Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCHBT.pdf: 1076798 bytes, checksum: a3573c0b2fab64ec79341d9ff5185211 (MD5) Previous issue date: 2004-11-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / The α2β1 integrin is a major collagen receptor that plays an essential role in the normal and tumor cells adhesion to the extracellular matrix, as well as in the metastasis. Antagonists of integrins have been developed in order to provide powerful therapeutic approaches for the several types of cancer and metastasis treatment. A metalloproteinase/disintegrin was isolated, which is a specific inhibitor of the collagen type I binding to α2β1 integrin. This 55-kDa protein (Alternagin) and its disintegrin-like 30-kDa domain Alternagin-C (ALT-C) were isolated from the Bothrops alternatus a brazilian snake - venom. This disintegrin-like domain has an additional cysteine-rich domain, which is not found in RGD-disintegrins, and the RGD motif is replaced by an ECD sequence. So, the purposes of the project were (1) Evaluate the effect of ALT-C on tumor and non-tumor cell adhesion, proliferation and migration, (2) To study the effects of ECD-motif derived peptides on tumor and non-tumor cell adhesion. ALT-C inhibited the adhesion of NITH3T3, human bladder ECV-304, human cervix HeLa and breast MDA-MB-231cells to collagen type I (IC50 of 2.2, 1.66, 1.38 and 0,95µM respectively). Besides, when immobilized on plate wells, ALT-C supported the adhesion of these cell lines. ALTC did not detach cells which were previously bound to collagen type I. In the presence of collagen type I, ALT-C stimulates the migration of MDA-MB-231 cells and in greater concentrations it inhibits migration. ALT-C does not inhibit the adhesion and the migration of estrogen dependent MCF-7 cells. ALT-C also induces significant HUVEC proliferation in vivo, by up-regulating VEGF expression in human fibroblasts and endothelial cells. ALT-C also strongly activates Akt/PKB phosphorylation, a signaling event involved in endothelial survival and angiogenesis. In addition, related to the up-regulation of the VEGF´s expression, ALT-C up-regulates other growth factors expression involved in cell proliferation, such as IL-11, TGFβ, and EGR2 and 3, which are probably also involved on its positive effect on HUVEC proliferation. These biological activities of ALT-C can be useful in anti-cancer therapy experimental studies. / A integrina-α2β1 é o principal receptor do colágeno tipo I, o qual possui papel essencial na adesão de células normais e tumorais à matriz extracelular, bem como no desenvolvimento de metástases. Portanto, desintegrinas que inibem especificamente a ligação do colágeno com a integrina-α2β1, são importantes ferramentas para o estudo do câncer metastático e para o desenvolvimento de derivados peptídicos inibidores de células tumorais invasivas (drogas antimetastáticas). Foram isoladas do veneno da serpente Bothrops alternatus ,uma metalopeptidase (Alternagina) de 55 kDa e seu domínio processado, Alternagina-C (ALT-C) (30 kDa). A ALT-C tem no domínio desintegrina a sequência adesiva ECD ao invés da seqüência RGD. Esta desintegrina-símile inibe a adesão mediada pelo colágeno tipo I de células transfectadas K562-α2β1, e a inibição é dose dependente (IC50- 100 nM). Assim, este projeto propôs (1) o estudo do efeito da ALT-C sobre células normais e tumorais através da realização de ensaios biológicos de adesão celular, migração e proliferação celulares, e (2) Ensaios biológicos com peptídeos sintéticos contendo a seqüência adesiva ECD da ALT-C. A ALT-C inibiu a adesão das linhagens celulares NITH3T3, MDA-MB- 231, HeLa, ECV-304 ao colágeno tipo I, com uma IC50 de 0,95; 1,38; 1,66 e 2,2µM respectivamente. Quando imobilizada em placas, a ALT-C promoveu a adesão das linhagens NITH3T3, HeLa e ECV-304. A ALT-C não foi capaz de desaderir linhagens NITH3T3, HeLa e ECV-304, estando estas previamente aderidas ao seu substrato. Em presença de colágeno tipo I, a ALT-C induziu a migração das células MDA-MB-231 e, em altas concentrações ela inibiu este efeito. A ALT-C não exerceu efeito inibitório ou indutor sobre a adesão ou a migração da linhagem celular dependente de estrógeno MCF-7, que expressa baixos níveis da integrina- α2β1 quando comparada com as demais linhagens estudadas. Quanto aos peptídeos sintéticos testados, mesmo em concentrações mais elevadas não foram capazes de inibir a adesão das células K562-α2β1 de forma significativa. A ALT-C, tanto na forma solúvel quanto na forma imobilizada ao plástico, induziu a proliferação celular em HUVECs e este efeito poderia estar relacionado com um aumento da expressão de fatores de crescimento. Em células da linhagem NITH3T3, a ALT-C na forma solúvel induziu de forma significativa a expressão de VEGF. A ALT-C também aumentou a expressão de outros fatores de crescimento, tais como IL-11, TGFβ e EGR2 e 3, os quais provavelmente estão envolvidos no efeito positivo sobre a proliferação celular das HUVECs e outros tipos celulares. Diante destes resultados, podemos concluir que a ALT-C pode vir a ser uma potencial ferramenta terapêutica para modelos de estudo sobre o câncer e para o desenho de fármacos que atuem especificamente em linhagens celulares tumorais que expressem a integrina α2β1, inibindo a adesão destas ao colágeno tipo I.