Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5229.pdf: 1738509 bytes, checksum: b8b65a962afe9919769ce347ef2365b4 (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Metastasis depends on several physiological processes such as cell adhesion, transendothelial cell migration and proliferation. These events are mediated mostly by integrins, which are adhesion receptors present on cell surface and responsible for cellextracellular matrix (ECM) binding. Disintegrins are small proteins from snake venoms, known to inhibit integrin action and therefore metastatic events such as transendothelial cell migration. DisBa-01 is a recombinant RGD disintegrin from Rhinoceraphis alternatus venom gland, with high affinity to the v3 integrin and anti-metastatic activity in vivo. Thereby, the aim of this work was to investigate the effect of v3 integrin in cell transendothelial migration and cell adhesion under flow of MDA-MB- 231 tumor cell line using DisBa-01 as v3 integrin antagonist. The 3 subunit was knockdown by 1uL siRNA/ITGB3 and lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used as transfection agent. Additionally cell adhesion under flow, transendothelial migration and time lapse assays were performed using MDA-MB-231 cell line (silenced or not) incubated with 10, 100, 500 and 1000nM of DisBa-01. The 3 integrin knockdown and treatments with DisBa-01 at 500 and 1000nM significantly inhibited cell adhesion as well as the transendothelial migration. The interaction between DisBa-01 and tumor cells was visualized only with 1000nM of disintegrin and not silenced cells. Therefore, it is important using DisBa-01 in different cell lines and in vivo to elucidate more aspects of its effects as anti-metastatic drug. / A metástase depende de uma série de processos celulares tais como adesão celular, a migração transendotelial e proliferação em um novo sítio. Esses eventos são mediados principalmente por integrinas, que são receptores de adesão presentes na superfície celular, responsáveis pela ligação entre a célula e a matriz extracelular. Desintegrinas são pequenas proteínas provenientes de venenos de serpentes, conhecidas por inibir a ação de integrinas e, consequentemente, inibem eventos inerentes à cascata metastática como a migração transendotelial. A DisBa-01 é uma desintegrina recombinante com motivo adesivo RGD, proveniente do veneno de Rhinocerophis alternatus, que possui afinidade pela integrina v3 e atividade anti-metastática in vivo. Assim, este trabalho teve como objetivos estudar o efeito da integrina v3 na migração transendotelial e na adesão de células tumorais da linhagem MDA-MB-231 em células endoteliais (HMEC- 1), sob condição de fluxo pela utilização da DisBa-01 como antagonista deste receptor. Foram realizados ensaios de silenciamento gênico com 5nM de siRNA/ITGB3 e lipofectamina 2000 (Invitrogen) como agente transfectante. Também foram realizados ensaios de adesão celular sob condição de fluxo, migração transendotelial e interação através de time lapse com células tumorais da linhagem MDA-MB-231 (silenciadas ou não) tratadas com DisBa-01 nas concentrações de 10, 100, 500 e 1000nM. O silenciamento da integrina 3, assim o tratamento com DisBa-01 nas concentrações de 500 e 1000nM, inibiu a adesão das células MDA-MB-231 às HMEC-1, sob condição de fluxo e a migração transendotelial. A interação entre a DisBa-01 e as células tumorais foi visualizada somente com células não silenciadas e tratadas com 1000nM de desintegrina. Assim, é importante a utilização da DisBa-01 em diferentes linhagens celulares e modelos in vivo para melhor elucidação dos seus efeitos como possível droga anti-metastática.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMRC.pdf: 2769640 bytes, checksum: 6788308a574e038c255f1acad41740d0 (MD5) Previous issue date: 2004-06-09 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work presents the isolation and biological characterization of a novel metalloprotease/disintegrin, BaG, isolated from the Bothrops alternatus snake venom. BaG was purified in a two-step chromatographic model using Gelatin-Sepharose and DEAE-Sepharose resins. The molecular mass of purified protein was estimated by SDS-PAGE as approximately 130kDa under non-reducing conditions and 55kDa under reducing conditions. This result suggests a dimeric structure for BaG. BaG shows proteolytic activity on casein, which was inhibited by EDTA. This protein did not induce any hemorrhage when applied intradermally in mice at doses up to 10µg. 1,10-phenanthroline-treated BaG (BaG-I) inhibits ADPinduced platelet aggregation with an IC50 of approximately 180nM. BaG-I also inhibits fibronectina-mediated cell adhesion with an IC50 of 3.65µM. K562 cells bind to BaG-I probably though interaction with integrin α5β1, since anti-α5β1 antibodies inhibited K562 cell adhesion to BaG-I. BaG-I also induces the detachment of K562 cell previously bound to fibronectin and decreases the number of viable K562 cells after 24, 48 and 72h of incubation. In the second part of this work, gene expression analyses in human fibroblasts treated with alternagin-C (ALT-C) were carried out. ALTC is a disintegrin-like/cysteine-rich protein isolated from the venom of B. alternatus. This protein induces the expression of various cell signaling- and cell proliferation-related genes including VEGF, which was confirmed by ELISA analysis. This induction could explain some previous results showing that ALT-C stimulates cell proliferation in endothelial cells. / Esta tese apresenta o isolamento e a caracterização biológica de uma metaloprotease/desintegrina, BaG, isolada a partir do veneno bruto da serpente Bothrops alternatus. A BaG foi purificada através de duas etapas cromatográficas em resina de Gelatina-Sepharose 4B e DEAESepharose. A massa molecular da proteína purificada foi de aproximadamente 130kDa em condições não redutoras e de 55kDa em condições redutoras. Tal comportamento migratório distinto em SDSPAGE sugere uma estrutura dimérica para a BaG. A BaG apresentou atividade proteolítica sobre a caseína, a qual foi inibida na presença de EDTA. A BaG (10µg) não foi capaz de formar halos hemorrágicos após ser introduzida sub-cutaneamente em camundongos, o que sugere um caráter não hemorrágico para esta proteína. A BaG tratada com 1,10- fenantrolina (BaG-I) inibiu a agregação plaquetária induzida por ADP com um IC50 de 180nM e a inibiu também a adesão de células da linhagem K562, mediada por fibronectina com um IC50 de 3,65µM. A BaG liga-se à integrina α5β1, presente na superfície das células K562 e é capaz de promover a desadesão destas células, previamente aderias à fibronectina, além de diminuir a viabilidade desta mesma linhagem celular após 24, 48 e 72h de incubação. Na segunda parte deste trabalho, foram realizadas análises de expressão gênica em fibroblastos humanos, após o tratamento destes com a alternagina-C (ALT-C). A ALT-C é uma proteína que apresenta os domínios desintegrina-like/rico em cisteína, isolada do veneno de B. alternatus. Esta proteína mostrou induzir a expressão de várias moléculas relacionadas a eventos de proliferação e sinalização celular, dentre elas o VEGF, o que foi comprovado através de ensaios de ELISA. Este indução da expressão de VEGF poderia explicar resultados prévios obtidos com a ALT-C nos quais esta proteína é capaz de induzir a proliferação em células endoteliais.

Metaloproteases/desintegrinas (MD) isoladas de venenos de serpentes são potentes inibidores de agregação plaquetária e de adesão celular, processos envolvidos em doenças como trombose e câncer. As MD pertencem a classe PIII das SVMPs (´snake venom metalloproteinases´) que são constituídas por três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) e rico em cisteína (C). A função dos três domínios nas atividades das moléculas ainda não é totalmente conhecida, e estudos com o objetivo de esclarecer suas funções são importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Algumas proteínas da classe PIII apresentam elevada atividade auto-proteolítica (liberando peptídeo constituído dos domínios D e C) enquanto que em outras PIII esta atividade não é menos evidente. Neste trabalho nós estudamos MD isoladas de veneno de Bothrops jararaca (bothropasina) e Bothrops alternatus (alternagina) em relação aos seus processos de autólise. Alternagina e bothropasina apresentaram diferentes comportamentos em relação à auto-proteólise, apesar do elevado grau de identidade entre as duas moléculas. Nesse trabalho, caracterizamos a estabilidade química e o comportamento de desenovelamento da proteína alternagina nativa pela guanídina HCl usando emissão de fluorescência intrínseca em combinação com espectroscopia de dicroísmo circular ´far´-UV. As amostras de alternagina, purificadas do veneno liofilizado, foram monitoradas por dicroísmo em comprimento de onda de 220nm e os resultados mostraram estruturas intermediárias no processo de desnaturação da proteína. Estudos semelhantes foram feitos com a bothropasina, com o objetivo de relacionar seus diferentes comportamentos auto-proteolíticos com os processos de desnaturação. Nas duas proteínas ocorreu uma alta correlação entre os estudos de auto-proteolise e de desnaturação. As MD isoladas de B. jararaca, jararagina e bothropasina, são isoformas descritas na literatura como isoláveis através de diferentes cromatografias. Neste trabalho, utilizamos os diferentes protocolos descritos para verificar a porção da isoforma majoritária no veneno. As amostras de proteína serão analisadas por espectrometria de massas, uma vez que a região N-terminal das proteínas está bloqueada. / Metalloproteinases/disintegrin (MD) isolated from snake venom are potent inhibitors of platelet aggregation and cell adhesion, processes involved in illnesses as cancer and thrombosis. MD belong to the PIII class of the metalloproteinase/disintegrin gene family and they are constituted by three domains: the catalytic domain, metalloprotease; disintegrin-like (D) and cysteine-rich (R). Some MD proteins are rapidly processed (producing the disintegrin-like/ cysteine-rich domains), while others MD are processed slowly. In this work, we studied the autolysis process of the MD isolated from the venom of Bothrops jararaca (bothropasin) and Bothrops alternatus (alternagin). Despite high sequence identity, alternagin and bothropasin showed different autolysis processes. The processing of the alternagin produces an intermediate with molecular mass of 43kDa whereas in the processing of the bothropasin this intermediate is almost not observable. In this work we studied alternagin and bothropasin under the viewpoint of chemical stability and the unfolding process to guanidine hydrochloride (Gnd-HCl) using dichroism circular and fluorescence spectrometry. The CD spectra (220nm) of the alternagin purified from the lyophilized venom showed an intermediate structure in the unfolding process. These studies were performed on bothropasin with the goal to relate the autolysis and unfolding process. These studies revealed a high correlation between both proteins . The MD isolated from B. jararaca, jararagin and bothropasin, are isophorms purified from different chromatograph processes reported in the literature. In this work, different purification processes were used to check the major isophorm. Due to the blocked N-terminal region, these proteins will be assessed by mass spectrometry.

A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer. / DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3800.pdf: 3103184 bytes, checksum: b20924abb8bacc68de4e6fa59d95ebdd (MD5) Previous issue date: 2011-06-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / This work presents the study of the effects of an RGD disintegrin from Rhinocerophis alternatus (ancient Bothrops alternatus) in key steps of the metastatic cascade. Disintegrins are cysteine-rich peptides, which have several biological activities related to cell-cell interaction and cell adhesion. The correct pairing of disulfide bonds exposes the adhesive motif which confers binding specificity of disintegrins. These molecules selectively blocks the adhesive function of integrins, which directly participate in various physiological and pathological processes. In the first part of this work, we use the DisBa-01, a disintegrin from B.alternatus in fusion with 6 histidines in pET28a expression vector. The DisBa-01 in the flow system inhibited adhesion of B16F10 melanoma cells and platelets to type I collagen and activated the adhesion of B16F10 melanoma cells to type III collagen. In transmigration and adhesion of breast cancer cells MDA-MB-231, the DisBa-01 had the tendency to reduce these stages of metastatic cascade. The disintegrins have been instrumental in the development of molecules with potential therapeutic application and the effects produced by DisBa-01 in this work as well as others from our laboratory, led us in the second part of this work, the production of the disintegrin B.alternatus without the fusion peptide (called ATN) which conferred increased solubility of the disintegrin. ATN was isolated by two molecular exclusions chromatography and ion exchange chromatography and biological characterization was directed to the anti-metastatic effect of this molecule. In this sense, the ATN was unable to promote the adhesion of human erythroleukemia K562 cells, but inhibited the adhesion of tumor cells K562, B16F10 and MDA-MB-231 to fibronectin had no effect in fibroblasts. ATN is not able to detach the fibroblasts adhered to fibronectin but promotes the detachment of K562 and B16F10 cells previously adhered to fibronectin. However, it does not induce fragmentation of cellular DNA, showing no pro-apoptotic effect. In cell proliferation, the ATN has negative effect with 48 hours of incubation with B16F10 tumor cells, but fibroblasts and MDA-MB-231 this effect was not observed. By flow cytometry we observed the interaction of ATN with αvβ3 integrin. The MDA-MB-231 Tx migration was inhibited by ATN and changed the actin cytoskeleton of these cells. However, an increased activity of MMP-9 was observed in MDA-MB-231 treated with ATN and the invasion of MDA-MB-231 was induced by the RGD disintegrin. These results encourage further studies with this disintegrin in seeking the best concentração of the disintegrin, the identification of cytotoxic activity as well as the best method of distribution of this molecule in vivo. / Este trabalho apresenta o estudo dos efeitos de uma desintegrina RGD de Rhinocerophis alternatus (antiga Bothrops alternatus) nas principais etapas da cascata metastática. Desintegrinas são peptídeos ricos em cisteína, os quais apresentam diversas atividades biológicas relacionadas à interação célula-célula e adesão celular. O pareamento correto das pontes de dissulfeto expõe o motivo adesivo, o qual confere a especificidade de ligação das desintegrinas. Estas moléculas seletivamente bloqueiam a função adesiva das integrinas, as quais participam diretamente de diversos processos fisiológicos e patológicos. Na primeira parte deste trabalho utilizamos a DisBa-01, uma desintegrina de B.alternatus fusionada com 6 histidinas em sequência referente ao peptídeo de fusão presente no vetor pET28a. A DisBa-01 em sistema de adesão sob fluxo inibiu a adesão de células de melanoma B16F10 e de plaquetas ao colágeno tipo I e ativou a adesão das células de melanoma B16F10 ao colágeno tipo III. Na transmigração e na adesão das células de câncer de mama MDA-MB-231 pelas células endoteliais, a DisBa-01 apresentou a tendência à redução destas etapas da cascata metastática. As desintegrinas têm sido instrumentos no desenvolvimento de moléculas com potencial aplicação terapêutica e juntamente com esses efeitos apresentados pela DisBa-01 neste trabalho assim como em outros de nosso laboratório, nos conduziu para a segunda parte deste trabalho, a produção da desintegrina de B.alternatus sem o peptídeo de fusão (ATN) que conferiu aumento de solubilidade da desintegrina. A ATN foi isolada através de duas cromatografias de exclusão molecular e uma cromatografia de troca de iônica e a caracterização biológica foi direcionada ao papel anti-metastático desta molécula. Neste sentido, a ATN não foi capaz de promover a adesão das células de eritroleucemia humana (K562), mas inibiu a adesão das células tumorais K562, B16F10 e MDA-MB-231 à fibronectina, mas não apresentou efeito sobre os fibroblastos. A ATN não desadere os fibroblastos aderidos à fibronectina mas, promove o descolamento das células K562 e B16F10 previamente aderidas à fibronectina. No entanto, não induz fragmentação do DNA celular, não apresentando efeito pró-apoptótico. Na proliferação celular, a ATN apresenta efeito com 48 horas de incubação com células tumorais B16F10 mas, em fibroblasto e células MDA-MB-231 esse efeito não foi observado. Por citometria de fluxo verificamos a interação da ATN com a integrina αvβ3. A migração das células MDA-MB-231 Texas foi inibida pela ATN assim como alterou o citoesqueleto de actina destas células. No entanto, um aumento da atividade da MMP-9 foi observado nas células MDA-MB-231 tratadas com ATN assim como a invasão das células MDA-MB-231 foi induzida por esta desintegrina-RGD. Estes resultados incentivam a continuação dos estudos com esse peptídeo no sentido de buscar a melhor concentração desta desintegrina, a identificação de atividade citotóxica assim como melhor método de distribuição desta molécula in vivo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCHBT.pdf: 1076798 bytes, checksum: a3573c0b2fab64ec79341d9ff5185211 (MD5) Previous issue date: 2004-11-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / The α2β1 integrin is a major collagen receptor that plays an essential role in the normal and tumor cells adhesion to the extracellular matrix, as well as in the metastasis. Antagonists of integrins have been developed in order to provide powerful therapeutic approaches for the several types of cancer and metastasis treatment. A metalloproteinase/disintegrin was isolated, which is a specific inhibitor of the collagen type I binding to α2β1 integrin. This 55-kDa protein (Alternagin) and its disintegrin-like 30-kDa domain Alternagin-C (ALT-C) were isolated from the Bothrops alternatus a brazilian snake - venom. This disintegrin-like domain has an additional cysteine-rich domain, which is not found in RGD-disintegrins, and the RGD motif is replaced by an ECD sequence. So, the purposes of the project were (1) Evaluate the effect of ALT-C on tumor and non-tumor cell adhesion, proliferation and migration, (2) To study the effects of ECD-motif derived peptides on tumor and non-tumor cell adhesion. ALT-C inhibited the adhesion of NITH3T3, human bladder ECV-304, human cervix HeLa and breast MDA-MB-231cells to collagen type I (IC50 of 2.2, 1.66, 1.38 and 0,95µM respectively). Besides, when immobilized on plate wells, ALT-C supported the adhesion of these cell lines. ALTC did not detach cells which were previously bound to collagen type I. In the presence of collagen type I, ALT-C stimulates the migration of MDA-MB-231 cells and in greater concentrations it inhibits migration. ALT-C does not inhibit the adhesion and the migration of estrogen dependent MCF-7 cells. ALT-C also induces significant HUVEC proliferation in vivo, by up-regulating VEGF expression in human fibroblasts and endothelial cells. ALT-C also strongly activates Akt/PKB phosphorylation, a signaling event involved in endothelial survival and angiogenesis. In addition, related to the up-regulation of the VEGF´s expression, ALT-C up-regulates other growth factors expression involved in cell proliferation, such as IL-11, TGFβ, and EGR2 and 3, which are probably also involved on its positive effect on HUVEC proliferation. These biological activities of ALT-C can be useful in anti-cancer therapy experimental studies. / A integrina-α2β1 é o principal receptor do colágeno tipo I, o qual possui papel essencial na adesão de células normais e tumorais à matriz extracelular, bem como no desenvolvimento de metástases. Portanto, desintegrinas que inibem especificamente a ligação do colágeno com a integrina-α2β1, são importantes ferramentas para o estudo do câncer metastático e para o desenvolvimento de derivados peptídicos inibidores de células tumorais invasivas (drogas antimetastáticas). Foram isoladas do veneno da serpente Bothrops alternatus ,uma metalopeptidase (Alternagina) de 55 kDa e seu domínio processado, Alternagina-C (ALT-C) (30 kDa). A ALT-C tem no domínio desintegrina a sequência adesiva ECD ao invés da seqüência RGD. Esta desintegrina-símile inibe a adesão mediada pelo colágeno tipo I de células transfectadas K562-α2β1, e a inibição é dose dependente (IC50- 100 nM). Assim, este projeto propôs (1) o estudo do efeito da ALT-C sobre células normais e tumorais através da realização de ensaios biológicos de adesão celular, migração e proliferação celulares, e (2) Ensaios biológicos com peptídeos sintéticos contendo a seqüência adesiva ECD da ALT-C. A ALT-C inibiu a adesão das linhagens celulares NITH3T3, MDA-MB- 231, HeLa, ECV-304 ao colágeno tipo I, com uma IC50 de 0,95; 1,38; 1,66 e 2,2µM respectivamente. Quando imobilizada em placas, a ALT-C promoveu a adesão das linhagens NITH3T3, HeLa e ECV-304. A ALT-C não foi capaz de desaderir linhagens NITH3T3, HeLa e ECV-304, estando estas previamente aderidas ao seu substrato. Em presença de colágeno tipo I, a ALT-C induziu a migração das células MDA-MB-231 e, em altas concentrações ela inibiu este efeito. A ALT-C não exerceu efeito inibitório ou indutor sobre a adesão ou a migração da linhagem celular dependente de estrógeno MCF-7, que expressa baixos níveis da integrina- α2β1 quando comparada com as demais linhagens estudadas. Quanto aos peptídeos sintéticos testados, mesmo em concentrações mais elevadas não foram capazes de inibir a adesão das células K562-α2β1 de forma significativa. A ALT-C, tanto na forma solúvel quanto na forma imobilizada ao plástico, induziu a proliferação celular em HUVECs e este efeito poderia estar relacionado com um aumento da expressão de fatores de crescimento. Em células da linhagem NITH3T3, a ALT-C na forma solúvel induziu de forma significativa a expressão de VEGF. A ALT-C também aumentou a expressão de outros fatores de crescimento, tais como IL-11, TGFβ e EGR2 e 3, os quais provavelmente estão envolvidos no efeito positivo sobre a proliferação celular das HUVECs e outros tipos celulares. Diante destes resultados, podemos concluir que a ALT-C pode vir a ser uma potencial ferramenta terapêutica para modelos de estudo sobre o câncer e para o desenho de fármacos que atuem especificamente em linhagens celulares tumorais que expressem a integrina α2β1, inibindo a adesão destas ao colágeno tipo I.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJUR.pdf: 1290933 bytes, checksum: 72ad2925663cff469dc6dc50316dbf22 (MD5) Previous issue date: 2005-02-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Disintegrins are snake venom proteins used in the study of integrin-mediated cellular adhesion through integrins. Recombinant disintegrin production may notable supply faster, larger and most homogeneous protein samples than bruit venom processing. This work describes optimization of the recombinant ACLD-C expression technique. ACLD-C is a disintegrin-like protein from Agkistrodon contortrix laticinctus, that have a disintegrin-like domain with DCD motif, and a cysteine-rich domain. This protein was subcloned from the ACLD clone (GenBank U86634), a metallopeptidase. A protocol of expression was established in our laboratory, where recombinant ACLD-C is produced in E. coli, using the expression vector pMal-p. This allows protein target expression in form of N-terminal fusion with MBP (maltose-binding protein), that facilitate purification, correct folding and production of disintegrin in soluble form. In fact, MBP/ACLD-C was was expressed in soluble form and purified in two stages: affinity comatography in amilose resin and cromatography of gel-filtration in superdex-200 resin. Modifications in expression protocol optimized MBP/ACLD-C expression in culture of 0,4 mg/L of culture of 1,2 mg/L (12,6% total of protein in periplasmic space of E.coli). MBP/ACLD-C imobilizated in amilose resin was subjected to digestion with enzyme factor Xa to separate ACLD-C of MBP. The separation was confirmed through positive reaction with anti-ALT-C antibody. ALT-C is a disintegrin-like protein from Bothrops alternatus. ALT-C induced both expression of VEGF in human fibroblasts and proliferation of endothelial cells and angiogenesis. In second part of this work, we investigated if MBP/ACLD-C was also able to induce the expression of this growth factor in this cells. MBP/ACLD-C and two other disintegrins, echistatina, a disintegrin-RGD, and EC6, a heterodimeric disintegrin, were incubated with fibroblasts. The influency of these proteins in VEGF expression was evaluated by ELISA. MBP/ACLD-C was able to strongly induce the expression of VEGF until 4 hours, when the level decreased until 24 hours. Experiment in period of 24 48 hours was not done due to problems of contaminations. Echistatin did not induced VEGF expression, but induced fibroblasts dettachment from plastic. The latter event was not observed in MBP/ACLD-C or EC6 incubated cells. / As desintegrinas são proteínas de veneno de serpente usadas no estudo de processos biológicos envolvendo a adesão celular mediada por integrinas. A produção de desintegrinas recombinantes é de grande importância para tais estudos, pois podem ser obtidas de forma mais rápida, com maior rendimento e qualidade mais constante quando comparada com a obtenção a partir de veneno bruto. Esta dissertação descreve a otimização da expressão da ACLD-C recombinante. ACLD-C é uma proteína tipo desintegrina da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus, que possui um domínio desintegrina-like com um motivo DCD e um domínio rico em cisteína. Esta proteína foi subclonada a partir do clone da ACLD (GenBank U86634), uma metalopeptidase. Um protocolo de expressão foi estabelecido em nosso laboratório, onde ACLD-C recombinante é produzida em E. coli, utilizando-se o vetor de expressão pMal-p. Este vetor possibilita a expressão da proteína-alvo na forma de fusão Nterminal com a proteína MBP (maltose-binding protein), a qual facilita a purificação, o enovelamento correto e a produção da desintegrina na forma solúvel. De fato, MBP/ACLD-C foi expressa na forma solúvel e purificada em duas etapas: cromatografia de afinidade em resina de amilose e cromatografia de gel-filtração em resina superdex-200. Modificações no protocolo de expressão permitiram a otimização da expressão da MBP/ACLD-C de 0,4mg/L de cultura para 1,2mg/L de cultura O rendimento final da MBP/ACLD-C foi de 1,2mg/L de cultura (12,6% do total de proteínas no espaço periplásmico de E. coli). MBP/ACLD-C imobilizada em resina de amilose foi submetida à reação de clivagem com a enzima fator Xa para separar ACLD-C da MBP. A separação foi confirmada através da reação positiva ao anticorpo anti-ALT-C, uma desintegrina-like de Bothrops alternatus. Estudos com ALT-C mostraram que ela foi capaz de induzir a expressão de VEGF (vascular endothelial growth factor) em fibroblastos humanos e induzir a proliferação de células endoteliais e a angiogênese. Assim, resolveu-se investigar se MBP/ACLD-C também é capaz de induzir a expressão deste fator de crescimento nestas células, o que constitui a segunda parte deste trabalho. MBP/ACLD-C e outras duas desintegrinas, echistatina, uma desintegrina-RGD, e EC6, uma desintegrina heterodimérica, foram incubadas com os fibroblastos para verificar a influência dessas proteínas na expressão de VEGF através de ensaios de ELISA. MBP/ACLD-C foi capaz de induzir fortemente a expressão de VEGF até 4h, quando o nível da citocina decresceu até 24 e novamente aumentou até 48h. EC6 também foi capaz de induzir a expressão do fator de crescimento até 4h, quando o nível também decresceu até 24h. O experimento no período de 24h-48h não foi realizado devido a problemas de contaminação. Echistatina, por sua vez, não apresentou indução de VEGF em relação ao controle, e as células incubadas com essa desintegrina desaderiram do plástico, o que não ocorreu com as outras duas proteínas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2038.pdf: 5348158 bytes, checksum: 8a697074e2ede1b8364027f59658d726 (MD5) Previous issue date: 2008-05-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / Angiogenesis and wound repair are mediated by several growth factors that are strictly released. Alternagin-C (ALT-C), a disintegrin-like protein from the venom of Bothrops alternatus induces in vivo angiogenesis as well as the cyclic peptide derived from its primary structure, with the ECD motif (ALT-C PEP). This study investigated the effects of ALT-C and ALT-C PEP on angiogenesis and expression of growth factors in a model of wounded rat skin. The rats were anaesthetized; one cutaneous excision (4 mm diameter) was made on the back of each animal, close to the cervical area. Animals were then divided into 7 groups (five rats/group): control (treated with vehicle); locally treated with 10, 60 and 100 ng ALT-C or 10, 20 and 100 ng ALT-C PEP ALT-C PEP for 1, 3, 5 or 7 consecutive days. At the end of experiments animals were killed, the skin was removed; the cranial portion was used for histological analysis and from the caudal portion; protein were extracted, separated by SDS-PAGE and VEGF, FGF-1, TGFβ1, PDGF, IGF1 e TGFα expression was analyze a by Western blotting. The results show that both, ALT-C and ALT-C PEP induced the formation of new vessels, stimulate collagen synthesis and modulated the expression of growth factors, mainly VEGF and FGF1. The increase in VEGF expression could be detected up to 7 days after injury. FGF1 was also significantly increased, but at a lesser extension than VEGF. In conclusion, we present a protein belonging to the disintegrin group of snake venom toxins stimulates angiogenesis and collagen synthesis in an injured tissue. ALT-C may exert its effects via integrin binding and growth factor modulation. As angiogenesis is an important event for wound healing, ALT-C and ALT-C PEP could be candidates to the development of a new drug for wounded skin repair or regeneration. / A angiogênese e o reparo tecidual são mediados por vários fatores de crescimento estritamente liberados. A Alternagina-C (ALT-C), uma proteína tipo-desintegrina derivada do veneno de Bothrops alternatus induz angiogênese in vivo, bem como, o peptídeo cíclico derivado de sua estrutura primária contendo o motivo ECD (ALT-C PEP). O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da ALT-C e do ALT-C PEP sobre a angiogênese e a expressão de fatores de crescimento em um modelo de lesão em pele de rato. Os animais foram anestesiados e foi induzida uma lesão esférica, com punch de 4 mm, na região interescapular. Os animais foram divididos em 7 grupos (5 ratos/grupo): controle (tratado com veículo); tratados com ALT-C (10, 60 ou 100 ng) e ou de ALT-C PEP (10, 20 ou 100 ng) por 1, 3, 5 e 7 dias consecutivos. Ao final do experimento, os animais foram submetidos à eutanásia, a pele lesada foi removida e dividida ao meio. A porção cranial foi usada para análise histológica e da porção caudal, as proteínas foram extraídas, separadas por SDS-PAGE e a expressão de VEGF, FGF-1, TGFβ1, PDGF, IGF1 e TGFα foi analisada por Western blotting. Os resultados demonstram que ambos, ALT-C e ALT-C PEP induzem a formação de novos vasos, estimulam a síntese de colágeno e modulam a expressão de fatores de crescimento, principalmente VEGF e FGF1. O aumento da expressão de VEGF pôde ser detectado até 7 dias após a lesão. O FGF1 também aumentou significativamente, mas em menor extensão do que o VEGF. Em conclusão, apresentamos uma proteína pertencente ao grupo das desintegrinas de veneno de serpentes que estimula a angiogênese e induz a síntese de colágeno em tecido lesado. A ALT-C pode exercer os seus efeitos via ligação com integrina vinculada à modulação de fatores de crescimento. Como a angiogênese é um acontecimento importante para a cicatrização, ambos, ALT-C e ALT-C PEP parecem ser bons candidatos para o desenvolvimento de um novo fármaco auxiliar da regeneração de pele lesada.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4455.pdf: 6484329 bytes, checksum: 0fee43406bc059da2f0e202d0d04a19e (MD5) Previous issue date: 2011-08-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cell migration, invasion of the surrounding tissues, blood vessels and proliferation are cellular processes involved in metastases. These events are mediated by integrins, adhesion receptors present on cell surfaces and responsible for the extracellular matrix and cells binding. Disintegrins, snake venoms polypeptides, are known to inhibit integrins action, and thus metastatic events such as cell migration. They also have influence on metallopeptidases activity, enzymes that cleave ECM components facilitating tumor cells invasion. DisBa-01 is a recombinant RGD disintegrin from Rhinocerophis alternatus (Bothrops alternatus) venom gland. In previous studies we have demonstrated that DisBa-01 binds to _v_3 integrin with high affinity and has an anti-metastatic activity. Therefore the aim of this study was to investigate the effect of DisBa-01 on migration and MMPs activities in fibroblasts and cell lines of breast cancer, MDA-MB-231, prostate, DU-145 and murine melanoma, B16F10. Transwell migration tests, wound healing and gelatin gel zymography were performed using DisBa-01 at concentrations of 10, 100, 500 and 1000 nM. Transwell migration was significantly inhibited in fibroblasts, MDA-MB-231 and DU-145 but had no effect on B16F10 cells, which had fibroblast conditioned medium as chemoattractant. In wound healing assays only DU-145 migration in a 1000nM concentration was significantly inhibited. Finally, zymography was performed using wound healing assay conditioned medium to analyze the presence of MMPs 2 and 9. In fibroblasts and B16F10 cells MMP-2 and MMPs 2 and 9 were decreased respectively. On the other hand, MDA-MB-231 cells showed increased MMP-9 activity, in all concentrations tested. Given the results, DisBa-01 can be used to build models for possible drugs rational design that may act in anti-metastatic therapy, in addition to its use as a research tool to elucidate integrins related mechanisms. / Uma série de processos celulares está envolvida na metástase, entre eles a migração e invasão celular dos tecidos vizinhos, vasos sanguíneos e proliferação. Esses eventos são mediados por integrinas, receptores de adesão, presentes nas superfícies celulares, responsáveis pela ligação das células com a matriz extracelular. As desintegrinas, polipeptídeos provenientes de venenos de serpentes, são conhecidos por inibir a ação das integrinas e, consequentemente, eventos como a migração, que ocorrem durante a metástase. Possuem ainda, influência sobre a atividade das metalopeptidases (MMPs), enzimas que clivam a MEC facilitando a invasão das células tumorais. A DisBa-01 é uma desintegrina recombinante que possui motivo RGD e é proveniente do veneno da Rhinocerophis alternatus (Bothrops alternatus). Estudos anteriores comprovaram sua alta afinidade pela integrina _v_3 e atividade anti-metastática in vivo. Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar a ação da DisBa-01 sobre a migração e atividade das MMPs de fibroblastos e das linhagens de câncer de mama, MDA-MB-231, próstata, DU-145 e melanoma murino, B16F10. Foram realizados ensaios de migração em transwell, wound healing, e zimografia em gel de poliacrilamida acrescido de gelatina utilizando a DisBa-01 nas concentrações de 10, 100, 500 e 1000nM. A inibição da migração em transwell foi significativa nos fibroblastos, MDA-MB-231 e DU-145, porém não houve efeito sobre a linhagem B16F10, que teve como quimioatraente o meio condicionado de fibroblastos. Nos ensaios de wound healing apenas a concentração de 1000 nM da DU-145 foi inibida de forma significativa. Finalmente, a zimografia foi realizada utilizando meio condicionado de ensaios wound healing para analisar a presença das MMPs 2 e 9. Nos fibroblastos e B16F10 a atividade da MMP-2 e as MMPs 2 e 9 foram inibidas respectivamente. Enquanto a linhagem MDA-MB-231 teve a secreção da MMP-9 estimulada, em todas as concentrações, de forma significativa. Tendo em vista os resultados, a DisBa-01 pode ser utilizada na construção de modelos para o desenho racional de possíveis fármacos que atuem na terapia anti-metastática, além da sua utilização como instrumento de pesquisa para elucidação de mecanismos relacionados as integrinas.

A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer. / DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.