présente un défaut sur le canal à ions chlorure affectant ainsi entre autres la viscosité des muqueuses au niveau du système respiratoire. Cet environnement est alors propice aux colonisations bactériennes opportunistes sous la forme de biofilm. Burkholderia cepacia, bacille Gram-négatif mobile, multi-résistant aux antibiotiques et hautement transmissible, s'avère d'une extrême virulence pour les patients atteints de FK. Cette bactérie pathogène désigne en fait un ensemble de neuf souches rassemblées sous le nom de « complexe B. cepacia » (CBC). Au moins huit de ces neuf souches produisent un exopolysaccharide nommé Cepacian. Ceci est constitué d'un motif de répétition heptasaccharidique composé notamment de l'enchaînement α-D-Rhap-(1→4)-α-D-GlcpA. Le D-rhamnose (ou 6-deoxy-D-mannose) est un sucre rare et un composant de glycoconjugués des parois de bactéries pathogènes mais est absent chez l'homme. Ce dernier est donc un excellent candidat antigénique dans le cadre de la préparation d'un vaccin entièrement synthétique et spécifique. L'élaboration de celui-ci consiste en un activateur universel immunogénique peptidique (Tc-épitope) et/ou protéique (semi-synthétique) fonctionnalisé par une unité antigénique spécifique. Dans ce but, un tri-O-saccharide de constituant de LPS de B. cepacia et composé majoritairement de D-rhamnose, ainsi que des fragments du motif répétition de l'exopolysaccharide du CBC ont été synthétisés. Des méthodes de synthèses orthogonales ont été optimisées avec de hauts rendements sur les cinq types de sucres du CBC, spécifiquement le D-rhamnose, et l'acide glucuronique ainsi qu'une série de glycosylations. La synthèse linéaire en 18 étapes conduit à l'α-D-Rhap-(1→4 )-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Rhap avec 11.3% de rendement global. La dernière étape sera la conjugaison de Tc-épitope par ce dernier afin d'obtenir un vaccin entièrement synthétique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Vaccin synthétique, T-cell épitope, Burkholderia cepacia, Fibrose kystique, Oligosaccharide, D-rhamnose, Complexe B. cepacia.

Burkholderia pseudomallei is the causative agent of Melioidosis, an endemic disease in South East Asia, and is classified as a category B biological agent. Currently, there is no licensed vaccine for this disease; the mortality rate is high due to the incorrect diagnosis and the pathogen insusceptibility to general antibiotics. A mass spectrometry based proteomic approach has been applied in order to identify the proteins that are responsible for pathogenicity.Methods were developed for the proteomic analysis of Burkholderia species using B. vietnamiensis G4, an opportunistic pathogen as the model organism. Both gel-based (LC-MS/MS) and gel-free MudPIT (LC/LC-MS/MS) approaches have been applied for the analysis of the proteins extracted from four different cellular fractions of these bacteria. More than 1200 proteins were identified from these analyses, including many proteins previously identified as virulence factors of these bacteria. Similar methodologies were applied to build a proteome map of non-pathogenic B. thailandensis E264 to use as a reference for the pathogenic studies. Additionally, proteomes of two B. thailandensis strains isolated from two geographical locations were compared to investigate the differences in protein expression of these organisms.Proteins identified from pathogenic B. pseudomallei were compared with the non-pathogenic B. thailandensis and opportunistic pathogen B. vietnamiensis proteins. Many species specific proteins were identified from this proteomic analyses; those proteins can be used as antigen targets to selectively identify these pathogenic bacteria in a complex biological matrix using affinity capture methods.Ticks are vectors that can transmit disease causing pathogens one host to another. Knowing the pathogen reservoir is important in order to control disease spread in the environment. Application of mass spectrometric methods to identify the host blood components from tick vectors was investigated using tick nymphs which feed only once in their life cycle. Using mass spectrometry based proteomics; host specific proteins like hemoglobin and immunoglobulin were identified from a single tick nymph analysis. Additional studies have examined the fatty acid profiles of rabbit and sheep blood fed tick nymphs using SPALDI mass spectrometry. Different fatty acid profiles were obtained for these tick nymphs, but further investigations are required to validate these findings.

[Truncated abstract] Genus Burkholderia encompasses a diverse collection of bacteria that inhabit rhizospheres throughout the world. Species can provide beneficial returns for eukaryotes, such as nitrogen fixation and nodule formation in plants and biocontrol of cropping systems. Burkholderia members can also cause disease in various animals, fungi and plants. These seemingly conflicting characteristics point to the capacity of Burkholderia spp. to interact with diverse eukaryotes. Within terrestrial ecosystems, Burkholderia spp. must negotiate favourable outcomes with both the primary producers and the primary decomposers, namely plants and fungi. It is these ongoing negotiations which govern many rhizosphere processes and lead to niche differentiation for Burkholderia spp. This research set out to design an in vitro model for investigating Burkholderiaeukaryote interactions. Surface and cellular interactions between Burkholderia spp. and both plants and fungi were then investigated. Specifically, mechanisms of adherence and invasion of plant and fungal cells were studied. The Burkholderia spp. B. vietnamiensis and B. pseudomallei were applied to mycorrhizal fungus spores as well as to several plant species. Bacterial inoculation had varying effects on germination of plant and fungal dormant forms. B. vietnamiensis-inoculation consistently increased Gigaspora decipiens spore germination, while B. pseudomallei produced no significant change. The effect of B. vietnamiensis on Acacia colei seed germination was density dependant, resulting in either increases or decreases in seed germination rates. ... Detection of B. pseudomallei in surface waters and soils was improved by the use of a rapid on-site molecular method. The related species B. thailandensis and B. ubonensis were also cultured from northern Western Australia. Mycorrhizal spores were isolated from soils of melioidosis-endemic regions. Burkholderia spp., including B. pseudomallei and B. vietnamiensis were detected in extracts of these mycorrhizal spores. Therefore, associations of Burkholderia spp. with mycorrhizal spores extend beyond the in vitro setting. These studies have increased our understanding of several specific interactions between Burkholderia spp. and eukaryotes of the rhizosphere. Common themes in adherence and invasion have emerged. Burkholderia spp. are able to closely associate with eukaryotes and to gain access to protected niches. Such access helps to explain the persistence of these bacteria in the environment during periods of desiccation and nutrient limitation.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-13Bitstream added on 2014-06-13T18:44:28Z : No. of bitstreams: 1 scaquitto_dc_dr_jabo.pdf: 429936 bytes, checksum: 3e636e555a2a2cd56aa2c19a9d5c4352 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O amendoim (Arachis hypogaea L.) faz parte da família Fabaceae, que é capaz de associar-se com bactérias do gênero Rhizobium. Em solos onde o amendoim é cultivado tem-se a presença de uma população autóctone desta bactéria. A necessidade de inoculação das sementes de amendoim em solos contendo população autóctone tem sido sempre discutida. Com o objetivo de avaliar o efeito da inoculação de sementes de amendoim cultivado em vasos contendo vermiculita e a interação existente entre microrganismo-planta e microrganismo-microrganismo, foi realizado um experimento sob cultivo em casa de vegetação, em vasos de 0,5 L, com o cultivar IAC 886 e a IAC Tatu-ST, com três repetições. Os tratamentos foram constituídos de aplicação dos isolados individualmente e combinados com a estirpe padrão tipo SEMIA 6144, Bradyrhizoibium sp., recomendada pelo Ministério da Agricultura e sem aplicação de inoculante, sem aplicação de qualquer isolado. Houve interação entre o tipo de plantio e a aplicação de inoculante para todas as variáveis analisadas. Para a massa de matéria seca da parte aérea houve uma diferença significativa. O variável número de nódulos e o teor de Nitrogênio também apresentam diferenças quanto à aplicação, sendo que, em todos os casos foram superiores ao controle sem aplicação com os isolados nativos. / Peanut (Arachis hypogaea L.) belonging to Fabacea family, is able of associating with bacteria from Rhizobium genus. In soils where peanut is grown, there is usually an autochthonous population of these bacterial, however, the need of inoculation in peanut seeds in soils containing autochthonous population has always been controversial subject. With the objective of evaluating the effects of peanut seeds inoculation cultivated in vases contend vermiculite and to verifying the interaction with plant regulators, an experiment was carried out in greenhouse conditions, with three repetitions containing Runner IAC 886 e IAC Tatu-ST cultivar. The treatments were constituted of application of the individually isolated and combined with the lineage standard Bradyrhizobium sp., SEMIA 6144, recommended by Bureau of the Agriculture. An interaction was observed between the type of plantation and the application of inoculants for all analysed variable. For the mass of dry matter of the aerial part it had a significant difference. The variable numbers of nodules and rate of Nitrogen also present differences related to the treatments, being that, in all the cases was greater to the control without application of the isolated natives.