The evolutionary success of higher plants is largely attributed to their tremendous developmental plasticity, which allows them to cope with adverse conditions. However, because these adaptations require investments of resources, they must be tightly regulated to avoid unfavourable trade-offs. Most of the resources required are macronutrients based on carbon and nitrogen. Limitations in the availability of these nutrients have major effects on gene expression, metabolism, and overall plant morphology. These changes are largely mediated by the highly conserved master kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1), which represses growth and induces catabolic processes. Downstream of SnRK1, a hub of heterodimerising group C and S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) transcription factors has been identified. These bZIPs act as regulators of nutrient homeostasis and are highly expressed in strong sink tissues, such as flowers or the meristems that initiate lateral growth of both shoots and roots. However, their potential involvement in controlling developmental responses through their impact on resource allocation and usage has been largely neglected so far. Therefore, the objective of this work was to elucidate the impact of particularly S1 bZIPs on gene expression, metabolism, and plant development. Due to the high homology and suspected partial redundancy of S1 bZIPs, higher order loss-of-function mutants were generated using CRISPR-Cas9. The triple mutant bzip2/11/44 showed a variety of robust morphological changes but maintained an overall growth comparable to wildtype plants. In detail however, seedlings exhibited a strong reduction in primary root length. In addition, floral transition was delayed, and siliques and seeds were smaller, indicating a reduced supply of resources to the shoot and root apices. However, lateral root density and axillary shoot branching were increased, suggesting an increased ratio of lateral to apical growth in the mutant. The full group S1 knockout bzip1/2/11/44/53 showed similar phenotypes, albeit far more pronounced and accompanied by growth retardation. Metabolomic approaches revealed that these architectural changes were accompanied by reduced sugar levels in distal sink tissues such as flowers and roots. Sugar levels were also diminished in leaf apoplasts, indicating that long distance transport of sugars by apoplastic phloem loading was impaired in the mutants. In contrast, an increased sugar supply to the proximal axillary buds and elevated starch levels in the leaves were measured. In addition, free amino acid levels were increased in bzip2/11/44 and bzip1/2/11/44/53, especially for the important transport forms asparagine and glutamine. The increased C and N availability in the proximal tissues could be the cause of the increased axillary branching in the mutants. To identify bZIP target genes that might cause the observed shifts in metabolic status, RNAseq experiments were performed. Strikingly, clade III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) 8 genes were abundant among the differentially expressed genes. As SWEETs are crucial for sugar export to the apoplast and long-distance transport through the phloem, their reduced expression is likely to be the cause of the observed changes in sugar allocation. Similarly, the reduced expression of GLUTAMINE AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), which exhibits glutaminase activity, could be an explanation for the abundance of glutamine in the mutants. Additional experiments (ATAC-seq, DAP� seq, PTA, q-RT-PCR) supported the direct induction of SWEETs and GAT1_2.1 by S1 bZIPs. To confirm the involvement of these target genes in the observed S1 bZIP mutant phenotypes, loss-of-function mutants were obtained, which showed moderately increased axillary branching. At the same time, the induced overexpression of bZIP11 in axillary meristems had the opposite effect. Collectively, a model is proposed for the function of S1 bZIPs in regulating sink tissue development. For efficient long-distance sugar transport, bZIPs may be required to induce the expression of clade III SWEETs. Thus, reduced SWEET expression in the S1 bZIP mutants would lead to a decrease in apoplastic sugar loading and a reduced supply to distal sinks such as shoot or root apices. The reduction in long� distance transport could lead to sugar accumulation in the leaves, which would then increasingly be transported via symplastic routes towards proximal sinks such as axillary branches and lateral roots or sequestered as starch. The reduced GAT1_2.1 levels lead to an abundance of glutamine, a major nitrogen transport form. The combined effect on C and N allocation results in increased nutrient availability in proximal tissues, promoting the formation of lateral plant organs. Alongside emerging evidence highlighting the power of bZIPs to steer nutrient allocation in other species, a novel but evolutionary conserved role for S1 bZIPs as regulators of developmental plasticity is proposed, while the generation of valuable data sets and novel genetic resources will help to gain a deeper understanding of the molecular mechanisms involved / Der evolutionäre Erfolg höherer Pflanzen wird weitgehend auf ihre enorme Entwicklungsplastizität zurückgeführt, die es ihnen ermöglicht, widrigen Bedingungen zu trotzen. Da diese Anpassungen jedoch einen immensen Ressourceneinsatz erfordern, müssen sie streng reguliert werden, um unvorteilhafte Reaktionen zu vermeiden. Den Großteil der benötigten Ressourcen machen Makronährstoffe auf der Basis von Kohlenstoff und Stickstoff aus. Eine eingeschränkte Verfügbarkeit dieser Nährstoffe hat erhebliche Auswirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Morphologie der Pflanzen. Diese Veränderungen werden größtenteils durch die hochkonservierte Kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) vermittelt, die das Wachstum unterdrückt und katabole Prozesse einleitet. Downstream von SnRK1 wurde ein Netzwerk von heterodimerisierenden Transkriptionsfaktoren der Gruppe C und S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) identifiziert. Diese bZIPs wirken als Regulatoren der Nährstoffhomöostase und werden vor allem in starken sink-Geweben wie Blüten oder den Meristemen, die das Seitenwachstum von Sprossen und Wurzeln ermöglichen, exprimiert. Ihre potenzielle Beteiligung an der Steuerung von Entwicklungsreaktionen durch ihren Einfluss auf die Ressourcenzuteilung und -nutzung wurde bisher jedoch weitgehend vernachlässigt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen insbesondere von S1 bZIPs auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Pflanzenentwicklung zu erforschen. Aufgrund der hohen Homologie und der vermuteten teilweisen Redundanz der S1 bZIPs wurden mithilfe von CRISPR-Cas9 loss-of-function Mutanten höherer Ordnung erzeugt. Die Dreifachmutante bzip2/11/44 zeigte eine Vielzahl robuster morphologischer Veränderungen, behielt aber insgesamt ein mit Wildtyp-Pflanzen vergleichbares Wachstum bei. Im Detail jedoch wiesen die Keimlinge eine starke Verringerung der Primärwurzellänge auf. Darüber hinaus verzögerte sich der Blühzeitpunkt, und die Schoten und Samen waren kleiner, was auf eine geringere Versorgung der Spross- und Wurzelspitzen mit Ressourcen hinweist. Die Dichte der Seitenwurzeln und die axilläre Verzweigung des Sprosses waren jedoch erhöht, was auf ein erhöhtes Verhältnis von lateralem zu apikalem Wachstum in der Mutante hindeutet. Die Knockout-Mutante bzip1/2/11/44/53 zeigte ähnliche Phänotypen, wenn auch weitaus ausgeprägter und begleitet von Wachstumsverzögerungen. Metabolische Untersuchungen ergaben, dass diese Veränderungen in der Architektur mit reduzierten Zuckerspiegeln in distalen sink� Geweben wie Blüten und Wurzeln einhergingen. Die Zuckerspiegel waren auch in den Apoplasten der Blätter vermindert, was darauf hindeutet, dass der Ferntransport von Zucker durch apoplastische Phloembeladung in den Mutanten beeinträchtigt war. Im Gegensatz dazu wurden eine erhöhte Zuckerzufuhr zu den proximalen Achselknospen und erhöhte Stärkekonzentrationen in den Blättern gemessen. Zusätzlich war die Konzentration freier Aminosäuren in bzip2/11/44 und bzip1/2/11/44/53 10 erhöht, insbesondere für die wichtigen Transportformen Asparagin und Glutamin. Die erhöhte C- und N-Verfügbarkeit in den proximalen Geweben könnte die Ursache für die verstärkte axilläre Verzweigung in den Mutanten sein. Um bZIP-Zielgene zu identifizieren, die die beobachteten Verschiebungen im Stoffwechselstatus verursachen könnten, wurden RNAseq-Experimente durchgeführt. Auffallend ist, dass die Gene der Gruppe III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) unter den unterschiedlich exprimierten Genen sehr häufig vorkamen. Da SWEETs für den Zuckerexport in den Apoplasten und den Langstreckentransport durch das Phloem von entscheidender Bedeutung sind, ist ihre verringerte Expression wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Veränderungen in der Zuckerallokation. Ebenso könnte die verringerte Expression von GLUTAMIN AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), die Glutaminase-Aktivität aufweist, eine Erklärung für die Häufigkeit von Glutamin in den Mutanten sein. Zusätzliche Experimente (ATAC-seq, DAP-seq, PTA, q-RT-PCR) bestätigten die direkte Induktion von SWEETs und GAT1_2.1 durch S1 bZIPs. Um die Beteiligung dieser Zielgene an den in den S1 bZIP� Mutanten beobachteten Phänotypen zu bestätigen, wurden loss-of-function-Mutanten untersucht, die eine mäßig erhöhte axilläre Verzweigung aufwiesen. Gleichzeitig hatte die induzierte Überexpression von bZIP11 in axillären Meristemen den gegenteiligen Effekt. Auf Basis dieser Ergebnisse wird ein Modell für die Funktion von S1 bZIPs bei der Regulierung der Entwicklung von sink-Geweben vorgeschlagen. Für einen effizienten Zuckertransport über große Entfernungen könnten bZIPs erforderlich sein, um die Expression von SWEETs der Gruppe III zu induzieren. Eine verringerte SWEET-Expression in den S1 bZIP-Mutanten würde zu einem Rückgang der apoplastischen Zuckerbeladung und einer verringerten Versorgung von distalen sink-Geweben wie den Spross- oder Wurzelspitzen führen. Die Verringerung des Ferntransports könnte zu einer Anhäufung von Zucker in den Blättern führen, der dann verstärkt über symplastische Wege zu proximalen sink� Geweben wie den axillären Meristem und Seitenwurzeln transportiert oder als Stärke gespeichert wird. Die verringerte GAT1_2.1 Expression führt zu einem Überfluss an Glutamin, einer wichtigen Stickstofftransportform. Die kombinierte Wirkung auf die C- und N-Allokation führt zu einer erhöhten Nährstoffverfügbarkeit in den proximalen Geweben und fördert die Bildung von seitlichen Pflanzenorganen. Neben neuen Erkenntnissen, die die Wirksamkeit von bZIPs bei der Steuerung der Nährstoffallokation in anderen Arten unterstreichen, wird eine neuartige, jedoch evolutionär konservierte Rolle für S1 bZIPs als Regulatoren der Entwicklungsplastizität vorgeschlagen, während die Generierung wertvoller Datensätze und neuer genetischer Ressourcen dazu beitragen wird, ein tieferes Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen zu gewinnen.

Arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM) is a genetically heterogeneous group of myocardial diseases characterized by malignant arrhythmias and fibro-adipogenic replacement of the myocardium leading to heart failure and sudden cardiac death. While variants in genes coding for proteins of the desmosomes account for the majority of cases, a rarer but particularly severe form is caused by a heterozygous variant in the gene encoding the transmembrane protein 43 (TMEM43). TMEM43 is a component of the inner nuclear membrane and is involved in the structural organization of the nuclear envelope (NE) and thus in the maintenance of nuclear integrity. The genetic variant TMEM43 c.1073C>T p.S358L was first identified in an isolated population on the island of Newfoundland and was unequivocally classified as causative for a fully penetrant subtype of ACM. In contrast, the pathogenicity of the less described TMEM43 p.P111 variants c.331C>G p.P111A, c.332C>T p.P111L and c.332C>A p.P111Q is still under discussion. To date, several model systems have been generated, including induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (CMs), transgenic or knockin rodent models, and a Drosophila model. However, the phenotypes were highly variable, especially among the mouse models, so that the molecular mechanism underlying the pathogenesis is still not fully understood. With respect to the cellular composition of the cardiovascular system and electrophysiology, zebrafish (Danio rerio) show a striking similarity to mammals. To elucidate the role of TMEM43 in cardiac function, this study aimed to establish the zebrafish as in vivo model for TMEM43- associated ACM. To determine the evolutionary conservation of TMEM43, we initially performed phylogenetic analyses, which revealed an overall highly conserved protein sequence. The serine at position p.358 was found to be conserved in all vertebrate species examined, highlighting the importance of this residue. In silico analysis of the TMEM43 p.S358L protein structure suggests structural instability and a deleterious effect, whereas the different p.P111 variants (p.P111L, p.P111A, p.P111Q) are likely to be tolerated and appear to have little effect on TMEM43 tertiary structure. First, the expression pattern of tmem43 was analyzed throughout zebrafish development, focusing on detecting cardiac expression. PCR analysis and whole-mount in situ hybridization revealed broad and ubiquitous expression, including heart tissues, starting from prim-5 stage onward. For more detailed in vivo analyses, CM-restricted transgenic zebrafish lines either overexpressing eGFP-linked full-length human wild-type (WT) TMEM43 or a genetic variant (c.332C>T p.P111L or c.1073C>T p.S358L) were generated using the Tol2 transposase system. Surprisingly, overexpression of WT and p.P111L mutant TMEM43 resulted in ventricular enlargement during embryogenesis and adulthood, but without affecting cardiac function or tissue structure. Ventricular enlargement in these individuals resulted from hypertrophic growth of CMs rather than hyperplasia due to increased proliferative capacity. Comparative analysis of adult ventricles revealed that transcriptional upregulation of the mechanistic target of rapamycin signaling pathway and increased expression of genes involved in ribosome biogenesis are the major contributors to the hypertrophic phenotype in these two transgenic zebrafish lines. Moreover, immunofluorescence staining in embryonic and adult hearts of individuals from the p.S358L mutant TMEM43 line demonstrated that the corresponding protein is unstable and is partially redistributed from the NE to the cytoplasm. Interestingly, both TMEM43 mutant zebrafish lines showed cardiac morphological defects in juvenile stages and ultrastructural changes within the myocardium, such as altered mitochondrial morphology in adulthood. The significantly smaller mitochondria in both transgenic lines expressing TMEM43 variants could indicate metabolic changes and are consistent with the transcriptomic data showing that metabolic pathways were altered. Nevertheless, two key pathological hallmarks of ACM were not recapitulated. Firstly, there was no evidence of myocardial replacement by fatty and fibrotic tissue in the histological specimens, and secondly no electrophysiological changes such as arrhythmias were detected in the electrocardiographic measurements. To further determine the role of TMEM43 in heart development, the loss-of-function (LoF) effect of a knockout in zebrafish was investigated by generating Tmem43 LoF lines using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated protein 9 technology. Notably, homozygous global loss of Tmem43 function in zebrafish does not affect embryonic cardiogenesis or cardiac function, but results in an age-dependent cardiac phenotype, characterized by ventricular enlargement in adulthood. In summary, our in vivo experiments indicate an effect of the TMEM43 variant c.332C>T p.P111L on heart development, although this may be zebrafish-specific and mediated by a so far unknown mechanism independent of the p.S358L variant. Without the identification of this underlying molecular mechanism, the available experimental evidence is not sufficient to conclusively determine the clinical significance of the TMEM43 alteration c.332C>T p.P111L in ACM. Moreover, the investigation of the transgenic and LoF zebrafish models rather support the concept of a dominant-negative effect as the causative pathomechanism of the ACM-linked TMEM43 variant c.1073C>T p.S358L in patients. Besides this observations our results clarify that the deleterious variant does not only disrupt cardiac morphogenesis in zebrafish embryos, but also leads to ultrastructural and transcriptomic changes in adults, thus suggesting that metabolic alterations may contribute to disease. / Bei der arrhythmogenen Kardiomyopathie (ACM) handelt es sich um eine genetisch heterogene Gruppe von Herzmuskelerkrankungen, die durch maligne Herzrhythmusstörungen und dem fibro-adipogenen Ersatz des Herzmuskels gekennzeichnet sind. Dies kann zu Herzversagen und plötzlichem Herztod führen. Ursächlich für die Mehrzahl der Fälle sind angeborene, pathogene Genvarianten, welche die Funktionen von Desmosomen beeinflussen. Weiterhin wird eine seltenere, aber besonders schwere Form der ACM durch eine heterozygote Variante im Transmembranprotein 43 (TMEM43) Gen verursacht. TMEM43 ist ein Bestandteil der inneren Kernmembran, ist an der strukturellen Organisation der Kernhülle beteiligt und ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Kernintegrität. Die TMEM43- Genvariante c.1073C>T p.S358L wurde erstmals in einer isolierten Population auf der Insel Neufundland identifiziert und eindeutig als Ursache für einen vollständig penetranten Subtyp von ACM klassifiziert. Im Gegensatz dazu ist die Pathogenität der weniger beschriebenen TMEM43-Varianten c.331C>G p.P111A, c.332C>T p.P111L und c.332C>A p.P111Q noch immer unklar. Bisher wurden mehrere Modellsysteme entwickelt, darunter aus induzierten pluripotenten Stammzellen generierte Kardiomyozyten, transgene oder knockin Nagetiermodelle und ein Drosophila Modell. Die beobachteten Phänotypen variieren jedoch stark, insbesondere zwischen den Mausmodellen, weshalb der zugrundeliegende molekulare Pathomechanismus noch nicht als vollständig verstanden gilt. Hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung des Herz-Kreislauf-Systems und der Elektrophysiologie weisen Zebrafische (Danio rerio) eine auffallende Ähnlichkeit mit Säugetieren auf. Um die Rolle von TMEM43 für die Herzfunktion zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit der Zebrafisch als in vivo Modell für die TMEM43-assoziierte ACM etabliert. Die initiale phylogenetische Analyse hat gezeigt, dass die TMEM43-Proteinsequenz einen hohen Grad an evolutionärer Konservierung aufweist. Das Serin an Position p.358 ist in allen untersuchten Wirbeltierarten konserviert, was die Bedeutung dieser Aminosäure unterstreicht. In silico Analysen der TMEM43 p.S358L Proteinstruktur deuten auf strukturelle Instabilität und einen pathogenen Effekt nach Veränderung der Aminosäure hin. Wohingegen die verschiedenen p.P111-Varianten (p.P111L, p.P111A, p.P111Q) wahrscheinlich toleriert werden und nur geringe Auswirkungen auf die TMEM43-Tertiärstruktur zu haben scheinen. Zunächst wurde das Expressionsmuster von tmem43 während der gesamten Zebrafischentwicklung analysiert, wobei der Schwerpunkt auf dem Nachweis der kardialen Expression lag. PCR-Analysen und in situ Hybridisierungen zeigten eine breite und ubiquitäre tmem43 Expression, auch im Herzen, ab dem Prim 5-Stadium. Für tiefergehende in vivo Analysen wurden mit Hilfe des Tol2-Transposase-Systems transgene Zebrafischlinien generiert, die eGFP-gekoppeltes humanes Wildtyp (WT) TMEM43 oder eine genetische TMEM43-Variante (c.332C>T p.P111L oder c.1073C>T p.S358L) Kardiomyozyten-spezifisch überexprimieren. Überraschenderweise führte die Überexpression von WT und p.P111L TMEM43 zu einer Ventrikelvergrößerung ohne Beeinträchtigung der Herzfunktion oder der Gewebestruktur, die vom Embryo bis ins adulte Stadium anhielt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die ventrikuläre Vergrößerung in den transgenen Tieren eher auf ein hypertrophes Wachstum der Kardiomyozyten zurückzuführen ist, als auf eine Hyperplasie aufgrund einer erhöhten Proliferationskapazität. Eine vergleichende Transkriptomanalyse von adulten Ventrikeln der verschiedenen Linien verdeutlichte, dass die erhöhte Expression von Transkripten des mechanistic target of rapamycin-Signalweges und der Ribosomenbiogenese ein Merkmal für den hypertrophen Phänotyp im Zebrafisch sind. Weitere Immunfluoreszenzfärbungen in embryonalen und adulten Herzen transgener Tiere zeigten, dass TMEM43 p.S358L instabil ist und teilweise von der Kernhülle ins Zytoplasma umverteilt wird. Interessanterweise entwickelten beide Zebrafischlinien mit einer TMEM43- Variante im juvenilen Stadium morphologische Defekte des Herzens und im adulten Stadium ultrastrukturelle Veränderungen im Myokard, wie z.B. eine veränderte Morphologie der Mitochondrien. Die signifikant kleineren Mitochondrien in beiden transgenen TMEM43- Varianten Linien könnten auf metabolische Veränderungen hindeuten und stimmen mit den Transkriptomdaten überein, da diese deutliche Veränderungen von metabolischen Signalwegen zeigen. Zwei wichtige pathologische Merkmale von ACM wurden jedoch nicht rekapituliert. Einerseits zeigten die histologischen Proben keine Anzeichen einer Substitution des Herzmuskels durch Fett- und fibrotisches Gewebe, und weiterhin wiesen die elektrokardiographischen Messungen keine elektrophysiologischen Veränderungen wie Arrhythmien auf. Um die Rolle von TMEM43 in der Herzentwicklung tiefergehend zu analysieren, wurden die Auswirkungen eines knockouts des orthologen Gens im Zebrafisch untersucht. Dazu wurden mit Hilfe des Gen-Editierungssystems clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-assoziiertes Protein 9 Tmem43 loss-of-function (LoF)-Linien generiert. Unsere Untersuchungen zeigten, dass der Verlust der Tmem43-Funktion in homozygoten tmem43 knockout Zebrafischen weder die embryonale Kardiogenese noch die Herzfunktion beeinträchtigt. Jedoch führt dieser zu einem altersabhängigen kardialen Phänotyp, der durch eine Vergrößerung des Ventrikels im adulten Stadium gekennzeichnet ist. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass die TMEM43-Variante c.332C>T p.P111L einen Einfluss auf die Herzentwicklung hat. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass dieser möglicherweise Zebrafisch-spezifisch ist und durch einen anderen, von der p.S358L Variante unabhängigen, unbekannten Mechanismus vermittelt wird. Die klinische Bedeutung der TMEM43-Variante c.332C>T p.P111L für die ACM kann daher anhand der in vivo Daten nicht endgültig beurteilt werden. Darüber hinaus unterstützen die Ergebnisse des transgenen und des LoF-Zebrafischmodells das Konzept eines dominant-negativen Effekts als zugrundeliegenden Pathomechanismus der ACM-assoziierten TMEM43-Variante c.1073C>T p.S358L. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die pathogene Veränderung nicht nur die kardiale Morphogenese im Zebrafischembryo beeinträchtigt, sondern auch zu ultrastrukturellen und transkriptionellen Veränderungen im adulten Stadium führt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass durch die TMEM43-Variante ausgelöste Stoffwechselveränderungen zum Fortschreiten der Krankheit beitragen könnten.

La microcéphalie est une maladie neurologique du nouveau-né qui se traduit par une circonférence réduite de la tête, une déficience intellectuelle et des défauts anatomiques du cerveau. La microcéphalie peut être la conséquence d’une infection, de stress environnementaux ou de mutations génétiques.Le cerveau commence à se former dès la cinquième semaine de grossesse et est majoritairement constitué de cellules souches neuronales, cellules qui conservent une capacité a se reproduire a l’identique sans se spécialiser. Cette première phase de prolifération est importante pour générer suffisamment de cellules. Suit une phase de différenciation, durant laquelle les cellules préalablement formées se différencient en deux groupes : les neurones, qui permettent de partager l’information grâce à des influx électriques, et les cellules gliales, qui soutiennent activement les fonctions des cellules neuronales.Je m’intéresse à un gène en particulier, KNL1, muté chez certains patients microcéphales. Grace aux nouvelles techniques d’édition du génome, j’ai reproduit la mutation retrouvée chez les patients dans des cellules souches pluripotentes humaines. En utilisant un modèle tridimensionnel (mini-cerveaux en culture), à partir de cellules souches neuronales, j’ai analysé de manière quantitative les étapes-clés de développement: les phases de prolifération et de différenciation.Mes travaux de recherche ont montré que les cellules souches neuronales portant la même mutation que les patients prolifèrent moins, réduisant le nombre de cellules initiales nécessaires au développement cérébral normal. Par ailleurs, les cellules souches neuronales se différencient prématurément en neurones et cellules gliales, ce qui réduit davantage le nombre le nombre final de cellules. Cette hypothèse a été confirmée par l’utilisation du modèle tridimensionnel, ou les mini-cerveaux sont plus petits que la normale.Cette étude est essentielle non seulement pour comprendre le développement de la maladie, mais également pour comprendre les étapes clés du développement du cerveau humain, et ne pourrait pas être mener à bien sur des modèles animaux. En outre, l’utilisation de cellules souches induites nous permet de ne pas utiliser de cellules embryonnaires, si nécessaire pour raisons d’éthique. / Microcephaly is a neurological condition, resulting in patients having a small head circumference, intellectual impairment and brain anatomical defects. A pre-requisite for achieving a better understanding of the cellular events that contribute to the striking expansion of the human cerebral cortex is to elucidate cell-division mechanisms, which likely go awry in microcephaly. Most of the mutated genes identified in microcephaly patient encode centrosomal protein, KNL1 is the only gene that encodes a kinetochore protein, it plays a central role in kinetochore assembly and function during mitosis. While the involvement of centrosome functions is well established in the etiology of microcephaly, little is known about the contribution of KNL1.In an attempt to assess the role of KNL1 in brain development and its involvement in microcephaly, we generated isogenic human embryonic stem cell (hESC) lines bearing KNL1 patient mutations using CRISPR/Cas9-mediated gene targeting. We demonstrated that the point mutation leads to KNL1 reduction in neural progenitors. Moreover, mutant neural progenitors present aneuploidy, an increase in cell death and an abrogated spindle assembly checkpoint. Mutant fibroblasts, derived from hESC, do not have a reduced expression of KNL1 and do not present any defect in cell growth or karyotype, which highlight a brain-specific phenotype.The subsequent differentiation of mutant neural progenitors into two-dimensional neural culture leads to the depletion of neural progenitors in the favor of premature differentiation. We developed a three-dimensional neural spheroids model from neural progenitors and reported a reduced size of mutant neural spheroids, compare to control. Lastly, using knockdown and rescue assays, we proved that protein level of KNL1 is responsible of the premature differentiation and the reduced size.These data suggest that KNL1 has a brain-specific function during the development. Changes in its expression might contribute to the brain phenotypic divergence that appeared during human evolution.

IRAK2 besitzt eine Schlüsselrolle im Signalweg des TLR4. Fehlregulationen dieses Signalwegs führen zu fehlgeleiteten Immunreaktionen, die auch die Entstehung und Progression von Krebserkrankungen fördern. Bevor IRAK2 als therapeutisches Ziel in Frage kommen kann, muss erst noch weitere Klarheit über die grundsätzliche Funktionsweise dieses Proteins bestehen. So ist für IRAK2 aufgrund der Substitution einer Aminosäure in der Kinase-Domäne im Vergleich zu IRAK1 noch nicht abschließend geklärt, ob es sich um eine aktive Kinase oder eine Pseudokinase handelt und ob diese Veränderung eine Erhöhung oder eine Erniedrigung der Funktion im TLR4-Signalweg nach sich zieht. Um diese Fragen anzugehen, wurde in dieser Arbeit Asparagin im vermeintlich aktiven Zentrum (Aminosäure 333) wieder zur Asparaginsäure [N333D] revertiert und damit versucht die Phosphorylierungsaktivität zu steigern bzw. vergleichbar zu IRAK1 wiederherzustellen. Das Einbringen der Mutation in IRAK2 erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Mit dieser und anderen Mutanten und mit wildtypischem IRAK2 wurden durch die CRISPR/Cas9-Methode generierte IRAK2-defiziente 264.7 Makrophagen rekonstituiert und damit ein System etabliert, mit dem der Einfluss der Mutation auf den Signalweg des TLR4 nach Stimulation mit LPS quantitativ analysiert werden konnte. Sowohl die indirekte NF-κB-Messung über CD40-Expression als auch die direkte NF-κB-Messung über die NF-κB-getriebene Expression eines Reportergens (cyan fluorescent protein) ergab, dass IRAK2[N333D] die LPS-abhängige NF-κB-Aktivierung über den TLR4 Signalweg schlechter ermöglicht als IRAK2. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die in der Entwicklungsgeschichte aufgetretene Veränderung des aktiven Zentrums von IRAK2 im Vergleich zu IRAK1 zu einer besseren Aktivierung der MyD88-abhängigen NF-κB-Aktivität führte und somit eine erhöhte und länger anhaltende Signalleitung ermöglichte. Diese Erkenntnis kann als weiterer Schritt hin zu einem besseren Verständnis der Funktion des IRAK2-Proteins und zu einer möglichen zukünftigen Verwendung von IRAK2 als Ziel therapeutischer Behandlungen gesehen werden. / Toll-like receptors are fundamental for many immune cells. The protein IRAK2 plays a key role in the signaling pathway downstream of TLR4 and other TLRs. Due to a change at amino acid position 333 of the protein from aspartate (D) to asparagine (N) in the presumed active center of the kinase it is unclear if IRAK2 is an active kinase. In this research the mutation IRAK2-N333D was investigated thereby trying to reconstitute the evolutionarily original version of the protein. Interestingly, overexpression of IRAK2-N333D in IRAK2-deficient RAW 264.7 cells obtained by using the CRISPR/Cas9-system was less effective in activating LPS-induced CD40 expression and NF-κB activity as compared to wild type IRAK2. Our results suggest that the evolutionary alteration in the "catalytic center" of IRAK2 led to improved signal transduction thereby allowing longer-lasting activation of the cells. This knowledge might help to better target IRAK2 in therapies.

The development of molecular tools that enable precise manipulation and control of biological systems would allow for a broader understanding of cellular functions and applications in biotechnology, synthetic biology, and therapeutic research. The discovery of CRISPR/Cas systems and the understanding and repurposing of their mechanisms have revolutionized the field of molecular biology. Here, I identified and characterized novel CRISPR/Cas systems and applied them for different in vivo and in vitro applications. In this work, I interrogated various Cas13 effector proteins and identified the most efficient Cas13 effector (CasRx) for in planta applications. I adapted CasRx to engineer plant immunity against different plant RNA viruses. CasRx showed robust activity and specificity against RNA viruses, demonstrating its suitability for studying key questions relating to virus biology. To expand the Cas13 toolbox and enable new applications, I performed a homology search of Cas13 enzymes in prokaryotic genomes and metagenomes, and identified previously uncharacterized, novel CRISPR/Cas13 effector proteins. I first identified and functionally characterized a small size, miniature Cas13 effector (named here as mCas13) and combined it with isothermal amplification to develop a simple and sensitive CRISPR-based SARS-CoV-2 diagnostic platform. In addition, I discovered and biochemically characterized the first known thermostable Cas13 proteins and showed that these thermostable proteins are phylogenetically related. I harnessed the unique features of these thermostable enzymes to develop the first one-pot, RT-LAMP coupled Cas13-based nucleic acid detection assay, which was utilized for highly sensitive, specific, and easily programmable detection of SARS-CoV-2 and other viruses. Lastly, I utilized CRISPR/Cas12a to develop a detection assay of plant ssDNA geminiviruses with easy-to-interpret visual readouts, making it suitable for point-of-use applications. In addition, I leveraged the self vs. non-self-discrimination and pre-crRNA processing capabilities of CRISPR/Cas12a, with the allosteric transcription factors (aTFs)- regulated expression of CRISPR array to engineer a field-deployable small molecule detection platform. I demonstrated the ability of the developed platform to detect different tetracycline antibiotics with high sensitivity and specificity. In conclusion, my work demonstrates that the discovery and characterization of programmable nucleic acid targeting systems could enable their utility for biotechnological innovations, including technologies for inhibition of viral replication and diagnostics.

The ability to precisely regulate gene expression patterns and to modify genome sequence in a site-specific manner holds much promise in determining gene function and linking genotype to phenotype. DNA-binding modules have been harnessed to generate customizable and programmable chimeric proteins capable of binding to site-specific DNA sequences and regulating the genome and epigenome. Modular DNA-binding domains from zinc fingers (ZFs) and transcriptional activator-like effectors (TALEs) are amenable to engineering to bind any DNA target sequence of interest. Deciphering the code of TALE repeat binding to DNA has helped to engineer customizable TALE proteins capable of binding to any sequence of interest. Therefore TALE repeats provide a rich resource for bioengineering applications. However, the TALE system is limited by the requirement to re-engineer one or two proteins for each new target sequence. Recently, the clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR associated 9 (Cas9) has been used as a versatile genome editing tool. This machinery has been also repurposed for targeted transcriptional regulation. Due to the facile engineering, simplicity and precision, the CRISPR/Cas9 system is poised to revolutionize the functional genomics studies across diverse eukaryotic species. In this dissertation I employed transcription activator-like effectors and CRISPR/Cas9 systems for targeted genome regulation and editing and my achievements include: 1) I deciphered and extended the DNA-binding code of Ralstonia TAL effectors providing new opportunities for bioengineering of customizable proteins; 2) I repurposed the CRISPR/Cas9 system for site-specific regulation of genes in plant genome; 3) I harnessed the power of CRISPR/Cas9 gene editing tool to study the function of the serine/arginine-rich (SR) proteins.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第19765号 / 農博第2161号 / 新制||農||1039(附属図書館) / 学位論文||H28||N4981(農学部図書室) / 32801 / 京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻 / (主査)教授 佐藤 健司, 教授 澤山 茂樹, 准教授 田川 正朋 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Morbus Cushing ist die häufigste Ursache für endogenes Cushing-Syndrom und führt auf Grund eines kortikotropen Hypophysenadenoms zu einem Glucocorticoid Überschuss und wiederum zu einer hohen Morbidität und Mortalität. Die Ursache hierfür sind unter anderem somatische Mutationen in den Deubiquitinasen USP8 und USP48. Das Ziel dieser Arbeit war es mittels der CRISPR/Cas9-Methode, die Mutationen USP8 und USP48 in Zelllinien zu etablieren und diese für Cushing-Syndrom Analysen zu verwenden. Hierfür wurden in dieser Arbeit gRNAs für USP8 und USP48 designt, welche anschließend in die humane embryonale Zelllinie HEK293AD Zellen transfiziert wurden. Diese Zellen wurden zu monoklonalen Zellen vereinzelt. Ziel war einen Knock-out von USP8 bzw. USP48 zu generieren. Es konnte ein erfolgreicher Zellklon generiert werden mit einem Knock-out von USP48. Ebenfalls konnte ein Genomediting von USP8 in Exon 20 durchgeführt werden. Zusammenfassend konnte die CRISPR/Cas9 Methode für ein M. Cushing-Zellmodells etabliert und eine gute Ausgangsbasis für weitere Experimente (z.B. ein gezielter Knock-in von USP8- und USP48- Mutationen) generiert werden. / Cushing disease (CD) is the most common reason for endogenous Cushing syndrome (CS). It is caused by corticotrope adenoma of the pituitary resulting in hypercortisolism that is associated with high morbidity and mortality. One of the underlying reasons are the activating mutations of the deubiquitinase USP8 and USP48. The objective of this work was to establish the USP8 and USP48 mutations in cell lines by the CRISPR/Cas9 method in order to use them for further CS analyses. Therefore, we designed gRNAs against USP8 and USP48 which were transfected into the human embryonal cell line of HEK293AD cells. Those cells were separated to generate monoclonal cell lines entailing the knock-out of either USP8 or USP48. We successfully provided a cell clone with a knock-out of USP48. Furthermore, we were able to edit the genome of USP8 in exon 20. In summary we were able to establish the CRISPR/Cas9 method for a CD cell model and provided a good baseline for further experiments (i.e., creating a knock-in of USP8 and USP48 mutations).

Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen. / The aim of this work was a nanoscopic analysis of structural differentiation and plasticity of presynaptic active zones (AZs) at the NMJ of Drosophila melanogaster using super-resolution light microscopy of Bruchpilot (Brp). The localization microscopy technique dSTORM was primarily used. New analysis algorithms based on HDBSCAN were developed to ensure objective and largely automatized quantification including the substructure of the AZ. Differentiation was assessed using the model of phasic and tonic neurons that are represented by type Is and type Ib neurons at this NMJ. Phasic Is synapses with higher release probability displayed smaller, more compact AZs with less molecules and an enhanced molecular density with smaller, more compact Brp subclusters. For acute structural plasticity the model of presynaptic homeostasis, which is accompanied by a compensatory increase of neurotransmitter release, was used. Interestingly, this again showed a more compact arrangement of the AZ, that was also found in Brp subclusters, without addition of molecules. It could be demonstrated that a higher molecular density in localization microscopy translates into a higher intensity and area in confocal microscopy and, thus, the apparent discrepancy to earlier studies could be explained. With respect to the coupling distance between VGCCs and presynaptic vesicles compaction appears to be a plausible mechanism for an efficient remodeling of AZ components. The analysis tools and molecular biology strategies, based on the CRISPR/Cas9-System, introduced here will be useful to further clarify the importance of molecular compaction as a general concept of AZ differentiation.

Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) führt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsstörungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Ausprägungsformen die Zähne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchzähne ohne physiologische Wurzelresorption. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene TNAP defiziente immortalisierte Zellen des parodontalen Ligaments (PDL) mittels der CRISPR/Cas9 Methode generiert und anschließend fünf Zelllinien charakterisiert. Die dabei entstandenen Mutationen variierten von einer moderaten heterozygoten Punktmutation zu einer schwerwiegenden homozygoten Deletion eines einzelnen Nukleotids, welche in einem vorzeitigen Stopcodon resultierte. Analysen der ALPL Expression (qPCR), TNAP Aktivitätsmessungen (CSPD Assay) und TNAP Färbungen zeigten einen signifikanten Rückgang in allen TNAP-defizienten Zelllinien mit einer starken Korrelation zwischen der Restaktivität und dem Ausmaß der Mutation, welche in Einklang mit der komplexen Genotyp-Phänotyp Korrelation bei HPP zu bringen ist. Das Potential der osteogenen Differenzierung der hTERT PDL Zellen wurde in der homozygot mutierten Zelllinie komplett unterdrückt. Mögliche Mechanismen des vorzeitigen Zahnverlustes bei HPP Patienten ist die geminderte Formation und Mineralisation des Wurzelzements und die fehlerhafte Insertion der parodontalen Fasern. Die hier erstmalig etablierten Zellkulturmodelle liefern ein valides spenderunabhängiges in vitro Modell der HPP, welches dazu beitragen kann, die molekularbiologischen Zusammenhänge der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie zu ergründen und daraus gegebenenfalls neue Therapieansätze abzuleiten. / Hypophosphatasia (HPP) is a rare inherited disorder caused by loss-of-function mutations in the ALPL gene encoding the Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP). Besides skeletal symptoms, some patients also present dental abnormalities like for example the premature loss of deciduous teeth. Here we generated and characterized five different TNAP-deficient periodontal ligament (PDL) derived cell lines using the method of CRISPR-Cas9. The mutations varied from a moderate heterozygous point mutation to a severe homozygous deletion leading to a premature stop codon. Analysis of the ALPL expression and TNAP activity measurements in CSPD Assays and TNAP stainings revealed a decrease for all TNAP-deficient cell lines with a strong correlation between the residual activity and the extend of the mutation. The already limited differentiation capacity of immortalized hTERT (human telomerase reverse transcriptase) PDL cells is completely abolished in the homozygously mutated cell line. Putative key mechanisms for the premature exfoliation in HPP are the restricted formation and mineralization of the cementum and the impaired insertion of elastic dental fibers. The newly generated TNAP-deficient cell lines provide a promising and donor independent in vitro model to gain better understanding of the molecular mechanisms of dental problems in HPP.