Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2017-05-19T23:38:44Z No. of bitstreams: 1 LIVIA BACELAR DE JESUS - DISSERTAÇÃO.pdf: 712515 bytes, checksum: eef4f358971620ad62099770c3580a9f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T23:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LIVIA BACELAR DE JESUS - DISSERTAÇÃO.pdf: 712515 bytes, checksum: eef4f358971620ad62099770c3580a9f (MD5) / Os glioblastomas são tumores cerebrais com alto potencial de crescimento, sendo responsáveis por um prognóstico de sobrevida de 9 a 11 meses. De forma geral, o crescimento tumoral encontra-se relacionado à degradação de componentes da matriz extracelular (MEC). Especificamente para os gliomas, o potencial invasivo tem sido relacionado ao aumento da expressão da metaloprotease do tipo 9 (MMP-9). Recentemente, tem sido mostrado que a proteólise de componentes da matriz extracelular promove a liberação de fragmentos protéicos com atividade biológica distinta da apresentada pela molécula intacta. Existem poucas informações sobre o efeito da proteólise de laminina-111 (LMN-111), proteína de matriz extracelular, no contexto do sistema nervoso central. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo investigar se o meio condicionado por células de gliomas C6 (MCC6) apresenta atividade proteolítica sobre polímeros de LMN-l11. Utilizando zimografia acoplada à eletroforese, detectamos a presença de uma gelatinase de 110 kDa em MCC6. A atividade proteolítica do MCC6 sobre polímeros de LMN foi observada através de imunomarcação para LMN-111 e de análise por eletroforese. A incubação dos polímeros de LMN-111 com MCC6 resultou em três fragmentos de 70, 45 e 30 kDa. Dessa forma, os resultados mostram a presença de fragmentos proteolíticos de LMN-111, gerados pelo tratamento dos polímeros com MCC6 e sugerem a necessidade de estudos posteriores para a caracterização da atividade biológica associada aos mesmos.

Peçonhas de serpentes são ricas em proteínas, peptídeos, compostos inorgânicos, lipídeos e carboidratos. Entre os principais constituintes protéicos podemos destacar as metaloproteases (SVMPs), responsáveis pelos processos hemorrágicos e inflamatórios, induzindo a formação de edema e infiltração de leucócitos. Da peçonha de Bothrops atrox, foi isolada uma metaloprotease denominada Batroxase. Esta SVMP foi isolada a partir de três passos cromatográficos, sendo duas exclusões moleculares, uma clássica e outra em FPLC, e uma troca aniônica utilizando CLAE. As SVMPs podem ser classificadas de acordo com os domínios existentes em sua estrutura. Entre as diversas classes, existem as SVMPs da classe PI, que possuem fraca atividade hemorrágica e baixo peso molecular. A Batroxase apresentou massa molecular de 27 kDa (dados não mostrados) e DHM de 10µg, podendo ser classificada como uma metaloprotease de classe PI. A atividade proteolítica da Batroxase foi avaliada sobre diferentes substratos presentes na matriz extracelular e em algumas proteínas presentes no plasma, responsáveis pela ativação da coagulação. Dos constituintes da matriz extracelular (MEC) avaliadas, a Batroxase apresentou atividade sobre o colágeno tipo IV e sobre a fibronectina, esta atividade facilita o processo hemorrágico, desde que estes substratos são encontrados na MEC de tecidos epiteliais e vasos sanguíneos. A atividade sobre proteínas presentes no plasma foi avaliada, evidenciando a capacidade de degradar o fibrinogênio e a fibrina, principalmente a cadeia . Esta atividade pode ser inibida na presença de inibidores de metaloproteases EDTA e EGTA, e na presença do redutor de proteínas -mercaptoetanol. A atividade sobre a fibrina e sobre o fibrinogênio interfere no processo de coagulação, dificultando a interrupção de processos hemorrágicos. Após a formação de um coágulo, a Batroxase foi capaz de dissolvê-lo completamente, capacidade esta, relacionada à sua atividade fibrinolítica. As plaquetas quando na presença da Batroxase não foram induzidas a se agregarem, e quando, na adição de ADP, não foi capaz de inibir a agregação. A atividade inflamatória foi elucidada, evidenciando a participação na formação de edema e hiperalgesia, bem como infiltração de leucócitos. Na avaliação farmacológica foi observada a participação de mediadores pró-inflamatórios como a histamina via receptores H1, a serotonina via receptores 5-HT1, e a formação de leucotrienos no edema e a histamina via receptores H1 e formação de leucotrienos na hiperalgesia. A infiltração de leucócitos observada foi mediada principalmente por neutrófilos nas primeiras horas, seguida do aumento de células mononucleares. A Batroxase possui citotoxicidade ausente ou baixa sobre as linhagens tumorais testadas, com análise significativa apenas para JURKAT, B16-F10, SK-BR3 em altas concentrações. Em células como EL-4 e PBMC sugerem que a Batroxase apresenta atividade imunorregulatória, induzindo proliferação celular em baixas concentrações e inibindo este crescimento em concentrações mais altas como observado em células JURKAT, A-20 e PBMC. É capaz de estimular a produção de citocinas próinflamatórias e antiinflamatórias de maneira distinta induzindo preferencialmente a produção de citocinas do padrão Th1 como IFN-, que, após adição de estímulo policlonal anti-CD3, apresentou atividade supressora na capacidade proliferativa de células T, inibindo a produção de citocinas do padrão Th1 como a IL-2 e IFN-, citocinas do padrão Th2 como a IL-4 e citocinas do padrão Th17 como a IL-17A. / Snake venoms are rich in components like proteins, peptides, lipids, carbohydrates and inorganic compounds. Among their main proteins components, the metalloproteinases (SVMPs) are responsible for hemorrhagic and inflammatory effects, edema formation and leucocytes recruitment. Batroxase, a new metalloproteinase isolated from Bothrops atrox snake venom, was purified using three chromatographic steps, namely: two molecular exclusion steps, one as classic chromatography and another as FPLC, and an anionic exchange in HPLC. SVMPs can be classified by specific domains in their structure. Among the various classes, there are SVMP PI, which has weak hemorrhagic activity and low molecular weight. Batroxase showed a molecular mass of 27 kDa (data not shown) and DHM of 10 µg. The proteolytic activity was evaluated on different substrates in the extracellular matrix and some plasma proteins, responsible for activation of coagulation. Batroxase was able to degrade extracellular matrix (ECM) components like, type IV collagen and fibronectin, inducing bleeding process, since these components are found in the ECM of epithelial tissues and blood vessels. The activity of proteins present in plasma was evaluated, demonstrating the ability to degrade fibrinogen and fibrin, especially the chain, which can be inhibited in the presence of metalloproteinase inhibitors as EDTA and EGTA, as well as with a reducing protein agent -mercaptoethanol. Activity on fibrin and fibrinogen interfere with the clotting process, making difficult to interrupt processes like bleeding. After clot formation, Batroxase was able to dissolve it completely, which is related to their fibrinolytic activity. The platelets in the presence of Batroxase were not induced to aggregate, and when, in addition to ADP, was not able to inhibit aggregation. Inflammatory activity has been elucidated, suggesting the participation in edema and hyperalgesia, as well as infiltration of leukocytes. Pharmacological evaluation was observed with participation of pro-inflammatory mediators such as histamine via H1 receptors, serotonin 5-HT1 receptor via, and the synthesis of leukotrienes and histamine on edema via H1 receptors and synthesis of leukotrienes in hyperalgesia. Infiltration of leukocytes was observed mainly mediated by neutrophils in the early hours, followed by the increase of mononuclear cells. Batroxase have absent or very low cytotoxicity on tumor cell lines tested, with significant only for Jurkat analysis, B16-F10, SK-BR3 in high concentrations. In EL-4 cells and PBMC, inducing cell proliferation at low concentrations and inhibiting this growth in higher concentrations as observed in Jurkat cells, A-20 and PBMC. It can stimulate production of proinflammatory and antiinflammatory cytokines, preferentially induces the production of Th1 cytokines such as IFN-, which, after addition of polyclonal anti-CD3 stimulation showed activity in suppressing proliferative capacity of T cells, inhibiting the production of Th1 cytokines such as IL-2 and IFN-, Th2 cytokines such as IL-4 and Th17 cytokine pattern as IL-17A.

Peçonhas de serpentes são ricas em proteínas, peptídeos, compostos inorgânicos, lipídeos e carboidratos. Entre os principais constituintes protéicos podemos destacar as metaloproteases (SVMPs), responsáveis pelos processos hemorrágicos e inflamatórios, induzindo a formação de edema e infiltração de leucócitos. Da peçonha de Bothrops atrox, foi isolada uma metaloprotease denominada Batroxase. Esta SVMP foi isolada a partir de três passos cromatográficos, sendo duas exclusões moleculares, uma clássica e outra em FPLC, e uma troca aniônica utilizando CLAE. As SVMPs podem ser classificadas de acordo com os domínios existentes em sua estrutura. Entre as diversas classes, existem as SVMPs da classe PI, que possuem fraca atividade hemorrágica e baixo peso molecular. A Batroxase apresentou massa molecular de 27 kDa (dados não mostrados) e DHM de 10µg, podendo ser classificada como uma metaloprotease de classe PI. A atividade proteolítica da Batroxase foi avaliada sobre diferentes substratos presentes na matriz extracelular e em algumas proteínas presentes no plasma, responsáveis pela ativação da coagulação. Dos constituintes da matriz extracelular (MEC) avaliadas, a Batroxase apresentou atividade sobre o colágeno tipo IV e sobre a fibronectina, esta atividade facilita o processo hemorrágico, desde que estes substratos são encontrados na MEC de tecidos epiteliais e vasos sanguíneos. A atividade sobre proteínas presentes no plasma foi avaliada, evidenciando a capacidade de degradar o fibrinogênio e a fibrina, principalmente a cadeia . Esta atividade pode ser inibida na presença de inibidores de metaloproteases EDTA e EGTA, e na presença do redutor de proteínas -mercaptoetanol. A atividade sobre a fibrina e sobre o fibrinogênio interfere no processo de coagulação, dificultando a interrupção de processos hemorrágicos. Após a formação de um coágulo, a Batroxase foi capaz de dissolvê-lo completamente, capacidade esta, relacionada à sua atividade fibrinolítica. As plaquetas quando na presença da Batroxase não foram induzidas a se agregarem, e quando, na adição de ADP, não foi capaz de inibir a agregação. A atividade inflamatória foi elucidada, evidenciando a participação na formação de edema e hiperalgesia, bem como infiltração de leucócitos. Na avaliação farmacológica foi observada a participação de mediadores pró-inflamatórios como a histamina via receptores H1, a serotonina via receptores 5-HT1, e a formação de leucotrienos no edema e a histamina via receptores H1 e formação de leucotrienos na hiperalgesia. A infiltração de leucócitos observada foi mediada principalmente por neutrófilos nas primeiras horas, seguida do aumento de células mononucleares. A Batroxase possui citotoxicidade ausente ou baixa sobre as linhagens tumorais testadas, com análise significativa apenas para JURKAT, B16-F10, SK-BR3 em altas concentrações. Em células como EL-4 e PBMC sugerem que a Batroxase apresenta atividade imunorregulatória, induzindo proliferação celular em baixas concentrações e inibindo este crescimento em concentrações mais altas como observado em células JURKAT, A-20 e PBMC. É capaz de estimular a produção de citocinas próinflamatórias e antiinflamatórias de maneira distinta induzindo preferencialmente a produção de citocinas do padrão Th1 como IFN-, que, após adição de estímulo policlonal anti-CD3, apresentou atividade supressora na capacidade proliferativa de células T, inibindo a produção de citocinas do padrão Th1 como a IL-2 e IFN-, citocinas do padrão Th2 como a IL-4 e citocinas do padrão Th17 como a IL-17A. / Snake venoms are rich in components like proteins, peptides, lipids, carbohydrates and inorganic compounds. Among their main proteins components, the metalloproteinases (SVMPs) are responsible for hemorrhagic and inflammatory effects, edema formation and leucocytes recruitment. Batroxase, a new metalloproteinase isolated from Bothrops atrox snake venom, was purified using three chromatographic steps, namely: two molecular exclusion steps, one as classic chromatography and another as FPLC, and an anionic exchange in HPLC. SVMPs can be classified by specific domains in their structure. Among the various classes, there are SVMP PI, which has weak hemorrhagic activity and low molecular weight. Batroxase showed a molecular mass of 27 kDa (data not shown) and DHM of 10 µg. The proteolytic activity was evaluated on different substrates in the extracellular matrix and some plasma proteins, responsible for activation of coagulation. Batroxase was able to degrade extracellular matrix (ECM) components like, type IV collagen and fibronectin, inducing bleeding process, since these components are found in the ECM of epithelial tissues and blood vessels. The activity of proteins present in plasma was evaluated, demonstrating the ability to degrade fibrinogen and fibrin, especially the chain, which can be inhibited in the presence of metalloproteinase inhibitors as EDTA and EGTA, as well as with a reducing protein agent -mercaptoethanol. Activity on fibrin and fibrinogen interfere with the clotting process, making difficult to interrupt processes like bleeding. After clot formation, Batroxase was able to dissolve it completely, which is related to their fibrinolytic activity. The platelets in the presence of Batroxase were not induced to aggregate, and when, in addition to ADP, was not able to inhibit aggregation. Inflammatory activity has been elucidated, suggesting the participation in edema and hyperalgesia, as well as infiltration of leukocytes. Pharmacological evaluation was observed with participation of pro-inflammatory mediators such as histamine via H1 receptors, serotonin 5-HT1 receptor via, and the synthesis of leukotrienes and histamine on edema via H1 receptors and synthesis of leukotrienes in hyperalgesia. Infiltration of leukocytes was observed mainly mediated by neutrophils in the early hours, followed by the increase of mononuclear cells. Batroxase have absent or very low cytotoxicity on tumor cell lines tested, with significant only for Jurkat analysis, B16-F10, SK-BR3 in high concentrations. In EL-4 cells and PBMC, inducing cell proliferation at low concentrations and inhibiting this growth in higher concentrations as observed in Jurkat cells, A-20 and PBMC. It can stimulate production of proinflammatory and antiinflammatory cytokines, preferentially induces the production of Th1 cytokines such as IFN-, which, after addition of polyclonal anti-CD3 stimulation showed activity in suppressing proliferative capacity of T cells, inhibiting the production of Th1 cytokines such as IL-2 and IFN-, Th2 cytokines such as IL-4 and Th17 cytokine pattern as IL-17A.

Estudamos indução da atividade de MMP pelo peptídeo da laminina a1 AG73 em linhagem celular (CAC2) de carcinoma adenóide cístico. CAC2 cultivadas em laminina-111 com AG73 geraram espaços pseudocísticos. Inibidor de MMP diminuiu tais espaços, sugerindo ação de MMPs. CAC2 crescidas sobre AG73 mostraram aumento dose-dependente de MMP9. RNAi para MMP9 diminuiu remodelação em cultura 3D. Buscamos receptores de AG73 ligados à atividade de MMP9. CAC2 crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecan-1 e integrina b1. RNAi para sindecan-1 ou para integrina b1 geraram, isolados, redução na adesão a AG73 e nas atividades de remodelação e de protease. Duplo RNAi estudou a cooperação entre os receptores e promoveu diminuição na adesão a AG73 e na atividade de MMP. Distinção de receptores foi feita por cromatografia de afinidade e espectrometria de massa, através de colunas de afinidade com AG73 acoplado, que resultou em possíveis receptores, como integrinas b1 e aV. Sugerimos que AG73 regula adesão e secreção de MMP em células CAC2 através de sindecan-1 e integrina b1. / We studied induction of MMP activity by b1-laminin peptide AG73 in adenoid cystic carcinoma cell line (CAC2). Cells grown inside AG73-enriched laminin-111 exhibited pseudocystics spaces. MMP inhibitor decreased those spaces, suggesting MMPs action. Cells grown on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion. MMP9 siRNAi decreased remodeling in 3D culture. We searched for AG73 receptors regulating MMP9 activity. CAC2 grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin. Syndecan-1 siRNA or siRNA b1 integrin showed reduction in adhesion to AG73 and in remodeling and protease activities. Double-knockdown explored syndecan-1 and 1 integrin cooperation and showed decrease in adhesion to AG73 and in MMP activity. Receptors characterization was made by affinity chromatography followed by mass spectrometry through AG73-affinity columns and showed putative receptors, like b1 and aV integrins. We suggest that AG73 peptide regulates adhesion and MMP secretion in CAC2 cells through syndecan-1 and b1 integrin.

Estudamos indução da atividade de MMP pelo peptídeo da laminina a1 AG73 em linhagem celular (CAC2) de carcinoma adenóide cístico. CAC2 cultivadas em laminina-111 com AG73 geraram espaços pseudocísticos. Inibidor de MMP diminuiu tais espaços, sugerindo ação de MMPs. CAC2 crescidas sobre AG73 mostraram aumento dose-dependente de MMP9. RNAi para MMP9 diminuiu remodelação em cultura 3D. Buscamos receptores de AG73 ligados à atividade de MMP9. CAC2 crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecan-1 e integrina b1. RNAi para sindecan-1 ou para integrina b1 geraram, isolados, redução na adesão a AG73 e nas atividades de remodelação e de protease. Duplo RNAi estudou a cooperação entre os receptores e promoveu diminuição na adesão a AG73 e na atividade de MMP. Distinção de receptores foi feita por cromatografia de afinidade e espectrometria de massa, através de colunas de afinidade com AG73 acoplado, que resultou em possíveis receptores, como integrinas b1 e aV. Sugerimos que AG73 regula adesão e secreção de MMP em células CAC2 através de sindecan-1 e integrina b1. / We studied induction of MMP activity by b1-laminin peptide AG73 in adenoid cystic carcinoma cell line (CAC2). Cells grown inside AG73-enriched laminin-111 exhibited pseudocystics spaces. MMP inhibitor decreased those spaces, suggesting MMPs action. Cells grown on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion. MMP9 siRNAi decreased remodeling in 3D culture. We searched for AG73 receptors regulating MMP9 activity. CAC2 grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin. Syndecan-1 siRNA or siRNA b1 integrin showed reduction in adhesion to AG73 and in remodeling and protease activities. Double-knockdown explored syndecan-1 and 1 integrin cooperation and showed decrease in adhesion to AG73 and in MMP activity. Receptors characterization was made by affinity chromatography followed by mass spectrometry through AG73-affinity columns and showed putative receptors, like b1 and aV integrins. We suggest that AG73 peptide regulates adhesion and MMP secretion in CAC2 cells through syndecan-1 and b1 integrin.

Metaloproteases/desintegrinas (MD) isoladas de venenos de serpentes são potentes inibidores de agregação plaquetária e de adesão celular, processos envolvidos em doenças como trombose e câncer. As MD pertencem a classe PIII das SVMPs (´snake venom metalloproteinases´) que são constituídas por três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) e rico em cisteína (C). A função dos três domínios nas atividades das moléculas ainda não é totalmente conhecida, e estudos com o objetivo de esclarecer suas funções são importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Algumas proteínas da classe PIII apresentam elevada atividade auto-proteolítica (liberando peptídeo constituído dos domínios D e C) enquanto que em outras PIII esta atividade não é menos evidente. Neste trabalho nós estudamos MD isoladas de veneno de Bothrops jararaca (bothropasina) e Bothrops alternatus (alternagina) em relação aos seus processos de autólise. Alternagina e bothropasina apresentaram diferentes comportamentos em relação à auto-proteólise, apesar do elevado grau de identidade entre as duas moléculas. Nesse trabalho, caracterizamos a estabilidade química e o comportamento de desenovelamento da proteína alternagina nativa pela guanídina HCl usando emissão de fluorescência intrínseca em combinação com espectroscopia de dicroísmo circular ´far´-UV. As amostras de alternagina, purificadas do veneno liofilizado, foram monitoradas por dicroísmo em comprimento de onda de 220nm e os resultados mostraram estruturas intermediárias no processo de desnaturação da proteína. Estudos semelhantes foram feitos com a bothropasina, com o objetivo de relacionar seus diferentes comportamentos auto-proteolíticos com os processos de desnaturação. Nas duas proteínas ocorreu uma alta correlação entre os estudos de auto-proteolise e de desnaturação. As MD isoladas de B. jararaca, jararagina e bothropasina, são isoformas descritas na literatura como isoláveis através de diferentes cromatografias. Neste trabalho, utilizamos os diferentes protocolos descritos para verificar a porção da isoforma majoritária no veneno. As amostras de proteína serão analisadas por espectrometria de massas, uma vez que a região N-terminal das proteínas está bloqueada. / Metalloproteinases/disintegrin (MD) isolated from snake venom are potent inhibitors of platelet aggregation and cell adhesion, processes involved in illnesses as cancer and thrombosis. MD belong to the PIII class of the metalloproteinase/disintegrin gene family and they are constituted by three domains: the catalytic domain, metalloprotease; disintegrin-like (D) and cysteine-rich (R). Some MD proteins are rapidly processed (producing the disintegrin-like/ cysteine-rich domains), while others MD are processed slowly. In this work, we studied the autolysis process of the MD isolated from the venom of Bothrops jararaca (bothropasin) and Bothrops alternatus (alternagin). Despite high sequence identity, alternagin and bothropasin showed different autolysis processes. The processing of the alternagin produces an intermediate with molecular mass of 43kDa whereas in the processing of the bothropasin this intermediate is almost not observable. In this work we studied alternagin and bothropasin under the viewpoint of chemical stability and the unfolding process to guanidine hydrochloride (Gnd-HCl) using dichroism circular and fluorescence spectrometry. The CD spectra (220nm) of the alternagin purified from the lyophilized venom showed an intermediate structure in the unfolding process. These studies were performed on bothropasin with the goal to relate the autolysis and unfolding process. These studies revealed a high correlation between both proteins . The MD isolated from B. jararaca, jararagin and bothropasin, are isophorms purified from different chromatograph processes reported in the literature. In this work, different purification processes were used to check the major isophorm. Due to the blocked N-terminal region, these proteins will be assessed by mass spectrometry.

A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer. / DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.

A resistência natural do gambá Didelphis marsupialis ao veneno de serpentes se deve a fatores antibiotrópicos presentes em seu soro, do qual DM43 é um dos responsáveis pela inibição da atividade hemorrágica. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação desta proteína contra a metaloprotease contida no veneno pretendeu-se, neste trabalho, otimizar as condições de cristalização de DM43, na tentativa de determinar sua estrutura por difração de raios-X. Ensaios de cristalização revelaram que o sulfato de amônio é o precipitante mais eficiente na produção de cristais de DM43. A visualização e indexação dos padrões de difração destes cristais permitiram apenas a determinação dos parâmetros de sua cela unitária, devido a baixa qualidade dos mesmos. Deste modo, os seguintes parâmetros de cela unitária foram encontrados: a = b = 117.34 (0.03) Å, c = 193.39 (0.02)Å, ?=?=90° e ? = 120°, correspondentes ao sistema cristalino trigonal ou hexagonal. A recente determinação da sequência de aminoácidos de DM43, possibilitou modelar sua estrutura tridimensional por homologia utilizando o método de satisfação das restrições espaciais. Os três domínios tipo imunoglobulina de DM43 foram modelados em duas partes a partir da estrutura de referência KIR2DL1(1nkr) homóloga a dois domínios C-terminais de DM43, com apenas 27.72% de identidade. O domínio N-terminal denominado D0, foi modelado separadamente contra o domínio C-terminal de KIR2DL1 com um grau de identidade igual a 28.89%. A partir do programa GRASP e PATCHES, foram detectadas as prováveis regiões de ligação entre as duas partes da molécula e uma possível região responsável pela dimerização no domínio D2 de DM43. Interessantemente, resíduos polares em KIR2DLs que foram substituídos por hidrofóbicos em DM43, concentrando-se em uma face do domínio D2 ausente de sítios de glicosilação, o que coincide com as observações de dimerização do receptor do hormônio de crescimento. Um motivo estrutural característico de receptores hematopoiéticos identificados como WSXWS box, foi encontrado em todos os domínios de DM43, especialmente no domínio D2. Supõe-se que a sua existência esteja relacionada com a orientação relativa dos domínios por manter o primeiro triptofano do motivo posicionado exatamente na interface entre os domínios. Surge ainda uma fita extra (F´), no domínio D2, não pertencente ao enovelamento imunoglobulina devido a presença da Pro273, muito bem conservada, a três resíduos do motivo WSXWS. Esta fita parece desempenhar um papel importante na orientação do motivo pois além de formar ligações de hidrogênio com a fita G do domínio anterior, posiciona corretamente o primeiro triptofano do motivo na interface. Somando-se a isto, a presença de resíduos hidrofóbicos na interface dos domínios D1 e D2pode estar contribuindo para a orientação angular relativa menor que 90° entre os dois domínios. Uma interpretação análoga a de hormônios de crescimento sugere que, os loops entre as fitas AB, CC´ e EF do domínio 1, BC e FG do domínio 2 e o linker entre estes dois domínios, estejam envolvidos na interação da metaloprotease com DM43. / The natural resistance of the opossum, Didelphis marsupialis, towards snake venom is due to antibothropic factors present in the blood serum, of which DM43 is one. It is responsible for the inhibition of the hemorrhagic activity of the venom. With a view to better understanding the mechanism of action of this protein against venom metalloproteases, one of the aims of the present work was to optimize the crystallization conditions of DM43 in order to determine its three-dimensional structure by X-ray diffraction. Crystallization trials revealed that ammonium sulphate was the best precipitant. Visualization and indexing of the diffraction patterns from such crystals only allowed for the determination of the unit cell parameters due to their inherently low quality. The values obtained were a = b = 117.34 (0.03) \'ANGSTRON\', c = 193.39 (0.02) Å, ?=?= 90° e ? = 120°, corresponding to the trigonal or hexagonal crystal systems. The recent determination of the amino acid sequence of DM43 permitted the homology modelling of its three-dimensional structure by satisfaction of spatial restraints. The three immunoglobulin-like domains of DM43 were modelled in two separate parts from the reference structure KIR2DL1 (1nkr), homologous to the two C-terminal domains of DM43, with which its shares 27.72% sequence identity. The N-terminal domain, denominated D0, was separately modelled based on the C-terminal domain of KIR2DL1, with which it shares 28.89% identity. The programs PATCHES and GRASP were used to detect the probable interface region between the two separate parts of the molecule as well as a region probably responsible for dimerisation. Polar residues in KIR2DL1 which had been substituted by hydrophobic residues in DM43 are observed concentrated on one face of the molecule devoid of glycosilation sites (D2) coinciding with the dimerisation interface observed in the growth hormone receptor. A structural motif characteristic of the haematopoetic receptor family, identified as the WSXWS box, was observed to some extent in all three domains of DM43 and most evident in domain D2. It is speculated that the existence of this motif is related to the relative orientation of the domains, by maintaining the first tryptophan of the motif positioned at the domain interface. An additional ?-strand (F) in D2, which is not characteristic of the immunoglobulin fold, is observed due to the presence of the conserved Pro273, three-residues prior to the WSXWS box. This strand appears to play an important role in correctly positioning the motif as it forms hydrogen bonds with strand G of the previous domain thus orientating the first tryptophan of the motif at the interface. The presence of hydrophobic residues at the interdomain interface, may also contribute to stabilizing the acute angular relationship between D1 and D2. An analogous interpretation to that given for the growth hormone receptor, suggests that the loops between ?-strands AB, CC\' and EF of domain D1 and between strands BC and FG do domain D2 plus the linker region, are involved in the binding of metalloproteinase by DM43.

Este trabalho investiga a influência de polimorfismos na região promotora do gene das metaloproteases 1, 3 e 8 na fisiopatogenia da insuficiência primária do tendão tibial posterior. A amostra de 150 pacientes selecionados é dividida em grupo-teste: 50 pacientes com diagnóstico clínico e anatomopatológico de tendinopatia do tendão tibial posterior e grupo-controle: 100 pacientes com tendão tibial posterior íntegro. O DNA dos voluntários é obtido a partir de células epiteliais da mucosa bucal mediante a extração com acetato de amônia. As técnicas de PCR e RFLP são utilizadas para análise dos genótipos. A análise estatística dos resultados é realizada pelo teste do qui-quadrado com nível de significância de 5%. Os resultados mostram que os polimorfismos -1607 da MMP-1 e -799 da MMP-8 estão relacionados com risco maior para tendinopatia primária do tendão tibial posterior, enquanto o polimorfismo -1612 da MMP-3 parece não influenciar essa tendinopatia / The aim of this study was to investigate the influence of polymorphisms in the promoter region of the gene of metalloproteinases 1, 3 and 8 in physiopatology of primary posterior tibial tendon insufficiency. The sample of 150 selected patients was divided into test group: 50 patients undergoing surgical procedures and pathological diagnosis of degenerative lesions of the posterior tibial tendon, and control group: 100 patients with posterior tibial tendon intact and no signs of degeneration. The DNA of the volunteers was obtained from oral mucosa epithelial cells, by extraction with ammonium acetate. PCR and RFLP were used for analysis of genotypes. Statistical analysis of results was performed by Chi-squared test with significance level of 5%. The results show that polymorphisms -1607 of MMP-1 and -799 of the MMP-8 are associated with increased risk for primary tendinopathy of the posterior tibial tendon, while the -1612 polymorphism of MMP-3 does not influence this tendinopathy

Neste trabalho descrevemos o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease hemorrágica, denominada BjussuMP-I. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu por combinação de dois passos cromatográficos, utilizando filtração molecular em Sephacryl S-200, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,0) seguida de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL-4B, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,6 mais NaCl 4 M) e eluída com gradiente de NaCl (4-0 M) a 25°C no mesmo tampão. BjussuMP-I é uma proteína com massa molecular de 60 kDa e pI 5,6, a qual induziu hemorragia após injeção intradérmica em camundongos, com uma dose hemorrágica mínima (DHM) de 4,5 g. A atividade hemorrágica da BjussuMP-I foi totalmente inibida após incubação com um agente quelante (EDTA), confirmando a dependência de metal da enzima para esse efeito. BjussuMP-I possui atividade proteolítica sobre a caseína e fibrinogênio e nenhum efeito sobre a gelatina. Por outro lado, demonstrou alta especificidade pela cadeia do fibrinogênio enquanto que a cadeia somente foi hidrolisada na presença de altas concentrações da metaloprotease. A protease foi ativa sobre o fibrinogênio em pH neutro e alcalino e inativada a 75 °C. A dependência de metal da enzima foi demonstrada pela inibição exercida por EDTA, EGTA e 1,10 fenantrolina. Verificou-se uma inibição parcial pelo ?-mercaptoetanol e PMSF, enquanto que leupeptina e aprotinina não afetaram a atividade fibrinogenolítica. A enzima foi ativada na presença de íons Ca++ e Mg++, sendo inibida por Mn++, Fe++, Zn++, Co++ e Ni++. Além disso, baixas concentrações da enzima produziram lise no coágulo de fibrina. BjussuMP-I também demonstrou inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP e atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Verificou-se que as atividades hemorrágica e proteolítica da BjussuMP-I foram neutralizadas pelo diterpenóide clerodane (Bt-CD) de Bacharis trimera. Também se observou uma inibição total do efeito hemorrágico, utilizando o extrato aquoso de Pentaclethra macroloba (EPema). A enzima foi reconhecida por anticorpos antineuwiedase, com uma reação de identidade imunológica parcial. A seqüência completa do cDNA da BjussuMP-I com 1540 pb codificou para uma proteína de 547 resíduos de aminoácidos, que conservou os domínios comuns a metaloproteases hemorrágicas de alto peso molecular da classe PIII: (i) pré-pró-peptideo, (ii) metaloprotease, (iii) disintegrina-símile e (iv) domínio rico em cisteína. / In this study the isolation, functional and structural characterization of a hemorrhagic metalloprotease, named BjussuMP-I is reported. The protein was isolated from Bothrops jararacussu snake venom by a combination of two chromatographic steps, using gel filtration on Sephacryl S-200 (0.01 M Tris-HCl, pH7.6 buffer) and Phenyl-Sepharose CL-4B chromatography (0.01 M Tris-HCl plus 4 M NaCl, pH7.6 buffer) followed by a concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. BjussuMP-I is a 60 kDa protein with a pI 5.6, which induced hemorrhage after intradermal injection in mice with a minimum hemorrhagic dose (MHD) of 4.5 g. The hemorrhagic activity of BjussuMP-I was totally abolished after incubation with a chelating agent (EDTA), corroborating the metal-dependence of this effect. BjussuMP-I shows proteolytic activity on casein, collagen and fibrinogen, although no effect on gelatin was observed. In addition, it presented a high specificity toward the -chain of fibrinogen, while the -chain was only hydrolyzed at high concentrations of the metalloprotease. The protease was active against fibrinogen in neutral and alkaline pH and was inactivated at 75°C. The metal dependence of the enzyme was confirmed through inhibition by EDTA, EGTA and 1,10 phenantroline. A partial inhibition was observed with -mercaptoetanol and PMSF, while leupeptin and aprotinin did not inhibit the fibrinogenolytic activity. The enzyme was active in the presence of Ca++ and Mg++ and it was inhibited by Mn++, Fe++, Zn++, Co++ and Ni++. In addition, low concentrations of the enzyme presented lyses in fibrin plate after 12 h of incubation. BjussuMP-I also displayed inhibitory effect on collagen- and ADP-stimulated platelet aggregation, as well as bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. It was reported that both hemorrhagic and proteolytic activities of BjussuMP-I were neutralized by the clerodane diterpenoide (Bt-CD) from Bacharis trimera. Full inhibition of hemorrhage was also observed by using aqueous extract from Pentaclethra macroloba (EPema). The enzyme was recognized by anti-neuwiedase antibodies in a reaction of partial immunologic identity. The complete cDNA sequence of BjussuMP-I with 1540 pb encoded open reading frames of 547 amino acid residues which conserved the common domains of P-III high molecular weight hemorrhagic metalloproteases: (i) pre-pro-peptide, (ii) metalloprotease, (iii) disintegrin-like and (iv) rich cysteine domain.