Le facteur 4 plaquettaire (PF4/CXCL4) est un tétramère constitué de quatre sous-unités identiques de 7,8 kDa qui est libéré en grande quantité par les plaquettes lors de l’hémostase primaire (ensemble des phénomènes permettant un colmatage initial d’une lésion vasculaire). L’étude de la formation d’un caillot de fibrine en présence de PF4 montre une augmentation de la turbidité finale du caillot : le PF4 modifie le réseau formé. Etant donné que la plupart des acteurs de la fibrinolyse se lie au caillot de fibrine et que le PF4 modifie sa structure, nous avons pensé qu’il serait intéressant de rechercher si le PF4 influençait aussi la fibrinolyse. La lyse d'un caillot est effectuée par la plasmine issue de l'activation du plasminogène par son activateur d’origine tissulaire (t-PA) en présence d’un cofacteur qui n'est autre que la fibrine. Nous avons étudié la lyse de caillots de plasma, obtenus par activation de la cascade de la coagulation, en condition statique et à l'aide d'un modèle de thrombose artérielle (système Chandler loop). Dans les deux cas, une diminution du temps de demi-lyse a été observée en présence de PF4. Cependant, la lyse de caillots préparés par simple ajout de thrombine sur du fibrinogène ne permet pas de retrouver cet effet du PF4. Ceci suggère que l’influence du PF4 sur la structure du caillot n’est pas à l’origine de l’effet sur sa lyse et que le PF4 n’influence pas (ou très peu) l'activation du plasminogène, ainsi que l'activité de la plasmine résultante. Cette hypothèse a été confirmée par l’étude de l’activité amydolytique du t-PA et de la plasmine (quelle soit ajoutée ou générée). En système purifié, les inhibiteurs plasmatiques de la fibrinolyse sont absents. Les deux principaux sont l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1) et l’α2-antiplasmine (α2-AP). La lyse de caillots préparés à partir de plasma déficient en α2-AP montre une diminution du temps de demi-lyse en présence de PF4 (comme pour le plasma normal), alors qu’avec le plasma dépourvu de PAI-1 le temps de demi-lyse n'est plus influencé. De plus, l’ajout de PAI-1 dans le système purifié entraine une diminution du temps de demi-lyse en présence de PF4. Ceci suggère que le PF4 prévient directement ou indirectement l'inhibition du t-PA par PAI-1. L’étude de la cinétique d'inhibition de l’activité amidolytique du t-PA par le PAI-1, la détermination de la stœchiométrie de cette inhibition, et l’analyse de ces cinétiques par immuno-empreinte montrent que le PF4 est un modulateur de la fibrinolyse qui agit en retardant la formation d'un complexe initial entre le t-PA et le PAI-1. Cette nouvelle fonction du PF4 est cohérente, et vient en complément de celle décrite récemment d’inhibiteur de l'activation du TAFI. / Platelet factor 4 (PF4/CXCL4) is a tetramer constituted of four identical 7,8 kDa subunits released in large quantities by platelets during primary heamostasis (allowing initial clogging of a vascular injury). Study of fibrin clot formation in the presence of PF4 shows an increase of the final clot turbidity: PF4 modifies the formed network. Given that most fibrinolysis actors are bound to the fibrin clot and that PF4 modifies its structure we thought it would be interesting to investigate if PF4 also influences fibrinolysis. Clot lysis is performed by plasmin originating from activation of its precursor by tissue plasminogen activator (t-PA) with fibrin itself as cofactor of the reaction. We have studied lysis of plasma clots formed by activation of the coagulation cascade in static condition and in a Chandler loop model mimicking arterial thrombosis. Half-times of lysis decreased in the presence of PF4 in both systems. However, PF4 had no longer detectable influence on the half-time of lysis with clots formed by direct addition of thrombin on purified fibrinogen. Observation suggested that the observed decrease of the half-time of lysis induced by PF4 did not originate from its influence on fibrin clot formation and that PF4 had little effect if any on plasminogen activation or plasmin activity. We confirmed this hypothesis by comparing amydolytic activities of t-PA and plasmin (added or generated through plasminogen activation). In purified system, fibrinolysis inhibitors are absent. The two main inhibitors are plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) and α2-antiplasmin (α2-AP). Lysis of clots obtained from α2-AP deficient plasma showed a decrease of the half-time of lysis in the presence of PF4 (as in normal plasma), whereas in PAI-1 deficient plasma half-time of lysis was unchanged. Moreover if PAI-1 was added to the purified system, half-time of lysis decreased in the presence of PF4. Observations therefore suggested that PF4 prevented directly or indirectly t-PA inhibition by PAI-1. Kinetics of the amidolytic activity of t-PA inhibition by PAI-1 in the presence or not of PF4, determination of its stoichiometry and Western blot analysis of these inhibition kinetics revealed that PF4 is a fibrinolysis modulator which delays formation of the initial (Michaelis) complex between t-PA and PAI-1. This new feature of PF4 is consistent and complementary with its recently described role as a modulator of TAFI activation.

Le récepteur de chimiokine CXCR3 est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG) exprimé, entre autre, sur les cellules T activées lors d’une réponse immune. CXCR3 est activé par trois ligands inductibles par l’interféron-γ (CXCL9, 10, 11) et, plus récemment, il a été découvert que CXCL4 liait CXCR3. Nous savons que CXCR3 joue un rôle dans la chimiotaxie des leucocytes, mais peu d’attention a été portée sur la signalisation biaisée induite par ces quatre ligands. Alors que l’homodimérisation entre récepteurs de chimiokine est un concept grandement observé, l’hétéromérisation entre deux récepteurs reste un domaine de recherche active. La signalisation biaisée et l’hétéromérisation ont été testées grâce à la technique de bioluminescene resonance energy transfer (BRET) dans des cellules HEK293E. Nous présentons une caractérisation pharmacologique des quatre ligands de CXCR3 et démontrons l’hétéromérisation de CXCR3 avec CXCR4 et avec CXCR7. Nos résultats suggèrent que les ligands de CXCR3 n’agissent pas de manière redondante. / The chemokine receptor CXCR3 is a G-protein-coupled receptor (GPCR) rapidly induced on naïve T cells upon activation. CXCR3 is activated by three interferon-γ inducible ligands (CXCL9, 10, 11) and, more recently, CXCL4 has been discovered as a functional ligand for CXCR3. It is known that CXCR3 acts as a chemotactic receptor, but limited attention has been directed to the biased signaling induced by all four ligands. Chemokine receptor homodimerization is now a widely accepted concept, but the extent to which heterodimerization is prevalent remain matter of active research. In this work, biased signalling and heterodimerization were assessed with bioluminescence resonance energy transfer (BRET) in HEK293E cells. We present pharmacological characterization of all four ligands of CXCR3 and heterodimerization of CXCR3 with CXCR4 or CXCR7. Our results suggest that CXCR3 ligands are not redundant and that CXCR3 heterodimerizes with CXCR4 and with CXCR7.