Memoria para optar el título de Bioquímico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2015 / La Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC) es una infección aguda del parénquima pulmonar de origen extrahospitalario, causada por virus y bacterias. La gravedad de la NAC sería independiente de la etiología y dependiente de la respuesta inmune del hospedero. Con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune celular en adultos con NAC viral y/o por S.pneumoniae de acuerdo a la gravedad se compararon subpoblaciones de linfocitos y células NK, determinadas por hemograma y citometría de flujo en muestras de sangre periférica de 68 adultos con NAC y de 22 adultos asintomáticos. En 58 pacientes con NAC, se identificó S.pneumoniae mediante detección de antígeno urinario y virus respiratorios por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y por ensayo de inmunofluorescencia. El agente infeccioso con mayor detección fue Rinovirus (35.2%). Se analizaron variables demográficas y clínicas de los pacientes, clasificándose de acuerdo al Índice de Severidad de la Neumonía en casos leves (n=28) y graves (n= 40). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SigmaPlot, con p<0.05 significativo. Los adultos con NAC tuvieron menores porcentajes de monocitos (5.2% versus 8.8%), linfocitos totales (12.2% versus 26.4%), linfocitos T CD3+/CD8+ (2.5% versus 6.3%), linfocitos T CD3+/CD4+ (3.8% versus 8.9%); linfocitos T FoxP3+ (0.1% versus 0.3%), células NK activadas (CD56+/NKG2D+: 1.6% versus 4.1%) e inactivadas (CD94+/NKG2A+: 0.7% versus 2.5; CD56+/CD158b+: 0.7% versus 1.2%; CD56+/CD161+: 1.0% versus 3.5%) y mayores porcentajes de granulocitos (82.4% versus 64.9%) que los adultos asintomáticos. Los adultos con NAC grave tuvieron menores porcentajes de linfocitos y monocitos (10.5% versus 18.2% y 4.3% versus 6.6%, respectivamente), linfocitos T citotóxicos CD3+/CD8+ (2.1% versus 3.8%), linfocitos T ayudadores CD3+/CD4+ (2.6% versus 5.2%), células NK activadas (CD56+/NKG2D+: 1.5% versus 2.3%) y células NK inactivadas (CD94+/NKG2A+: 0.5% versus 1.3%; CD56+/CD158b+: 0.4% versus 0.9%) y mayores porcentajes de granulocitos (85.1% versus 74.7%) que los pacientes con NAC leve. Todos los parámetros inmunológicos fueron similares entre pacientes con NAC y agente infeccioso detectado respecto a los casos sin agente. En conclusión, la respuesta inmune celular, en cuanto a las proporciones de linfocitos y células NK estaría disminuida en los pacientes con NAC independiente de su etiología, en especial en los pacientes con NAC grave / Community-Acquired Pneumonia (CAP) is an acute infection of the lung parenchyma acquired outside the hospital, caused by viruses and bacteria. Severity of CAP would be independent of the etiology and dependent on the host immune response. For characterizing cellular immune response in adults with viral and/or S.pneumoniae CAP according to severity, subpopulations of lymphocytes and NK cells were compared and determined by blood count and flow cytometry in peripheral blood from 68 adults with CAP and 22 asymptomatic adults. In 58 patients with CAP, S.pneumoniae and/or respiratory viruses were detected by detection of urinary antigen, real-time polymerase chain reaction and immunofluorescence assays, respectively. Rhinovirus was the most frequently detected (35.2%). Demographic and clinical characteristics were analyzed, and patients were classified according to the Pneumonia Severity Index in mild (n=28) and severe cases (n=40). Statistical analyses were performed using SigmaPlot software and p<0.05 was considered significant. Adults with CAP had lower percentages of monocytes (5.2% versus 8.8%), total lymphocytes (12.2% versus 26.4%), T cytotoxic lymphocytes CD3+/CD8+ (2.5% versus 6.3%), T helper lymphocytes CD3+/CD4+ (3.8% versus 8.9%); T regulatory lymphocytes FoxP3+ (0.1% versus 0.3%), activated NK cells (CD56+/NKG2D+: 1.6% versus 4.1%) and inactivated NK cells (CD94+/NKG2A+: 0.7% versus 2.5; CD56+/CD158b+: 0.7% versus 1.2%; CD56+/CD161+: 1.0% versus 3.5%) and higher percentages of granulocytes (82.4% versus 64.9%) than asymptomatic adults. Adults with severe CAP had lower percentages of lymphocytes and monocytes (10.5% versus 18.2% and 4.3% versus 6.6%, respectively), T cytotoxic lymphocytes CD3+/CD8+ (2.1% versus 3.8%), T helper lymphocytes CD3+/CD4+ (2.6% versus 5.2%), activated NK cells (CD56+/NKG2D+: 1.5% versus 2.3%) and inactivated NK cells (CD94+/NKG2A+: 0.5% versus 1.3%; CD56+/CD158b+: 0.4% versus 0.9%) and higher percentages of granulocytes (85.1% vs. 74.7%) than patients with mild CAP. All immunological parameters were similar between CAP patients with detected infectious agent and cases with no identified pathogen. In conclusion, the cellular immune response, in terms of the proportions of lymphocytes and cells NK would be decreased in patients with CAP independent of their etiology, especially in patients with severe CAP

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / Los folatos son un grupo de vitaminas hidrosolubles del complejo B (B9) que son esenciales para un correcto funcionamiento de nuestro organismo al estar involucradas en reacciones enzimáticas importantes para la sobrevida y crecimiento celular, participando como coenzima en reacciones de transferencia de 1-carbono, necesarias en la síntesis de ácidos nucleicos y reacciones de metilación en la regulación de la expresión génica. Dado que bajos niveles de folatos producen patologías como defectos en el cierre del tubo neural en recién nacidos y enfermedades cardiovasculares, entre otras; países como Estados Unidos, Canadá y Chile iniciaron programas de fortificación con ácido fólico en alimentos (cereales y harina de trigo), con el objeto de disminuir el riesgo de padecer algunas de las enfermedades anteriormente mencionadas. No obstante, en el momento en que se introdujo este programa de fortificación, gran parte de la población quedó expuesta a un consumo de ácido fólico mayor al requerido por el organismo, ignorando si este exceso de vitamina podría provocar algún efecto adverso en el metabolismo de residuos de un carbono y, por consiguiente, en la salud. Estudios realizados en nuestro país han evidenciado que posterior al inicio del programa de fortificación de harina de trigo con ácido fólico (220 µg/100 g de harina), los niveles séricos de folato total aumentaron significativamente en mujeres en edad fértil y en adultos mayores y que, además, existe una asociación temporal con el aumento en la incidencia de cáncer colorectal. Más aún, en Estados Unidos, se ha encontrado que en mujeres, especialmente mayores de 60 años, la actividad citotóxica de las células NK disminuye a medida que aumenta el ácido fólico no metabolizado independiente de los niveles 5-MTHF y folato total. Este último antecedente es de gran interés, ya que se ha demostrado en humanos que la magnitud de la actividad lítica de las células NK medida en sangre periférica está relacionada con el riesgo de desarrollar un proceso carcinogénico; es decir, que a menor actividad citotóxica de NK, mayor es el riesgo de padecer cáncer. Esto se suma a otro estudio realizado en la población japonesa el cual mostró que un aumento de la actividad de células NK protege de cáncer de colon, ya que mantendría al colon libre de células displásicas. Estos antecedentes nos han llevado a plantear nuestra hipótesis que vincula concentraciones suprafisiológicas de folato sérico con la disminución de la actividad citotóxica NK, cambios a nivel de los receptores de inhibición y activación en células NK humanas y menor secreción de citoquinas solubles intracelulares, lo cual debilitarían esta primera barrera antitumoral, aumentando el riesgo de desarrollar cáncer. En este estudio, se cuantificó la actividad citotóxica tanto de células NK altamente purificadas mediante inmunoseparación negativa como en PBMC obtenidas a partir de sangre de donantes voluntarios. Además, se evaluó la expresión de los receptores de superficie KIR2DL3, KIR2DL4 y NKG2D; y cuantificó la secreción intracelular de las citoquinas solubles TNF-α e IFN-γ mediante citometría de flujo en fracciones enriquecidas de células NK, todo esto en presencia de concentraciones suprafisiológicas de AF y 5-MTHF in vitro. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que concentraciones consideradas fisiológicamente altas (75 y 100 nmol/L), tanto de AF como 5-MTHF no alteran la actividad citotóxica de las células NK in vitro hasta 96 horas de cultivo. La ACNK cuantificada en la fracción PBMC cultivada en presencia de concentraciones suprafisiológicas de AF y 5-MTHF tampoco mostró cambios. Del mismo modo, la incubación de células NK altamente enriquecidas en presencia de AF y 5-MTHF 100 nM no produjo cambios en los niveles de expresión de los receptores de superficie KIR2DL3, KIR2DL4 y NKG2D. Por otro lado, la producción de las citoquinas TNF-α e IFN- no se vio afectada bajo las mismas condiciones de cultivo y tiempos estudiados. Por lo tanto, de acuerdo a lo observado, se puede inferir que la incubación de células NK purificadas con concentraciones suprafisiológicas de folatos no altera su función citotóxica, ni la expresión de los receptores KIR2DL3, KIR2DL4 y NKG2D, como tampoco la producción de las citoquinas TNF-α e IFN-γ. Estos resultados descartarían un posible efecto de los folatos sobre las células NK como posible mecanismo que vincula al ácido fólico con un mayor riesgo de padecer cáncer en la población. Es necesario buscar otras hipótesis para explicar la asociación observada entre ácido fólico y cáncer

NKG2D (Natural Killer Group 2, type D) es un receptor de activación de las células Natural Killer de sangre periférica (NK), uterinas (uNK) y TCD8+ humanos. Son ligandos de NKG2D (NKG2DL), las proteínas relacionadas con la cadena alfa del complejo principal de histocompatibilidad de clase I A y B (MICA y MICB) y las proteínas de unión a UL16 (ULBPs). Se han descrito variados mecanismos relacionados con la evasión tumoral y con la tolerancia fetal que involucran el control de la síntesis de los NKG2DL, los cuales se expresan principalmente en la superficie de células diana en situaciones de estrés, infección intracelular o transformación maligna. Hay antecedentes que indican que la sobreexpresión de moléculas chaperonas puede alterar el nivel de expresión en la superficie celular de proteínas de membrana, como también algunas citoquinas pueden reducir la expresión de los NKG2DL. Se postula que Calreticulina (CRT) se asocia con las moléculas MICA en células de trofoblasto y en melanoma maligno y que la expresión de los ligandos MICA está influenciada por la Interleuquina 10 (IL-10) en melanoma maligno. Mediante análisis histológicos y microscopía confocal se determinó la superposición de MICA y MICB con calreticulina, calnexina y Erp57. Además, se detectó co-inmunoprecipitación de CRT y MICA. Ambos estudios realizados en cultivos celulares de trofoblasto humano de primer trimestre y en líneas de melanoma maligno humano. Sin embargo no se detectó interacción directa entre CRT-MICA recombinantes mediante análisis de afinidad por BIAcore. Se analizó la expresión de NKG2DL y la relevancia funcional en líneas celulares humanas de melanoma en respuesta al estímulo con Interleuquina 10. Se utilizaron líneas de células malignas del melanoma tratadas con IL-10 para analizar MICA/B mediante qRT-PCR y citometría de flujo. Se demostró que IL-10 disminuye la expresión en la superficie de células de melanoma de MICA, pero no MICB. También se indicó que la regulación de MICA se produce a nivel de mRNA, de forma dosis dependiente tanto de citoquina humana recombinante como de la variante viral de la IL-10. Este estudio reveló además que la disminución la MICA por IL-10 conduce a la reducción de la lisis mediada por células citotóxicas in vitro. Esta tesis contribuye al conocimiento de las moléculas responsables del plegamiento y retención intracelular de los NKG2DL, así como al papel de la IL-10 en la expresión de NKG2DL, ambos mecanismos propios de la evasión inmune tumoral y de la tolerancia fetal.