A resistência que apresentam as serpentes peçonhentas às suas próprias peçonhas, assim como a resistência observada em alguns animais está bem documentada, e é atribuída a fatores solúveis presentes no seu plasma, soro ou músculo. No caso das serpentes peçonhentas estes fatores as amparam de sofrer danos decorrentes da própria peçonha. No presente trabalho foi isolado do soro da serpente Bothrops alternatus um inibidor de metaloproteases, denominado BaltMPI, mediante cromatografia em DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL e cromatografia de fase reversa em C18, com uma recuperação proteica de 0,3%. A massa molecular determinada para o BaltMPI por SDS - PAGE foi de 60,5 kDa, e por espectrometria de massas MALDI/TOF de 42,4 kDa. Seu ponto isoelétrico, determinado por focalização isoelétrica, é 5,27. Portanto, o BaltMPI, é um SVMPIs com caráter ácido, pertencente aos SVMPIs de baixa massa molecular. Os primeiros 60 aminoácidos da região N-terminal do BaltMPI foram determinados mediante degradação de Edman, e apresentou alto grau de homologia com a sequência para a mesma região de outros SVMPIs isolados a partir do soro de serpentes peçonhentas. Outros segmentos da sequência também foram determinados após clivagem com tripsina e posterior análise por espectrometria de massas. Posteriormente realizou-se o alinhamento da sequência parcial determinada para o BaltMPI, com a sequência do BJ46a, um SVMPI proveniente da Bothrops jararaca, encontrando alta homologia entre elas. Tanto o soro da serpente, quanto o inibidor, BaltMPI, inibiram a atividade hemorrágica da Batroxase, uma SVMP da classe P-I, e a da BjussuMP-I, uma SVMP da classe P-III. Já, em relação à DHM da Batroxase, foi determinado que o BaltMPI tem uma DIHM de 5ug, e uma CE50% de 0,857ug. O BaltMPI também apresentou um efeito inibitório sobre a ação proteolítica da Batroxase, sobre os substratos: fibrinogênio, fibrina e azocaseína. Sobre a atividade fibrinogenolítica da serinoprotease BjSP, o BaltMPI não apresentou um efeito inibitório, corroborando assim com a especificidade descrita para inibir as SVMPs que possuem os SVMPIs. O BaltMPI inibiu a ação hemorrágica e proteolítica da Batroxase, ao formar um complexo mediante ligações não covalentes com esta SVMP. O inibidor BaltMPI, ao igualmente aos demais SVMPIs descritos, é estável em uma ampla faixa de pH (1 - 9), e a temperaturas elevadas, sendo que em temperaturas acima de 60°C foi observada uma diminuição na sua capacidade de inibir a atividade hemorrágica da Batroxase. A inibição da atividade hemorrágica da Batroxase, quando avaliado o potencial do BaltMPI como complemento à soroterapia, foi menor à inibição observada ao realizar os testes com incubação prévia entre o inibidor e a metaloprotease. No entanto, os resultados obtidos são promissores, reforçando o grande potencial que os SVMPIs possuem, tanto como ferramentas moleculares, como opção para o tratamento dos acidentes ofídicos, em especial o acidente botrópico, no qual as SVMPs tem papel fundamental na fisiopatologia observada, e que conduz à alta morbidade associada com este tipo de acidente. / Resistance exhibited by snakes to their own venom, as well as resistance observed in some animals has been well recorded, and has also attributed to soluble factors present in the plasma, serum or muscle. In the case of poisonous snakes, these factors protect them from damages caused by their own venom. An inhibitor, named as BaltMPI, was isolated from the snake´s serum of Bothrops alternates. This inhibitor was isolated through several chromatographic steps including DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL and C-18 reverse phase, with a protein yield of 0.3%. Molecular mass of 60.5 kDa for BaltMPI was determined by SDS - PAGE and 42.4 kDa by MALDI/TOF mass spectrometry. Its isoelectric point, determined by isoelectric focalization, was 5.27. According to the obtained data, it was established that BaltMPI is an SVMPIs of acid character, belonging to low molecular mass SVMPIs. The first 60 aminoacids from the N-terminal region were determined by Edman degradation. This parcial sequence showed high homology to the corresponding sequence of other SVMPIs isolated from poisonous snake´s serum. Other segments from the sequence were also determined after cleavage with tripsine and MS analyses. Consequently, alignment of the partial sequence of BaltMPI with the sequence of BJ46a, a SVMPI from Bothrops jararaca, was made finding high homology. Both, snake´s serum and BaltMPI, inhibited the hemorragic activity of Batroxase, a class P-I SVMP, and of BjussuMP-I, a class P-III SVMP. When compared to the Batroxase DHM, it was determined a DIHM of 5?g and a CE50% of 0.857?g. BaltMPI also exhibited an inhibitory activity against the proteolitic effect of Batroxase on fibrinogen, fibrin and azocasein as substrates. On the fibrinogenolitic activity of serineprotease BjSP, BaltMPI did not showed inhibitory effect, demonstrating its specificity for inhibiting SVMPs that SVMPIs possess. BaltMPI inhibits the hemorragic and proteolitic action of Batroxase by forming a complex through non covalent linkages with that SVMP. BaltMPI, as well as other reported SVMPIs, is stable in a very high range of pH (1-9), and at high temperatures, although above 60°C a decrease in its inhibition capacity to the hemorrhagic activity of Batroxase. Inhibition of the hemorrhagic activity of Batroxase, when BaltMPI potencial as serum-therapy complement was evaluated, was less than the inhibition observed when tests by previously incubating inhibitor and metalloprotease were made. However, the results obtained are encouraging, highlighting the potential that these kind of proteins, SVMPIs, have as molecular tools, optional treatments for ophidic accidents, specially bothropic accident, in which SVMPs have a fundamental role in the observed physiopathology, leading to a high associated morbidity to this kind of accidents.

A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer. / DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.

Orientador: Stephen Hyslop / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T17:40:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renno_AndreLisboa_M.pdf: 4228712 bytes, checksum: 0936c01dc377e3a0ea8aef8156dde24c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops pode resultar em manifestações sitemicas que incluem coagulopatias, hemorragias internas, choque cardiovascular e insuficiência renal aguda, sendo esta última a mais importante causa de morte após a picada. Neste trabalho, analisamos os aspectos morfofuncionais renais, além da expressão e/ou atividades da heme-oxigenase (HO), ciclo-oxigenase (COX) e superóxido dismutase (Cu/Zn-SOD) em ratos. Foi administrada uma dose única da peçonha Bothrops alternatus em ratos Wistar, e após diversos intervalos (1, 3, 6, 24, 48, 72 h e 7 e 15 dias pós-peçonha), foram coletados amostras de urina e os animais eutanasiados, com a coleta do tecido renal para os ensaios enzimáticos, análises de expressão gênica por PCR-real time e imunohistoquímica. A peçonha de B. alternatus causou oligúria, proteinúria, acidificação urinária, aumento da densidade e diminuição da depuração de creatinina; estas alterações foram proeminentes nas primeiras 24 horas pós-peçonha. Análises histológicas reveleram alterações morfológicas, como descamação tubular epitelial e microaneurismas glomerulares. Houve um aumento significativo da expressão gênica da COX-2 em 3 horas pós-peçonha, o que causou no aumento dos níveis de proteínas COX-2 observados no western blot e na imunohistoquímica; não houve mudanças significativas na expressão gênica da COX-1. A HO teve aumento em sua atividade no córtex e medula renal, sendo atribuída este aumento ao aumento da expressão da forma induzível HO-1, com pequenas mudanças da isoforma constitutiva HO-2. A Cu/Zn-SOD demonstrou um aumento da atividade no córtex renal. Estes resultados revelam que a peçonha B. alternatus afeta a função renal com mudanças na expressão/atividade de enzimas renais específicas. O aumento da expressão da HO-1 e da Cu/Zn-SOD pode estar associado a mecanismos de citoproteção no tecido renal, enquanto que o aumento da expressão da COX-2 pode estar ligado a respostas inflamatórias. Entretanto, não se pode descartar a possibilidade de que os produtos da COX-2 poderiam ajudar também na manutenção do fluxo sanguíneo renal. / Abstract: Envenoming by Bothrops snakes can result in systemic manifestations that include coagulopathy, internal hemorrhage, cardiovascular shock and acute renal failure, with the latter being the most important cause of death after such bites. In this work, we examined the changes in renal function and histology and the expression and/or activity of heme-oxygenase (HO), cyclooxygenase (COX) and superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD) in rats. Male Wistar rats were injected with a single dose (0.8 mg/kg, i.v.) of Bothrops alternatus venom and at various intervals thereafter (1, 3, 6, 24, 48, and 72 h and 7 and 15 days post-venom) urine samples were collected and the rats then killed to provide renal tissue for enzymatic assays, analysis of gene expression by real time-PCR and immunohistochemistry. Bothrops alternatus venom caused oliguria, proteinuria, urine acidification, an increase in urine specific gravity and a decrease in creatinine clearance; these alterations were most pronounced in the first 24 h post-venom. Histological analysis revealed morphological alterations that included tubule desquamation and glomerular microaneurysms. There was a significant increase in the gene expression of COX-2 at 3 h post-venom that subsequently reflected in enhanced COX-2 protein levels seen in western blots and immunohistochemistry; there were no significant changes in COX-1 gene expression. HO showed high levels of activity in renal cortex and medulla that was attributable to enhanced expression of the inducible isoform HO-1, with little change in the constitutive isoform HO-2. There was a significant increase in Cu/Zn-SOD activity and expression in the renal cortex. These results show that B. alternatus venom adversely affects renal function in rats and alters the expression and/or activity of selected renal enzymes. The enhanced expression and activity of HO-1 and Cu/Zn-SOD may reflect their involvement in a cytoprotective action in renal tissue, whereas increased COX-2 expression may be related to venom-mediated inflammatory responses, although a role for cyclooxygenase products in the regulation of renal blood flow cannot be excluded. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

A resistência que apresentam as serpentes peçonhentas às suas próprias peçonhas, assim como a resistência observada em alguns animais está bem documentada, e é atribuída a fatores solúveis presentes no seu plasma, soro ou músculo. No caso das serpentes peçonhentas estes fatores as amparam de sofrer danos decorrentes da própria peçonha. No presente trabalho foi isolado do soro da serpente Bothrops alternatus um inibidor de metaloproteases, denominado BaltMPI, mediante cromatografia em DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL e cromatografia de fase reversa em C18, com uma recuperação proteica de 0,3%. A massa molecular determinada para o BaltMPI por SDS - PAGE foi de 60,5 kDa, e por espectrometria de massas MALDI/TOF de 42,4 kDa. Seu ponto isoelétrico, determinado por focalização isoelétrica, é 5,27. Portanto, o BaltMPI, é um SVMPIs com caráter ácido, pertencente aos SVMPIs de baixa massa molecular. Os primeiros 60 aminoácidos da região N-terminal do BaltMPI foram determinados mediante degradação de Edman, e apresentou alto grau de homologia com a sequência para a mesma região de outros SVMPIs isolados a partir do soro de serpentes peçonhentas. Outros segmentos da sequência também foram determinados após clivagem com tripsina e posterior análise por espectrometria de massas. Posteriormente realizou-se o alinhamento da sequência parcial determinada para o BaltMPI, com a sequência do BJ46a, um SVMPI proveniente da Bothrops jararaca, encontrando alta homologia entre elas. Tanto o soro da serpente, quanto o inibidor, BaltMPI, inibiram a atividade hemorrágica da Batroxase, uma SVMP da classe P-I, e a da BjussuMP-I, uma SVMP da classe P-III. Já, em relação à DHM da Batroxase, foi determinado que o BaltMPI tem uma DIHM de 5ug, e uma CE50% de 0,857ug. O BaltMPI também apresentou um efeito inibitório sobre a ação proteolítica da Batroxase, sobre os substratos: fibrinogênio, fibrina e azocaseína. Sobre a atividade fibrinogenolítica da serinoprotease BjSP, o BaltMPI não apresentou um efeito inibitório, corroborando assim com a especificidade descrita para inibir as SVMPs que possuem os SVMPIs. O BaltMPI inibiu a ação hemorrágica e proteolítica da Batroxase, ao formar um complexo mediante ligações não covalentes com esta SVMP. O inibidor BaltMPI, ao igualmente aos demais SVMPIs descritos, é estável em uma ampla faixa de pH (1 - 9), e a temperaturas elevadas, sendo que em temperaturas acima de 60°C foi observada uma diminuição na sua capacidade de inibir a atividade hemorrágica da Batroxase. A inibição da atividade hemorrágica da Batroxase, quando avaliado o potencial do BaltMPI como complemento à soroterapia, foi menor à inibição observada ao realizar os testes com incubação prévia entre o inibidor e a metaloprotease. No entanto, os resultados obtidos são promissores, reforçando o grande potencial que os SVMPIs possuem, tanto como ferramentas moleculares, como opção para o tratamento dos acidentes ofídicos, em especial o acidente botrópico, no qual as SVMPs tem papel fundamental na fisiopatologia observada, e que conduz à alta morbidade associada com este tipo de acidente. / Resistance exhibited by snakes to their own venom, as well as resistance observed in some animals has been well recorded, and has also attributed to soluble factors present in the plasma, serum or muscle. In the case of poisonous snakes, these factors protect them from damages caused by their own venom. An inhibitor, named as BaltMPI, was isolated from the snake´s serum of Bothrops alternates. This inhibitor was isolated through several chromatographic steps including DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL and C-18 reverse phase, with a protein yield of 0.3%. Molecular mass of 60.5 kDa for BaltMPI was determined by SDS - PAGE and 42.4 kDa by MALDI/TOF mass spectrometry. Its isoelectric point, determined by isoelectric focalization, was 5.27. According to the obtained data, it was established that BaltMPI is an SVMPIs of acid character, belonging to low molecular mass SVMPIs. The first 60 aminoacids from the N-terminal region were determined by Edman degradation. This parcial sequence showed high homology to the corresponding sequence of other SVMPIs isolated from poisonous snake´s serum. Other segments from the sequence were also determined after cleavage with tripsine and MS analyses. Consequently, alignment of the partial sequence of BaltMPI with the sequence of BJ46a, a SVMPI from Bothrops jararaca, was made finding high homology. Both, snake´s serum and BaltMPI, inhibited the hemorragic activity of Batroxase, a class P-I SVMP, and of BjussuMP-I, a class P-III SVMP. When compared to the Batroxase DHM, it was determined a DIHM of 5?g and a CE50% of 0.857?g. BaltMPI also exhibited an inhibitory activity against the proteolitic effect of Batroxase on fibrinogen, fibrin and azocasein as substrates. On the fibrinogenolitic activity of serineprotease BjSP, BaltMPI did not showed inhibitory effect, demonstrating its specificity for inhibiting SVMPs that SVMPIs possess. BaltMPI inhibits the hemorragic and proteolitic action of Batroxase by forming a complex through non covalent linkages with that SVMP. BaltMPI, as well as other reported SVMPIs, is stable in a very high range of pH (1-9), and at high temperatures, although above 60°C a decrease in its inhibition capacity to the hemorrhagic activity of Batroxase. Inhibition of the hemorrhagic activity of Batroxase, when BaltMPI potencial as serum-therapy complement was evaluated, was less than the inhibition observed when tests by previously incubating inhibitor and metalloprotease were made. However, the results obtained are encouraging, highlighting the potential that these kind of proteins, SVMPIs, have as molecular tools, optional treatments for ophidic accidents, specially bothropic accident, in which SVMPs have a fundamental role in the observed physiopathology, leading to a high associated morbidity to this kind of accidents.

A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer. / DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.

Mionecrose é uma importante complicação médica resultante de picadas de serpentes e, em casos graves, a mionecrose local pode levar a sequelas drásticas, como a perda de tecido permanente, incapacidade ou amputação do membro. As serpentes peçonhentas e não peçonhentas possuem na corrente sanguínea, proteínas inibidoras de fosfolipases A2 (PLA2s), denominadas PLIs. Uma hipótese que poderia explicar a presença desses PLIs no soro de serpentes peçonhentas seria a auto-proteção contra as enzimas da própria peçonha, que eventualmente, poderiam alcançar o sistema circulatório. No presente trabalho, uma proteína inibitória (denominada ?BaltMIP) que neutraliza as atividades enzimáticas e tóxicas de diversas PLA2s de peçonhas botrópicas foi isolada do plasma da serpente Bothrops alternatus por cromatografia de afinidade utilizando a miotoxina BthTX-I imobilizada em resina Sepharose CNBr ativada. Essa proteína apresentou massa molecular relativa de 24.000 em condições redutoras em SDS-PAGE e maior especificidade de inibição das atividades citotóxicas e miotóxicas das PLA2s símile Lys49 quando comparadas às atividades fosfolipásicas e anticoagulantes de PLA2s Asp49. Além disso, foi realizada a modelagem molecular, através de análises in silico, tanto da estrutura terciária, quanto da quaternária da ?BaltMIP. Ademais, um modelo de interação entre os alfas inibidores de miotoxinas e essas toxinas foi proposto, trazendo uma nova abordagem para o estudo com essas enzimas. Também foi realizada com sucesso a clonagem e expressão deste inibidor, denominado rBaltMIP em sua forma recombinante, sendo realizada em seguida sua caracterização bioquímica parcial. O sequenciamento N-terminal e HPLC de fase reversa mostraram que rBaltMIP foi purificado em um alto grau de pureza, apresentando 100% de identidade sequencial com o inibidor nativo. As propriedades inibitórias de rBaltMIP foram testadas frente às PLA2s e PLA2s-símiles. rBaltMIP foi capaz de inibir parcialmente a atividade fosfolipásica de diferentes enzimas, além de inibir a atividade miotóxica e citotóxica de diferentes PLA2 Lys49. A expressão heteróloga de rBaltMIP possibilitará a obtenção desse inibidor em grande escala, e consequentemente, a realização de trabalhos mais aprofundados no que diz respeito à possível elucidação do mecanismo de inibição das PLA2s de serpentes, o qual ainda não foi totalmente esclarecido. Além disso, novas informações em relação ao mecanismo de ação desses inibidores poderão ser conhecidas, na tentativa de melhor entender a aplicação destes, como novo modelo terapêutico com ação antiofídica na neutralização de diferentes tipos de PLA2s, na suplementação da soroterapia convencional e também na interação molecular com PLA2s. / Myonecrosis is an important medical complication resulting from snakebites and, in severe cases, local myonecrosis can lead to drastic consequences such as permanent tissue loss, disability or limb amputation. Venomous and non-venomous snakes possess proteins that inhibit phospholipases A2 (PLA2s) in their bloodstream, called PLIs. One hypothesis that could explain the presence of these PLIs in the serum of venomous snakes would be the self-protection against their own venom enzymes, which could eventually reach the circulatory system. In the present work, an inhibitory protein (called ?BaltMIP) that neutralizes the enzymatic and toxic activities of several bothropic PLA2s was isolated from Bothrops alternatus plasma by affinity chromatography using the myotoxin BthTX-I immobilized on a CNBr-activated Sepharose resin. This protein showed relative molecular mass of 24,000 under reducing conditions on SDS-PAGE and greater specificity of inhibition of the cytotoxic and myotoxic activities of Lys49 PLA2-like enzymes compared to the anticoagulant and phospholipase activities of Asp49 PLA2s. In addition, molecular modeling was performed by in silico analysis of both tertiary and quaternary structures of ?BaltMIP. Furthermore, a model of interaction between alpha inhibitors of myotoxins and these toxins was proposed, bringing a new approach to the study of these enzymes. Cloning and expression of the inhibitor (called rBaltMIP in its recombinant form) were also achieved successfully, followed by its partial biochemical characterization. Nterminal sequencing and reverse phase HPLC showed that rBaltMIP was purified in a high purity degree, with 100% sequence identity with the native inhibitor. The inhibitory properties of rBaltMIP were tested against PLA2s and PLA2-like enzymes. rBaltMIP was able to partially inhibit the phospholipase activity of different enzymes, also inhibiting the cytotoxic and myotoxic activity of different Lys49 PLA2-like enzymes. Heterologous expression of rBaltMIP should help obtaining such inhibitor in large-scale, and consequently, the performance of further studies on the mechanism of inhibition of PLA2s, which has not yet been fully clarified. In addition, new information regarding the mechanism of action of these inhibitors may be known, in an attempt to better understand the application of these proteins as new therapeutic models with antiophidian action in neutralizing different types of PLA2s, the supplementation of conventional serum therapy and also in the molecular interaction with PLA2s.

Mionecrose é uma importante complicação médica resultante de picadas de serpentes e, em casos graves, a mionecrose local pode levar a sequelas drásticas, como a perda de tecido permanente, incapacidade ou amputação do membro. As serpentes peçonhentas e não peçonhentas possuem na corrente sanguínea, proteínas inibidoras de fosfolipases A2 (PLA2s), denominadas PLIs. Uma hipótese que poderia explicar a presença desses PLIs no soro de serpentes peçonhentas seria a auto-proteção contra as enzimas da própria peçonha, que eventualmente, poderiam alcançar o sistema circulatório. No presente trabalho, uma proteína inibitória (denominada ?BaltMIP) que neutraliza as atividades enzimáticas e tóxicas de diversas PLA2s de peçonhas botrópicas foi isolada do plasma da serpente Bothrops alternatus por cromatografia de afinidade utilizando a miotoxina BthTX-I imobilizada em resina Sepharose CNBr ativada. Essa proteína apresentou massa molecular relativa de 24.000 em condições redutoras em SDS-PAGE e maior especificidade de inibição das atividades citotóxicas e miotóxicas das PLA2s símile Lys49 quando comparadas às atividades fosfolipásicas e anticoagulantes de PLA2s Asp49. Além disso, foi realizada a modelagem molecular, através de análises in silico, tanto da estrutura terciária, quanto da quaternária da ?BaltMIP. Ademais, um modelo de interação entre os alfas inibidores de miotoxinas e essas toxinas foi proposto, trazendo uma nova abordagem para o estudo com essas enzimas. Também foi realizada com sucesso a clonagem e expressão deste inibidor, denominado rBaltMIP em sua forma recombinante, sendo realizada em seguida sua caracterização bioquímica parcial. O sequenciamento N-terminal e HPLC de fase reversa mostraram que rBaltMIP foi purificado em um alto grau de pureza, apresentando 100% de identidade sequencial com o inibidor nativo. As propriedades inibitórias de rBaltMIP foram testadas frente às PLA2s e PLA2s-símiles. rBaltMIP foi capaz de inibir parcialmente a atividade fosfolipásica de diferentes enzimas, além de inibir a atividade miotóxica e citotóxica de diferentes PLA2 Lys49. A expressão heteróloga de rBaltMIP possibilitará a obtenção desse inibidor em grande escala, e consequentemente, a realização de trabalhos mais aprofundados no que diz respeito à possível elucidação do mecanismo de inibição das PLA2s de serpentes, o qual ainda não foi totalmente esclarecido. Além disso, novas informações em relação ao mecanismo de ação desses inibidores poderão ser conhecidas, na tentativa de melhor entender a aplicação destes, como novo modelo terapêutico com ação antiofídica na neutralização de diferentes tipos de PLA2s, na suplementação da soroterapia convencional e também na interação molecular com PLA2s. / Myonecrosis is an important medical complication resulting from snakebites and, in severe cases, local myonecrosis can lead to drastic consequences such as permanent tissue loss, disability or limb amputation. Venomous and non-venomous snakes possess proteins that inhibit phospholipases A2 (PLA2s) in their bloodstream, called PLIs. One hypothesis that could explain the presence of these PLIs in the serum of venomous snakes would be the self-protection against their own venom enzymes, which could eventually reach the circulatory system. In the present work, an inhibitory protein (called ?BaltMIP) that neutralizes the enzymatic and toxic activities of several bothropic PLA2s was isolated from Bothrops alternatus plasma by affinity chromatography using the myotoxin BthTX-I immobilized on a CNBr-activated Sepharose resin. This protein showed relative molecular mass of 24,000 under reducing conditions on SDS-PAGE and greater specificity of inhibition of the cytotoxic and myotoxic activities of Lys49 PLA2-like enzymes compared to the anticoagulant and phospholipase activities of Asp49 PLA2s. In addition, molecular modeling was performed by in silico analysis of both tertiary and quaternary structures of ?BaltMIP. Furthermore, a model of interaction between alpha inhibitors of myotoxins and these toxins was proposed, bringing a new approach to the study of these enzymes. Cloning and expression of the inhibitor (called rBaltMIP in its recombinant form) were also achieved successfully, followed by its partial biochemical characterization. Nterminal sequencing and reverse phase HPLC showed that rBaltMIP was purified in a high purity degree, with 100% sequence identity with the native inhibitor. The inhibitory properties of rBaltMIP were tested against PLA2s and PLA2-like enzymes. rBaltMIP was able to partially inhibit the phospholipase activity of different enzymes, also inhibiting the cytotoxic and myotoxic activity of different Lys49 PLA2-like enzymes. Heterologous expression of rBaltMIP should help obtaining such inhibitor in large-scale, and consequently, the performance of further studies on the mechanism of inhibition of PLA2s, which has not yet been fully clarified. In addition, new information regarding the mechanism of action of these inhibitors may be known, in an attempt to better understand the application of these proteins as new therapeutic models with antiophidian action in neutralizing different types of PLA2s, the supplementation of conventional serum therapy and also in the molecular interaction with PLA2s.

Fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas abundantes em peçonhas de serpentes do gênero Bothrops, possuindo uma grande variedade de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos, como miotóxico, causador de necrose muscular. Em busca de novos fármacos de interesse médico e científico, os inibidores de fosfolipases A2 (PLIs) tornaram-se importantes alvos de pesquisa nos últimos anos. Tendo isto em vista, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de fosfolipase A2 miotóxica do tipo alfa (?BaltMIP) de B. alternatus em sua forma recombinante. Para os estudos de neutralização funcional foram utilizadas as toxinas da peçonha de Bothrops jararacussu: Lys49 PLA2-símile BthTX-I e a Asp49 PLA2 BthTX-II. O processo de purificação das toxinas de B. jararacussu consistiu em dois passos cromatográficos: exclusão molecular seguida de troca iônica, sendo o grau de pureza avaliado por HPLC. A expressão heteróloga do inibidor recombinante ?-BaltMIP foi induzida em leveduras Pichia pastoris. O inibidor purificado, denominado rBaltMIP, apresentou-se como uma proteína pura com pI de 5,8, massa molecular de ~21 kDa por SDS-PAGE e 19,5 kDa por MALDI/TOF MS e com conteúdo de carboidratos de 10%. Após o sequenciamento dos peptídeos trípticos obtidos, os resultados foram comparados com outros ?PLIs depositados em bancos de dados, observando-se 100% de identidade entre o rBaltMIP e o seu inibidor nativo ?BaltMIP, e de 92 a 96% com os demais inibidores analisados. Para as toxinas BthTX-I e BthTX-II, as concentrações efetivas (CE50) para as atividades miotóxicas medidas através dos níveis plasmáticos de CK foram de 0,1256 ?g/?L e de 0,6183 ?g/?L, respectivamente, e quando incubadas com o rBaltMIP houve neutralização de até 65% da miotoxicidade induzida por estas enzimas. Já nos ensaios de formação de edema de pata, foram obtidas as CE50 de 0,02581 ?g/?L e 0,02810 ?g/?L, respectivamente, com neutralização do edema pelo rBaltMIP de até 40%, mostrando-se um inibidor viável para complementar a soroterapia antiofídica sem, no entanto, ser imunogênico. Reforçando esta hipótese, experimentos de neutralização da miotoxicidade feitos com a miotoxina BthTX-I mostraram que o rBaltMIP foi mais eficiente em inibir os danos musculares que o próprio soro antiofídico quando usado isoladamente. Assim, devido a gravidade dos envenenamentos e a baixa neutralização de seus efeitos locais, como a miotoxicidade, pelo soro antiofídico usado atualmente, o estudo do rBaltMIP como inibidor de PLA2s do grupo II de serpentes torna-se promissor devido às suas possíveis aplicações clínicas, podendo neutralizar com maior rapidez, eficiência e especificidade as ações tóxicas de peçonhas ofídicas. / Phospholipases A2 are abundant enzymes present in Bothrops venoms which have a wide variety of pharmacological and/or toxic effects, such as myotoxicity, related to muscle necrosis. In search for new drugs of medical and scientific interest, the phospholipase A2 inhibitors (PLls) have become important targets in recent years. Considering this, the present study aimed at the biochemical and functional characterization of an alpha type phospholipase A2 inhibitor (?-BaltMIP) from B. alternatus in its recombinant form. For the functional neutralization studies, toxins from Bothrops jararacussu venom were used: Lys49 PLA2-like BthTX-I and Asp49 PLA2 BthTX-II. The process of purification of B. jararacussu toxins consisted of two chromatographic steps: molecular exclusion followed by ion exchange, evaluating their purity by HPLC. The heterologous expression of the recombinant ?BaltMIP inhibitor was induced in Pichia pastoris yeast. The purified inhibitor, called rBaltMIP, presented itself as a pure protein with pI of 5.8, molecular mass of ~21 kDa by SDS-PAGE and 19.5 kDa by MALDI/TOF MS, with 10% carbohydrate content. After tryptic peptides sequencing, the results were compared with other ?PLIs deposited in databases, observing a 100% identity between rBaltMIP and its native inhibitor ?BaltMIP, and from 92 to 96% identity with the other analyzed inhibitors. Toxins BthTX-I and BthTX-II showed effective concentrations (EC50) for myotoxic activities measured via plasma CK levels of 0.1256 ?g/?L and 0.6183 ?g/?L, respectively, and incubation with rBaltMIP indicated neutralization of up to 65% of myotoxicity. In paw edema formation assays, EC50 of 0.02581 ?g/?L and 0.02810 ?g/?L, respectively, were observed, with edema neutralizations of up to 40% by rBaltMIP, showing viability to complement antivenoms without, however, being immunogenic. Reinforcing this hypothesis, myotoxicity neutralization experiments performed with the myotoxin BthTX-I showed that rBaltMIP was more effective in inhibiting muscle damage than the actual antivenom by itself. Thus, considering the severity of envenomations and the low neutralization of their local effects, such as myotoxicity, by the antivenoms currently used, the study of rBaltMIP as a PLA2 inhibitor becomes promising due to its possible clinical applications, neutralizing quickly and with more efficiency and specificity the toxic actions of venoms

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008- Saulo Andrade Caldas.pdf: 2660226 bytes, checksum: 9633b16ad905372a6086d20f9fab7136 (MD5) Previous issue date: 2008-02-20 / Funda??o Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / The aim of this study was to determine the clinical-pathological alterations and laboratory findings in bovines inoculated with Bothrops alternatus venom, with the intention of providing information for the establishment of diagnosis and differential diagnosis procedures, as well as to elucidate some obscurities observed in the pertinent literature. The lyophilized venom was diluted in 1 ml of physiologic solution. It was administered to 5 bovines by the subcutaneous route at doses of 0.0625, 0.125 and 0.25 mg/kg body weight, and to 2 other bovines by the intramuscular route at doses of 0.25 e 0.45 mg/kg. Six bovines died and the only animal that survived, who had subcutaneously received the venom at a dose of 0.0625 mg/kg, recovered. The first clinical signs were observed from 25 minutes to 5 hours and 30 minutes after the inoculation. The clinical evolution time varied from 7 hours and 18 minutes to 92 hours. Regardless of the dose, the clinical picture was characterized by swelling (hemorrhage/hematoma) at the site of inoculation, increase in bleeding time and capillary refill time, paleness of mucous membranes and apathy. The laboratory exams revealed progressive normocytic normochromic anemia, thrombocytopenia, reduction in fibrinogen and total plasma proteins, decreased hematocrit and hemoglobin, and slight increase in creatine kinase and lactate dehydrogenase. When subjected to necropsy, the animals that received the venom through the subcutaneous route showed large hematomas and hemorrhagic areas in the subcutaneous tissue, extending from the site of inoculation. The animals in which inoculation was performed intramuscularly exhibited, in addition, intramuscular hemorrhage. The left endocardium showed extensive hemorrhagic lesions, and petechiae were found on the serosae of rumen, omasum, abomasum and gall bladder. The colon, rectum and perirenal areas were surrounded by clotted blood in three animals. Besides hemorrhage, the histological examination revealed hemorrhage and coagulative muscle necrosis in the vicinities of the inoculation site in the animals that received the venom by the intramuscular route. These lesions were mild in the muscles close to the site of inoculation in the animals inoculated by the subcutaneous route. The swelling on the site of inoculation and its surroundings was a consequence of blood accumulation and not merely edema. Myoglobinuria and gross or microscopic lesions were not observed in the kidneys. This study indicates that B. alternatus can lead adult bovines to death if they release all their venom during a bite. Conversely, since venomous ophidians can control the amount of poison they inoculate and they probably do not identify bovines as potential preys, it is likely that the number of accidents involving this species is small, which is in agreement with the findings of the majority of the centers for anatomical-pathological diagnosis in the country. / Esse estudo teve como objetivo determinar as altera??es cl?nico-patol?gicas e os achados laboratoriais em bovinos inoculados com a pe?onha de Bothrops alternatus, no intuito de fornecer subs?dios para o estabelecimento do diagn?stico e do diagn?stico diferencial, bem como esclarecer pontos obscuros da literatura pertinente. O veneno liofilizado foi dilu?do em 1 ml de solu??o fisiol?gica e administrado a cinco bovinos, por via subcut?nea, nas doses de 0,0625, 0,125 e 0,25 mg/kg e a dois outros, por via intramuscular, nas doses de 0,25 e 0,45 mg/kg. Seis bovinos foram a ?bito e um que recebeu a dose de 0,0625 mg/kg, por via subcut?nea, recuperou-se. Os sinais cl?nicos tiveram in?cio entre 25 minutos e 5 horas e 30 minutos ap?s a inocula??o. O per?odo de evolu??o variou de 7 horas e 18 minutos a 66 horas e 12 minutos. Um animal recuperou-se ap?s 92 horas. O quadro cl?nico, independentemente das doses, caracterizou-se por aumento de volume (hemorragia/hematoma) no local da inocula??o, tempo de sangramento aumentado, mucosas hipocoradas e apatia. O exame laboratorial revelou progressiva anemia normoc?tica normocr?mica, trombocitopenia, redu??o de fibrinog?nio e prote?nas plasm?ticas totais, hemat?crito e hemoglobina diminu?dos, al?m de leve aumento dos n?veis de creatinaquinase e desidrogenase l?tica. ? necropsia, havia, a partir do local da inocula??o, extensos hematomas e ?reas de hemorragia no tecido celular subcut?neo dos animais que receberam o veneno por via subcut?nea; nos animais inoculados por via intramuscular, adicionalmente, havia hemorragia intramuscular. O endoc?rdio esquerdo apresentava extensas hemorragias e verificaram-se pet?quias na serosa do r?men e do omaso e na mucosa do abomaso e da ves?cula biliar. Em cinco animais, o c?lon, reto e regi?o perirrenal estavam envoltos por co?gulos de sangue. Ao exame histol?gico observouse, al?m do quadro hemorrag?paro, necrose muscular coagulativa, acompanhada de hemorragia, no entorno do local da inocula??o nos animais que receberam o veneno por via intramuscular; essa les?o era discreta nos m?sculos pr?ximos ao local de inocula??o subcut?nea. Nos bovinos deste estudo, o aumento de volume observado no local de inocula??o e adjac?ncias era constitu?do por sangue e n?o edema. N?o foram observadas mioglobin?ria, nem les?es macro ou microsc?picas significativas nos rins. Este estudo indica que exemplares de B. alternatus, caso inoculem todo seu veneno, poderiam levar bovinos adultos ? morte. Por outro lado, pelo fato de of?dios serem capazes de regular a quantidade de veneno inoculada e, possivelmente, n?o considerarem bovinos como presa potencial, ? prov?vel que o n?mero de acidentes nessa esp?cie seja pequeno, o que est? de acordo com o observado na maioria dos centros diagn?stico an?tomo-patol?gico no pa?s.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3800.pdf: 3103184 bytes, checksum: b20924abb8bacc68de4e6fa59d95ebdd (MD5) Previous issue date: 2011-06-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / This work presents the study of the effects of an RGD disintegrin from Rhinocerophis alternatus (ancient Bothrops alternatus) in key steps of the metastatic cascade. Disintegrins are cysteine-rich peptides, which have several biological activities related to cell-cell interaction and cell adhesion. The correct pairing of disulfide bonds exposes the adhesive motif which confers binding specificity of disintegrins. These molecules selectively blocks the adhesive function of integrins, which directly participate in various physiological and pathological processes. In the first part of this work, we use the DisBa-01, a disintegrin from B.alternatus in fusion with 6 histidines in pET28a expression vector. The DisBa-01 in the flow system inhibited adhesion of B16F10 melanoma cells and platelets to type I collagen and activated the adhesion of B16F10 melanoma cells to type III collagen. In transmigration and adhesion of breast cancer cells MDA-MB-231, the DisBa-01 had the tendency to reduce these stages of metastatic cascade. The disintegrins have been instrumental in the development of molecules with potential therapeutic application and the effects produced by DisBa-01 in this work as well as others from our laboratory, led us in the second part of this work, the production of the disintegrin B.alternatus without the fusion peptide (called ATN) which conferred increased solubility of the disintegrin. ATN was isolated by two molecular exclusions chromatography and ion exchange chromatography and biological characterization was directed to the anti-metastatic effect of this molecule. In this sense, the ATN was unable to promote the adhesion of human erythroleukemia K562 cells, but inhibited the adhesion of tumor cells K562, B16F10 and MDA-MB-231 to fibronectin had no effect in fibroblasts. ATN is not able to detach the fibroblasts adhered to fibronectin but promotes the detachment of K562 and B16F10 cells previously adhered to fibronectin. However, it does not induce fragmentation of cellular DNA, showing no pro-apoptotic effect. In cell proliferation, the ATN has negative effect with 48 hours of incubation with B16F10 tumor cells, but fibroblasts and MDA-MB-231 this effect was not observed. By flow cytometry we observed the interaction of ATN with αvβ3 integrin. The MDA-MB-231 Tx migration was inhibited by ATN and changed the actin cytoskeleton of these cells. However, an increased activity of MMP-9 was observed in MDA-MB-231 treated with ATN and the invasion of MDA-MB-231 was induced by the RGD disintegrin. These results encourage further studies with this disintegrin in seeking the best concentração of the disintegrin, the identification of cytotoxic activity as well as the best method of distribution of this molecule in vivo. / Este trabalho apresenta o estudo dos efeitos de uma desintegrina RGD de Rhinocerophis alternatus (antiga Bothrops alternatus) nas principais etapas da cascata metastática. Desintegrinas são peptídeos ricos em cisteína, os quais apresentam diversas atividades biológicas relacionadas à interação célula-célula e adesão celular. O pareamento correto das pontes de dissulfeto expõe o motivo adesivo, o qual confere a especificidade de ligação das desintegrinas. Estas moléculas seletivamente bloqueiam a função adesiva das integrinas, as quais participam diretamente de diversos processos fisiológicos e patológicos. Na primeira parte deste trabalho utilizamos a DisBa-01, uma desintegrina de B.alternatus fusionada com 6 histidinas em sequência referente ao peptídeo de fusão presente no vetor pET28a. A DisBa-01 em sistema de adesão sob fluxo inibiu a adesão de células de melanoma B16F10 e de plaquetas ao colágeno tipo I e ativou a adesão das células de melanoma B16F10 ao colágeno tipo III. Na transmigração e na adesão das células de câncer de mama MDA-MB-231 pelas células endoteliais, a DisBa-01 apresentou a tendência à redução destas etapas da cascata metastática. As desintegrinas têm sido instrumentos no desenvolvimento de moléculas com potencial aplicação terapêutica e juntamente com esses efeitos apresentados pela DisBa-01 neste trabalho assim como em outros de nosso laboratório, nos conduziu para a segunda parte deste trabalho, a produção da desintegrina de B.alternatus sem o peptídeo de fusão (ATN) que conferiu aumento de solubilidade da desintegrina. A ATN foi isolada através de duas cromatografias de exclusão molecular e uma cromatografia de troca de iônica e a caracterização biológica foi direcionada ao papel anti-metastático desta molécula. Neste sentido, a ATN não foi capaz de promover a adesão das células de eritroleucemia humana (K562), mas inibiu a adesão das células tumorais K562, B16F10 e MDA-MB-231 à fibronectina, mas não apresentou efeito sobre os fibroblastos. A ATN não desadere os fibroblastos aderidos à fibronectina mas, promove o descolamento das células K562 e B16F10 previamente aderidas à fibronectina. No entanto, não induz fragmentação do DNA celular, não apresentando efeito pró-apoptótico. Na proliferação celular, a ATN apresenta efeito com 48 horas de incubação com células tumorais B16F10 mas, em fibroblasto e células MDA-MB-231 esse efeito não foi observado. Por citometria de fluxo verificamos a interação da ATN com a integrina αvβ3. A migração das células MDA-MB-231 Texas foi inibida pela ATN assim como alterou o citoesqueleto de actina destas células. No entanto, um aumento da atividade da MMP-9 foi observado nas células MDA-MB-231 tratadas com ATN assim como a invasão das células MDA-MB-231 foi induzida por esta desintegrina-RGD. Estes resultados incentivam a continuação dos estudos com esse peptídeo no sentido de buscar a melhor concentração desta desintegrina, a identificação de atividade citotóxica assim como melhor método de distribuição desta molécula in vivo.