Der Transkriptionsfaktor CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα) kontrolliert Zellzyklusarrest und terminale Differenzierung von neutrophilen Granulozyten und Adipozyten. Mutationen von C/EBPα treten häufig im Zusammenhang mit akuter myeloischer Leukämie auf. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass C/EBPα an mehreren konservierten Argininen citrunilliert ist, einschließlich R297 in der C-terminalen basischen Region von C/EBPα. Mutationen von C/EBPα R297 wurden bereits beschrieben, weshalb der Schwerpunkt dieser Arbeit auf die Analyse der Modifikation dieses Aminosäurerestes gelegt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die Peptidyl-Arginin-Deaminase (PADI4) mit C/EBPα interagiert und an mehreren Aminosäureresten citrunilliert. Citrunillierung oder Mutation von R297 beeinflusst die Aktivität von C/EBPα, einschließlich DNA-Bindung und Interaktion mit Partnerproteinen. Mutationsanalysen legen nahe, dass die positive Ladung des Aminosäurerestes R297 für die Bindung an cis-regulatorische DNA-Elemente, Protein Interaktionen, Genaktivierung, Fettzelldifferenzierung und Zellzyklusarrest ausschlaggebend ist. Knock-down von PADI4 in der myeloischen Vorläufer-Zelllinie 32D oder in der leukämischen U937 Zelllinie induziert Granulozyten-Differenzierung, möglicherweise durch Blockierung der PADI4-vermittelten Citrunillierung und Inaktivierung von C/EBPα. Zusammengefasst ergibt sich aus den Daten, dass PADI4 die positiv-geladene Seitenkette von C/EBPα R297 in eine ungeladene, citrunillierte Form umwandelt, die die Assoziation mit DNA destabilisiert und die C/EBPα-E2F-Interaktion beeinflusst, was wiederum das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung bestimmt. / The transcription factor CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα) coordinates cell cycle arrest and terminal differentiation of neutrophil granulocytes and adipocytes. Mutations in C/EBPα are frequently associated with acute myeloid leukemia. Mass spectrometric analysis revealed that citrullination occurred on multiple conserved C/EBPα arginine residues including R297 in the C/EBPα basic region. C/EBPα R297 was previously reported to be mutated in acute myeloid leukemia and we therefore focused on the modification this residue. Data presented here show that peptidylarginine deiminase 4 (PADI4) interacts with and citrullinates C/EBPα at several sites. Citrullination or mutation of R297 dramatically changed C/EBPα activities, including DNA binding and interaction with protein partners. Mutational analysis demonstrated that the positive charge of residue R297 was critical for binding to cis-regulatory sites on DNA, gene activation, adipocytic differentiation, and cell cycle arrest. Knock down of PADI4 in the myeloid precursor cell line 32D or U937 leukemia cells induced granulocyte differentiation, potentially through relieving PADI4 mediated citrullination and inactivation of C/EBPα. Taken together, the data suggest that PADI4 converts the positive C/EBPα R297 side chain to the non-charged citrulline side chain which destabilizes the association with DNA and affects C/EBPα - E2F interaction that determines the balance between proliferation and differentiation.

C/EBPα und C/EBPβ sind Transkriptionsfaktoren, die die Zellproliferation und Zelldifferenzierung in vielen Geweben regulieren. C/EBPα und C/EBPβ spielen auch eine onkogene Rolle in akuter myeloischer Leukämie und anaplastisch-großzelligen Lymphomen (ALCL). In dieser Studie wird C/EBPα auf neue posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Arginin-Methylierungen und Citrullinierungen, sowie Lysin-Methylierungen und Acetylierungen, mit massenspektrometrischen Mitteln untersucht. Es werden eine modifizierbare C/EBPα-Arginin-Citrullinierungsposition und die C/EBPα-Lysinsumoylierung eingehend auf ihren Einfluss auf C/EBPα-Proteininteraktionsnetzwerk überprüft. Außerdem wurde im Verlauf dieser Studie ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren entwickelt, das wir Protein Interaktions-Screening auf einer Peptid Matrix (PrISMa) nennen. Dieses Verfahren dient der Aufklärung des modifikationsabhängigen Proteininteraktionsnetzwerkes von C/EBPβ. PrISMa basiert auf einer Peptidmembran, auf der C/EBPβ-Peptide synthetisiert sind. Viele dieser Peptide enthalten methylierte Arginine und Lysine, acetylierte Lysine, citrullinierte Arginine und phosphorylierte Serine, Tyrosine und Threonine. Mittels PrISMa konnten Interaktionen von C/EBPβ mit Histonacetyltransferasen, dem Mediatorkomplex, Proteinen des nukleären Transports und RNA bindenden und spleißenden Proteinen verifiziert und kartiert werden. Des Weiteren konnte mit Hilfe von PrISMa eine große Anzahl von publizierten C/EBPβ Interaktionspartner spezifischen C/EBPβ-Sequenzen zugeordnet werden. C/EBPβ wird in ALCL in hohem Maße exprimiert und ist für die Zellproliferation dieser Krebsart wichtig. In dieser Studie wird das Proteininteraktionsnetzwerk C/EBPβ in einer ALCL Zelllinie aufgeklärt, um tiefere Einsichten über die Funktion von C/EBPβ als Onkogen zu erlangen. / C/EBPα and C/EBPβ regulate cell proliferation and differentiation in multiple cell types. Moreover, C/EBPα and C/EBPβ are known to play oncogenic roles in acute myeloid leukemia and anaplastic large cell lymphomas (ALCLs). In this study C/EBPα is screened for novel posttranslational modifications (PTMs), such as arginine methylation and citrullination, as well as lysine methylation and acetylation by using mass spectrometry. A in this survey identified C/EBPα site of arginine citrullination and the C/EBPα lysine sumoylation are scrutinized for their impact on C/EBPα protein interaction network. A new high-throughput method named Protein Interaction Screen on peptide Matrices (PrISMa) is introduced in this study. This method was developed to determine the C/EBPβ protein interaction network in a PTM dependent manner. The PrISMa survey is based on a peptide membrane spotted with C/EBPβ peptides. Many of these C/EBPβ peptide sequences contain amino acid sequences comprising arginine and lysine methylation, lysine acetylation, arginine citrullination and serine, tyrosine and threonine phosphorylation. By means of PrISMa the C/EBPβ interplay with histone acetyltransferases, the mediator complex, proteins of the nucleoplasmic transport and RNA processing proteins is verified and specified by mapping these interactions to C/EBPβ amino acid sequences. Furthermore, PrISMa provides a map of C/EBPβ protein interaction patterns for a great number of the up to date published C/EBPβ protein interaction partners. C/EBPβ is highly expressed in ALCL cell lines and is essential for the cell proliferation of this type of cancer. In this study the C/EBPβ protein-protein interaction pattern in an ALCL cell line is unraveled providing valuable insight into the protein interaction network of C/EBPβ as an oncogene.

Our earlier work has shown that pre-B cells can be converted into macrophages by the transcription factor C/EBPα at very high frequencies and also that a clonal pre-B cell line with an inducible form of C/EBPα can be converted into macrophage-like cells. Using these systems we have performed a systematic analysis of the questions whether during transdifferentiation the cells retrodifferentiate to a precursor cell state and whether cell cycle is required for reprogramming. As for the first question, a transcriptome analysis of transdifferentiating cells showed that most genes are continuously up or downregulated, acquiring a macrophage phenotype within 5 days. In addition, we observed the transient reactivation of a subset of immature myeloid markers, as well as low levels of the progenitor markers Kit and Flt3 and a few lineage inappropriate genes. Importantly, we were unable to observe the re-expression of cell surface marker combinations that characterize hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), including c-Kit and Flt3. This was the case even when C/EBPα was activated in pre-B cells under culture conditions that favor HSPC growth or when the transcription factor was activated in a time limited fashion. As for the second question, using the C11-inducible pre-B cell line, time-lapse experiments showed that a subpopulation of about 8% of the pre-B cells did not divide before acquiring macrophage properties, with the majority of cells dividing once and a few percent dividing twice. In agreement with these results we found that 8% of the induced cells did not incorporate BrdU during reprogramming. Importantly, the non-dividing cell subset expressed the highest levels of C/EBPα and was the fastest in acquiring a macrophage phenotype. Inhibition of DNA synthesis by aphidicolin led to an impairment of transdifferentiation in >70% of the cells, suggesting a requirement for traversing the cell cycle. However, sorting pre-B cells into G0/G1 and G2/M fractions followed by induction showed no significant differences in the reprogramming kinetics. Finally, we showed that knocking down p53 in the inducible pre-B cells does not alter their conversion into macrophages, suggesting that an acceleration of the cell cycle has no effect. Together, our findings show that the conversion of pre-B cells to macrophages does not involve overt retrodifferentiation and that high concentrations of C/EBPα bypass the cell cycle-dependency of immune cell transdifferentiation / Recientemente, nuestro grupo ha demostrado que las células pre-B se pueden reprogramar a macrófagos mediante la sobreexpresión del factor de transcripción C/EBP, con una eficiencia elevada. Así mismo, mediante la expresión de la forma inducible de C/EBP en una línea de células pre-B (C11), éstas también se puede convertir en células similares a macrófagos. Usando este sistema hemos estudiado si durante el proceso de trans-diferenciacion las células requieren volver a un estadio de célula precursora, y si el ciclo celular es necesario para este proceso. En cuanto a la primera cuestión, el análisis del transcriptoma de células trans-diferenciadas mostró que la expresión de la mayoría de los genes están regulados durante todo el proceso bien aumentando o disminuyendo, y que adquieren el fenotipo de macrófago a los 5 días después de iniciar el proceso. Así mismo, se observó la reactivación transitoria de un grupo de genes que codifican para marcadores de células mieloides inmaduras; también cabe destacar que observamos una disminución en la expresión de los genes expresados en células progenitoras Kit y Flt3, así como de genes de linajes impropios. Es importante destacar que nunca hemos llegado a observar la expresión de combinaciones de marcadores de superficie característicos de las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras (HSPCs), incluyendo c-Kit y Flt3, mediante el análisis por citometría de flujo. Estos resultados se reprodujeron incluso cuando C/EBP se sobreexpresó en células pre-B que fueron cultivadas en condiciones que favorecen el crecimiento de las HSPC o cuando el factor de transcripción se activó de forma limitada en el tiempo. En cuanto a la segunda pregunta, usando la línea de células inducibles pre-B C11, el análisis mediante microscopia a diferentes tiempos después de la inducción de la reprogramación mostraron que una subpoblación de aproximadamente el 8% de las células pre-B no se dividen antes de adquirir las propiedades de macrófago, mientras que la mayoría de las células se dividen sólo una vez y un pequeño porcentaje dos veces antes de que se reprogramen totalmente a macrófagos. De acuerdo con estos resultados se encontró que un 8% de las células inducidas no incorporan BrdU durante la reprogramación. Es importante destacar que el subconjunto de células que no se dividen expresan los niveles más altos de C/EBP, con lo que cabe pensar que la adquisición del fenotipo de macrófago es más rápida en estas células. La inhibición de la síntesis de ADN por afidicolina bloqueó la transdiferenciación en mas de un 70% de las células, lo que sugiere que la correcta progresión del ciclo celular es un requisito para la transdiferenciación. Sin embargo, al separar la linea de células pre-B C11 en fracciones G0/G1 y G2/M seguido de la inducción, la cinética de la reprogramación no mostró diferencias significativas. Por último, también demostramos que la reducción en la expresión de p53 en las células pre-B inducibles no altera el proceso de conversión a macrófago, lo que sugiere que la aceleración del ciclo celular no tiene ningún efecto. En conjunto, nuestros resultados muestran que la conversión de células pre-B a macrófagos no requiere retro-diferenciación y que las células con una expresión mayor de C/EBP pueden llegar a prescindir de la dependencia del ciclo celular para la trans-diferenciación de las células inmunitarias.