Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-10T13:37:23Z No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:41:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / A Lisofosfatidilcolina (LPC) é um lisofosfolipídio que constitui a membrana plasmática e possui um papel importante na sinalização celular, pois está diretamente associada à albumina e a lipopoliproteínas. A LPC tem um amplo espectro de atividades pró-inflamatórias e exerce um papel fundamental durante a aterosclerose, pois ela é o principal componente fosfolipídio de lipoproteínas de baixa densidade oxidada (oxLDL). Ela também é capaz de induzir a formação de células gordurosas, as quais são componentes celulares fundamentais para o estabelecimento da aterosclerose e recrutamento leucocitário para o sítio desta patologia, induzindo a progressão da doença. No entanto, o papel de LPC na ativação do inflamassoma e na modulação da biogênese de corpúsculos lipídicos (CLs) neste processo ainda é mal compreendido. Este estudo tem por objetivo investigar se LPC é capaz de ativar o inflamassoma NLRP3 e induzir a secreção de IL-1β relacionando com os mecanismos de formação de células gordurosas por meio da análise da biogênese de CLs. Nossos resultados mostraram que a LPC induz um efeito citotóxico em altas concentrações em monócitos e células endoteliais, além de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a ativação de caspase-1. A LPC induz a ativação do inflamassoma NLRP3 através da indução da secreção de IL-1β dependente de efluxo de potássio, dano lisossomal, reconhecimento via TLR-2, ativação de PPAR e estabilização das jangadas lipídicas em monócitos humanos e dependentes das caspases-1/11 e do inflamassoma NLRP3 em macrófagos peritoneais de camundongos. Além disso, a LPC induz a translocação do HMGB-1 do núcleo para o citoplasma tanto em células endoteliais quanto em monócitos. Outro resultado importante foi à indução da formação de células gordurosas, via LPC, em monócitos e células endoteliais in vitro, através do aumento da biogênese de CLs de maneira independente do inflamassoma NLRP3 e das caspases-1/11 in vivo. Além disso, as células endoteliais estimuladas com LPC ativam monócitos a se transformarem em células gordurosas, através da indução da biogênese de CL, por mecanismo ainda desconhecido. Portanto, o presente trabalho caracterizou diferentes mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação de células gordurosas, correlacionando-os com as vias de ativação dos inflamassomas e do metabolismo lipídico celular, e que corroboraram para a criação de um microambiente propício ao estabelecimento e manutenção da formação de placas ateroscleróticas. ______________________________________________________________________ ABSTRACT / Lysophosphatidylcholine (LPC) is a major lipid component of plasmatic membrane and has an important role in cell signaling because it is directly associated with albumin and lipoproteins. The LPC has a broad spectrum of pro-inflammatory activity and plays a key role in atherosclerosis, since it is a major phospholipid component of oxidized low density lipoprotein (oxLDL). Furthermore, LPC is also able to induce the formation of foam macrophages, which are the key cell component for the establishment of atherosclerosis and leukocyte recruitment on the site of the pathology. However, the role of LPC in modulating inflammasome activation and lipid droplet biogenesis in this process is poorly understood. This study is aimed to investigate if LPC is capable of inducing inflammasome activation and IL-1β secretion, verify the foam cell formation by analyzing lipid droplet biogenesis and characterize the signaling pathway involved in this process. Our results showed that LPC induces a cytotoxic effect in high concentrations in monocytes and endothelial cells, generation of reactive oxygen species (ROS) and activation of caspase-1. LPC induces activation of the inflammasome NLRP3 by induction of IL-1β secretion dependent of potassium efflux, and lysosomal damage via TLR-2 recognition, PPAR gamma activation and stabilization of lipid rafts in vitro, and caspase-1/11 and NLRP3 inflammasome in vivo assays. Furthermore, LPC induced translocation of HMGB1 from the nucleus towards the cytoplasm in endothelial cells and monocytes. Another important result was the induction of the formation of foam cells by LPC both in monocytes and endothelial cell in vitro assays, by increasing the biogenesis of lipid droplets in a manner independent of the NLRP3 inflammasome and caspase-1/11 in vivo. Additionally, endothelial cells stimulated with LPC activated monocytes to transform into foam cells through induction of lipid droplets biogenesis by unknown mechanism. Therefore, the present study characterized different cellular and molecular mechanisms involved in the formation of foam cells, correlating them with the activation pathways of inflammasomes and cellular lipid metabolism, and corroborated to create a favorable microenvironment for the establishment and maintenance of formation atherosclerotic plaques.

A obesidade está associada a um processo inflamatório crônico de baixa intensidade e representa um dos fatores de risco para o desenvolvimento de uma série de comorbidades. A proteína TSPO está envolvida em inúmeras funções celulares, incluindo biossíntese e transporte de esteróides, transporte de porfirinas, apoptose, biossíntese do heme, processos oxidativos e imunomodulação. Ademais, a presença e a função da proteína TSPO no tecido adiposo e na inflamação ainda não estão bem estabelecidas. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi validar a expressão e função do TSPO durante a diferenciação de células 3T3-L1, e investigar se o tratamento de adipócitos 3T3-L1 com diazepam, um benzodiazepínico de ação central (GABAA) e periférica (TSPO), é capaz de modular os efeitos inflamatórios induzidos pela incubação das células 3T3-L1 com TNF-α. Nossos resultados evidenciaram que, em nosso estudo, o tratamento de pré-adipócitos com diazepam não modulou a adipogênese. Entretanto, apesar de o diazepam per se não modular o acúmulo de triacilglicerol e a expressão gênica e protéica de PPAR-γ; em células estimuladas pelo TNF-α, o tratamento com diazepam foi capaz de reverter a diminuição da expressão gênica e protéica de PPAR-γ induzida pelo TNF-α. Ademais, o tratamento dos adipócitos com diazepam foi capaz de modular positivamente a expressão protéica de TSPO, efeito este que não observamos em células tratadas pelo clonazepam, um benzodiazepínico de ação exclusivamente central. Em resumo, os dados obtidos neste estudo, pela primeira vez, demonstram a possível relação entre as vias que controlam a sinalização de TSPO, TNF-α e PPAR-γ. Assim, nos é possível inferir que a ativação de TSPO pelo seu ligante diazepam foi capaz de modular a ativação de NF-kB induzida pelo TNF-α, promovendo, com a diminuição da lipólise e aumento da expressão gênica de TSPO e gênica e protéica de PPAR-γ, o reestabelecimento da homeostase celular, o que aumentaria a sobrevida das células, a atividade mitocondrial, e a atividade adipogênica dos adipócitos. / Obesity is associated with a chronic low-grade inflammation and these represents one of the risk factors to development of other non-communicable diseases. TSPO 18 kDa is involved in several cellular functions, including biosynthesis and steroids transport, porphyrin transport, apoptosis, heme biosynthesis, oxidative metabolism and immunomodulation. Furthermore, the TSPO expression and function on adipose tissue and in the chronic low-grade inflammation have not been established. Thus, the aim of present study was to validate the TSPO expression and function on the 3T3-L1 differentiation process and to investigate whether diazepam treatment is able to modulate the TNF-α induced inflammatory effects on 3T3-L1 cells. Our results showed that diazepam treatment of preadipocytes was not able to modulate the adipogenesis. However, although diazepam treatment per se does not modulate the triacylglycerol accumulation and gene and protein expression of PPAR-γ; in TNF-α stimulated adipocytes, the treatment with diazepam was able to modulate the decreased of PPAR-γ gene and protein expression induced by TNF-α. In addition, the diazepam treatment of adipocytes was able to positively modulate the TSPO protein expression, an effect that we did not observe in cells treated with clonazepam, a central benzodiazepine ligand. In summary, the data obtained in this study, for the first time, demonstrate the possible relationship between the pathways that control the TSPO, TNF-α and PPAR-γ signaling. Thus, it is possible that the activation of TSPO by diazepam was able to modulate TNF-α-induced activation of NF-kB, promoting the reduction of lipolysis and increased of TSPO gene expression and PPAR-γ gene and protein expression, reestablishment of cellular homeostasis, which would increase cell survival, mitochondrial activity, and adipogenic activity of adipocytes.

A obesidade está associada a um processo inflamatório crônico de baixa intensidade e representa um dos fatores de risco para o desenvolvimento de uma série de comorbidades. A proteína TSPO está envolvida em inúmeras funções celulares, incluindo biossíntese e transporte de esteróides, transporte de porfirinas, apoptose, biossíntese do heme, processos oxidativos e imunomodulação. Ademais, a presença e a função da proteína TSPO no tecido adiposo e na inflamação ainda não estão bem estabelecidas. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi validar a expressão e função do TSPO durante a diferenciação de células 3T3-L1, e investigar se o tratamento de adipócitos 3T3-L1 com diazepam, um benzodiazepínico de ação central (GABAA) e periférica (TSPO), é capaz de modular os efeitos inflamatórios induzidos pela incubação das células 3T3-L1 com TNF-α. Nossos resultados evidenciaram que, em nosso estudo, o tratamento de pré-adipócitos com diazepam não modulou a adipogênese. Entretanto, apesar de o diazepam per se não modular o acúmulo de triacilglicerol e a expressão gênica e protéica de PPAR-γ; em células estimuladas pelo TNF-α, o tratamento com diazepam foi capaz de reverter a diminuição da expressão gênica e protéica de PPAR-γ induzida pelo TNF-α. Ademais, o tratamento dos adipócitos com diazepam foi capaz de modular positivamente a expressão protéica de TSPO, efeito este que não observamos em células tratadas pelo clonazepam, um benzodiazepínico de ação exclusivamente central. Em resumo, os dados obtidos neste estudo, pela primeira vez, demonstram a possível relação entre as vias que controlam a sinalização de TSPO, TNF-α e PPAR-γ. Assim, nos é possível inferir que a ativação de TSPO pelo seu ligante diazepam foi capaz de modular a ativação de NF-kB induzida pelo TNF-α, promovendo, com a diminuição da lipólise e aumento da expressão gênica de TSPO e gênica e protéica de PPAR-γ, o reestabelecimento da homeostase celular, o que aumentaria a sobrevida das células, a atividade mitocondrial, e a atividade adipogênica dos adipócitos. / Obesity is associated with a chronic low-grade inflammation and these represents one of the risk factors to development of other non-communicable diseases. TSPO 18 kDa is involved in several cellular functions, including biosynthesis and steroids transport, porphyrin transport, apoptosis, heme biosynthesis, oxidative metabolism and immunomodulation. Furthermore, the TSPO expression and function on adipose tissue and in the chronic low-grade inflammation have not been established. Thus, the aim of present study was to validate the TSPO expression and function on the 3T3-L1 differentiation process and to investigate whether diazepam treatment is able to modulate the TNF-α induced inflammatory effects on 3T3-L1 cells. Our results showed that diazepam treatment of preadipocytes was not able to modulate the adipogenesis. However, although diazepam treatment per se does not modulate the triacylglycerol accumulation and gene and protein expression of PPAR-γ; in TNF-α stimulated adipocytes, the treatment with diazepam was able to modulate the decreased of PPAR-γ gene and protein expression induced by TNF-α. In addition, the diazepam treatment of adipocytes was able to positively modulate the TSPO protein expression, an effect that we did not observe in cells treated with clonazepam, a central benzodiazepine ligand. In summary, the data obtained in this study, for the first time, demonstrate the possible relationship between the pathways that control the TSPO, TNF-α and PPAR-γ signaling. Thus, it is possible that the activation of TSPO by diazepam was able to modulate TNF-α-induced activation of NF-kB, promoting the reduction of lipolysis and increased of TSPO gene expression and PPAR-γ gene and protein expression, reestablishment of cellular homeostasis, which would increase cell survival, mitochondrial activity, and adipogenic activity of adipocytes.