Carcinona epidermóide é um prevalente tumor de cabeça e pescoço relacionado a altas taxas de mortalidade. Neste trabalho, verificamos se AG73 (RKRLQVQLSIRT, cadeia a1), peptídeo derivado da laminina-111, regula migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma epidermóide oral (OSCC). Cadeia a1 da laminina e MMP9 estão expressas neste tumor in vivo e in vitro. AG73 induziu aumento da taxa migratória de células OSCC em ensaios de ferida e migração, e também estimulou invasão em ensaio em câmaras bipartites com Matrigel. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram aumento dose-dependente de MMP9, detectado por zimografia. Buscamos receptores de AG73 que regulariam atividade nesta linhagem. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecana-1 e integrina b1, e silenciamento desses receptores com RNA de interferência promoveu diminuição de migração e invasão dependente de AG73 nestas células. Esses resultados sugerem que sindecana-1 e integrina b1, ativados por AG73, podem regular migração, invasão e secreção de MMPs em células OSCC. / Oral squamous cell carcinoma is a prevalent head and neck tumor, related to high mortality rates. Here we studied the role played by AG73 (RKRLQVQLSIRT, a1 chain) on migration, invasion and protease secretion of a cell line (OSCC) from human oral squamous cell carcinoma. Laminin a1 chain and MMP9 are expressed in oral squamous cell carcinoma cells in vivo and in vitro. AG73 increased migratory activity of OSCC cells, as shown by monolayer wound assays and migration assays. This peptide also stimulated cell invasion in chemotaxis chambers coated with Matrigel. OSCC cells cultured on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion, detected by zymography. We searched for AG73 receptors regulating activities in this cell line. OSCC cells grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin, and siRNA knockdown of these receptors decreased AG73-dependent migration and invasion of OSCC cells. Our results suggest that syndecan-1 and b1 integrin signaling downstream of AG73 regulate migration, invasion and MMP secretion by OSCC cells

Estudamos indução da atividade de MMP pelo peptídeo da laminina a1 AG73 em linhagem celular (CAC2) de carcinoma adenóide cístico. CAC2 cultivadas em laminina-111 com AG73 geraram espaços pseudocísticos. Inibidor de MMP diminuiu tais espaços, sugerindo ação de MMPs. CAC2 crescidas sobre AG73 mostraram aumento dose-dependente de MMP9. RNAi para MMP9 diminuiu remodelação em cultura 3D. Buscamos receptores de AG73 ligados à atividade de MMP9. CAC2 crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecan-1 e integrina b1. RNAi para sindecan-1 ou para integrina b1 geraram, isolados, redução na adesão a AG73 e nas atividades de remodelação e de protease. Duplo RNAi estudou a cooperação entre os receptores e promoveu diminuição na adesão a AG73 e na atividade de MMP. Distinção de receptores foi feita por cromatografia de afinidade e espectrometria de massa, através de colunas de afinidade com AG73 acoplado, que resultou em possíveis receptores, como integrinas b1 e aV. Sugerimos que AG73 regula adesão e secreção de MMP em células CAC2 através de sindecan-1 e integrina b1. / We studied induction of MMP activity by b1-laminin peptide AG73 in adenoid cystic carcinoma cell line (CAC2). Cells grown inside AG73-enriched laminin-111 exhibited pseudocystics spaces. MMP inhibitor decreased those spaces, suggesting MMPs action. Cells grown on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion. MMP9 siRNAi decreased remodeling in 3D culture. We searched for AG73 receptors regulating MMP9 activity. CAC2 grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin. Syndecan-1 siRNA or siRNA b1 integrin showed reduction in adhesion to AG73 and in remodeling and protease activities. Double-knockdown explored syndecan-1 and 1 integrin cooperation and showed decrease in adhesion to AG73 and in MMP activity. Receptors characterization was made by affinity chromatography followed by mass spectrometry through AG73-affinity columns and showed putative receptors, like b1 and aV integrins. We suggest that AG73 peptide regulates adhesion and MMP secretion in CAC2 cells through syndecan-1 and b1 integrin.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-05T12:51:09Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1137139 bytes, checksum: e12ef38589083b7a6e2b1cbb011a5ed4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-05T12:51:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1137139 bytes, checksum: e12ef38589083b7a6e2b1cbb011a5ed4 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / DNA methylation is a key process for the regulation of gene expression by reversible inactivation of genes. Environmental factors such as solar radiation, can alter the DNA methylation profile. MMP-9 protein is part of a collagenases family whose function is to remodel the extracellular matrix, which presents itself very active in the early stages of cancer and photoaging. MicroRNAs are non-coding RNA molecules that act as post-transcriptional regulators of gene expression by degrading or repressing the target messenger RNA. It is estimated that about 10% of microRNA expression is controlled via DNA methylation. The microRNA-137 has tumor suppressor function in various types of cancer, including squamous cell carcinoma and melanoma. The aim of our study was to analyze the influence of sun exposure on the DNA methylation profile of matrix metalloprotease-9 (MMP9) and microRNA-137 (MIR137) genes of skin cells. To this purpose, skin samples were analyzed, which were obtained from sun-exposed and sun-protected areas from 28 corpses of both sexes, aged 30-89 years with no history of skin diseases obtained from the Brazilian Service of Death Investigation. Genomic DNA was extracted using Trizol and with the aid of a tissue homogenizer. The DNA methylation analysis was performed using Methylation Specific PCR (MSP) by previous modification of the DNA with sodium bisulfite. The amplified samples were subjected to electrophoresis on polyacrylamide gel followed by staining with silver nitrate. Statistical analysis was performed using the McNemar paired test at a significance level of 5%. No differences were found among the areas (p>0.05), with the partially methylated condition found to be a common event in skin for both MMP9 (96.4% of samples) and MIR137 (60.4% of samples). We conclude that sun exposure does not induce changes in DNA methylation status in the studied CpG sites. / A metilação do DNA constitui um dos principais processos para a regulação da expressão gênica através da inativação reversível dos genes. Fatores ambientais tais como a radiação solar, podem alterar o perfil de metilação de DNA. A proteína MMP-9 faz parte de uma família de colagenases cuja função é a remodelação da matriz extracelular, apresentando-se muito ativa em fases iniciais do câncer e do fotoenvelhecimento. Os microRNAs são moléculas de RNA não codificantes que agem como reguladores pós-transcricionais da expressão gênica através da degradação ou repressão do RNA mensageiro alvo. Estima-se que cerca de 10% da expressão de microRNAs é controlada via metilação de DNA. O microRNA-137 possui função de supressor tumoral em vários tipos de câncer, incluindo o carcinoma espinocelular e melanoma. O objetivo do trabalho foi analisar a influência da exposição solar sobre o perfil de metilação de DNA dos genes da metaloprotease de matriz-9 (MMP9) e microRNA-137 (MIR137) em células da pele. Para isso, foram analisadas amostras de pele obtidas de uma área exposta e não exposta ao sol de 28 cadáveres de ambos os sexos, com idade entre 30-89 anos sem histórico de doenças de pele obtidas no Serviço de Verificação de Óbitos da Paraíba (SVO). O DNA genômico foi extraído dos tecidos utilizando-se Trizol e após homogeneização com auxílio de um homogeneizador de tecidos. A análise de metilação de DNA foi realizada pela técnica de PCR Específica para Metilação (MSP), através da prévia modificação do DNA com bissulfito de sódio. As amostras amplificadas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida seguidas de coloração por nitrato de prata. A análise estatística foi realizada pelo teste pareado McNemar ao nível de significância de 5%. A análise revelou que não há diferença significativa entre as regiões exposta e não exposta ao sol, sendo a condição parcialmente metilada a mais frequente para ambos os genes MMP9 (96,4% das amostras) e MIR137 (60,4% das amostras) (p>0,05). Deste modo, concluímos que não há influência da exposição solar no perfil de metilação de DNA nos sítios CpG estudados.

Carcinona epidermóide é um prevalente tumor de cabeça e pescoço relacionado a altas taxas de mortalidade. Neste trabalho, verificamos se AG73 (RKRLQVQLSIRT, cadeia a1), peptídeo derivado da laminina-111, regula migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma epidermóide oral (OSCC). Cadeia a1 da laminina e MMP9 estão expressas neste tumor in vivo e in vitro. AG73 induziu aumento da taxa migratória de células OSCC em ensaios de ferida e migração, e também estimulou invasão em ensaio em câmaras bipartites com Matrigel. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram aumento dose-dependente de MMP9, detectado por zimografia. Buscamos receptores de AG73 que regulariam atividade nesta linhagem. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecana-1 e integrina b1, e silenciamento desses receptores com RNA de interferência promoveu diminuição de migração e invasão dependente de AG73 nestas células. Esses resultados sugerem que sindecana-1 e integrina b1, ativados por AG73, podem regular migração, invasão e secreção de MMPs em células OSCC. / Oral squamous cell carcinoma is a prevalent head and neck tumor, related to high mortality rates. Here we studied the role played by AG73 (RKRLQVQLSIRT, a1 chain) on migration, invasion and protease secretion of a cell line (OSCC) from human oral squamous cell carcinoma. Laminin a1 chain and MMP9 are expressed in oral squamous cell carcinoma cells in vivo and in vitro. AG73 increased migratory activity of OSCC cells, as shown by monolayer wound assays and migration assays. This peptide also stimulated cell invasion in chemotaxis chambers coated with Matrigel. OSCC cells cultured on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion, detected by zymography. We searched for AG73 receptors regulating activities in this cell line. OSCC cells grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin, and siRNA knockdown of these receptors decreased AG73-dependent migration and invasion of OSCC cells. Our results suggest that syndecan-1 and b1 integrin signaling downstream of AG73 regulate migration, invasion and MMP secretion by OSCC cells

Estudamos indução da atividade de MMP pelo peptídeo da laminina a1 AG73 em linhagem celular (CAC2) de carcinoma adenóide cístico. CAC2 cultivadas em laminina-111 com AG73 geraram espaços pseudocísticos. Inibidor de MMP diminuiu tais espaços, sugerindo ação de MMPs. CAC2 crescidas sobre AG73 mostraram aumento dose-dependente de MMP9. RNAi para MMP9 diminuiu remodelação em cultura 3D. Buscamos receptores de AG73 ligados à atividade de MMP9. CAC2 crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecan-1 e integrina b1. RNAi para sindecan-1 ou para integrina b1 geraram, isolados, redução na adesão a AG73 e nas atividades de remodelação e de protease. Duplo RNAi estudou a cooperação entre os receptores e promoveu diminuição na adesão a AG73 e na atividade de MMP. Distinção de receptores foi feita por cromatografia de afinidade e espectrometria de massa, através de colunas de afinidade com AG73 acoplado, que resultou em possíveis receptores, como integrinas b1 e aV. Sugerimos que AG73 regula adesão e secreção de MMP em células CAC2 através de sindecan-1 e integrina b1. / We studied induction of MMP activity by b1-laminin peptide AG73 in adenoid cystic carcinoma cell line (CAC2). Cells grown inside AG73-enriched laminin-111 exhibited pseudocystics spaces. MMP inhibitor decreased those spaces, suggesting MMPs action. Cells grown on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion. MMP9 siRNAi decreased remodeling in 3D culture. We searched for AG73 receptors regulating MMP9 activity. CAC2 grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin. Syndecan-1 siRNA or siRNA b1 integrin showed reduction in adhesion to AG73 and in remodeling and protease activities. Double-knockdown explored syndecan-1 and 1 integrin cooperation and showed decrease in adhesion to AG73 and in MMP activity. Receptors characterization was made by affinity chromatography followed by mass spectrometry through AG73-affinity columns and showed putative receptors, like b1 and aV integrins. We suggest that AG73 peptide regulates adhesion and MMP secretion in CAC2 cells through syndecan-1 and b1 integrin.