Submitted by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-29T18:03:39Z No. of bitstreams: 1 publico-39-.pdf: 435579 bytes, checksum: 128efa8faf3057e58d047183c5a9e336 (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-29T18:11:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 publico-39-.pdf: 435579 bytes, checksum: 128efa8faf3057e58d047183c5a9e336 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T18:11:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 publico-39-.pdf: 435579 bytes, checksum: 128efa8faf3057e58d047183c5a9e336 (MD5) Previous issue date: 2005 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As doenças mitocondriais são o resultado de mutações herdadas ou espontâneas do DNA mitocondrial (DNAmt) ou DNA nuclear (DNAn) levando à função anormal do sistema de fosforilação oxidativa. Um dos defeitos no DNAn mais freqüentemente descritos neste grupo de doenças são as deficiências isoladas do Complexo I, que é o maior complexo enzimático da cadeia respiratória com 42 subunidades (7 codificadas pelo DNAmt). Propõe-se que a subunidade de 39kDa (CI-39kDa) apresente estreita correlação com a atividade enzimática do complexo I. Sendo assim, poderíamos interrogar se a diminuição da expressão de CI-39kDa, detectada por Western blotting, poderia ser utilizada como um método diagnóstico para as deficiências do Complexo I, além deste método ter como vantagem a utilização de pequena porção de tecido congelado obtido por biópsia. Este trabalho teve como objetivo avaliar a freqüência da diminuição da proteína mitocondrial CI-39kDa no músculo esquelético de pacientes com suspeita de doença mitocondrial, e verificar se mutações conhecidas em genes codificadores de subunidades do Complexo I estariam associadas à diminuição da expressão desta proteína. As proteínas foram obtidas através do lisado de músculo esquelético de 56 pacientes e 21 controles. As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida denaturante, transferidas para membrana PVDF, que foi incubada com um anticorpo anti-CI-39kDa e SDH-Fp (succinato desidrogenase-fração flavoproteína). As bandas foram obtidas por autoradiografia e quantificadas por densitometria. A diminuição da expressão da proteína CI-39kDa, encontrada nos casos com diagnóstico possível e provável para doença mitocondrial, foi de 6%. O estudo por seqüenciamento mostrou somente uma alteração suspeita: mutação de sentido ainda não descrita em NDUFV2. Nossos resultados mostraram que: (1) a freqüência da diminuição da expressão de CI-39kDa foi baixa nos casos estudados com suspeita de doença mitocondrial; (2) a avaliação molecular desses casos mostrou que mutações em genes codificados pelo DNAmt, e mutações conhecidas em genes nucleares para subunidades do complexo I, não foram a causa do defeito destes pacientes; (3) a alteração de NDUFV2 pode ser a causa de uma disfunção do complexo I, a qual deverá ser melhor investigada para confirmar a sua patogenicidade. A ampliação deste estudo poderá confirmar a utilidade deste método para o diagnóstico das deficiências do Complexo I. / Mitochondrial diseases are caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) or nuclear DNA (nDNA), leading to abnormal function of the oxidative phosphorylation. One of the most frequent nDNA defects described in this group of diseases are Complex I deficiency. Complex I is the largest enzymatic complex of the respiratory chain, contains 42 subunits (7 are mtDNA encoded). It is proposed that a 39kDa subunit (CI-39kDa) expression closely correlates with the enzymatic activity of complex I. Thus we could hypothesize that a decrease in the expression of CI-39kDa, detected by Western blotting, would be a good diagnostic method for complex I deficiencies, considering the requirement of low amounts of frozen biopsied tissue as a good advantage of this method. The aim of this study was to evaluate the frequency of decreased expression of the CI- 39kDa in skeletal muscle of patients with a suspicion for mitochondrial disease and to verify whether known mutations in Complex I subunit genes are associated with a decrease in the expression of this protein. Total proteins were obtained by skeletal muscle lysates of 56 patients and 21 controls. Proteins were electrophoresed through a denaturing polyacrylamide gel, transferred to a PVDF membrane and incubated with antibodies against CI-39kDa and SDH-Fp (succinate dehydrogenase-flavoprotein subunit). After autoradiography the bands were quantified by densitometry. A decreased expression of CI-39kDa was found in 6 % of the cases with a possible or probable diagnosis of mitochondrial disease. Sequencing studies demonstrated only one abnormality: a not yet described missense mutation in NDUFV2. Our results show that: (1) the frequency of a decreased expression in CI-39kDa was low in the studied cases with a suspicion of mitochondrial disease; (2) molecular studies of these cases showed that mutations in mtDNA encoded genes and known mutations in nuclear encoded genes for complex I subunits were not the cause of the defects observed in these patients; (3) the mutation in NDUFV2 can be the cause of a complex I defect, but further investigations are still needed to confirm its pathogenicity. Confirmation of the utility of this method for the diagnosis of complex I deficiency will probably be achieved by a continuation of this study.

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Estudos sugerem que o transtorno bipolar (TB) está associado à disfunção mitocondrial e aumento do estresse oxidativo. O presente estudo tem como objetivo investigar os parâmetros de estresse oxidativo em mitocôndrias isoladas e atividade dos complexos mitocondriais em linfócitos de pacientes com TB durante episódios depressivos ou eutímicos. Este estudo avaliou os níveis de atividades dos complexos mitocondriais (I, II, II-III e IV) em linfócitos de pacientes com TB. Além disso, o presente estudo avaliou os seguintes parâmetros de estresse oxidativo: ânion radical superóxido, superóxido dismutase, espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e níveis de carbonila em partículas submitocondriais de linfócitos de pacientes bipolares. Nesse estudo foram incluídos 51 pacientes bipolares: 34 na fase eutímica e 17 na fase depressiva. As fases do transtorno bipolar foram definidas com base na Escala Young para Mania (YMRS) e Escala de Hamilton para Depressão (HDRS). Os resultados indicaram que os pacientes durante a fase depressiva apresentaram um aumento nos níveis submitocondriais de radical superóxido, de superóxido dismutase, de carbonila e de TBARS. Essas alterações nos parâmetros de estresse oxidativo foram companhados pela diminuição da atividade do complexo II. Além disso, observou-se uma correlação negativa entre HDRS e complexo II nos linfócitos de pacientes depressivos bipolares. Houve uma correlação negativa entre a atividade do complexo II e parâmetros de estresse oxidativo. Ainda, foi observado uma correlação positiva entre HDRS e níveis de radical superóxido, superóxido dismutase, TBARS e carbonila. Os resultados do presente estudo sugerem que o estresse oxidativo mitocondrial e a disfunção do complexo mitocondrial II podem desempenhar papéis importantes na fase depressiva do TB.

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / As causas e mecanismos biológicos do transtorno depressivo maior (TDM) são multifatoriais. Possivelmente, como consequência da heterogeneidade de fatores, as respostas aos tratamentos são ainda bastante inconsistentes, exigindo um longo período para estabelecer uma resposta terapêutica e, ainda, um grande percentual de pacientes é refratário aos antidepressivos clássicos ou outras estratégias terapêuticas. O estresse no início da vida e alguns mecanismos fisiológicos inerentes a ele parecem envolvidos na depressão resistente a tratamentos (DRT). A quetiapina, um antipsicótico atípico, exerce resposta terapêutica e induz alterações fisiológicas que parecem subjacentes à DRT. Portanto, o objetivo deste estudo foi analisar em estruturas cerebrais o efeito do tratamento agudo e crônico (14 dias) com quetiapina sobre parâmetros bioquímicos que refletem as atividades dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória mitocondrial (CRM), da enzima creatina quinase (CK) e o estresse oxidativo. Além disso, avaliar o efeito da administração aguda e crônica da quetiapina sobre o comportamento semelhante à depressão no teste de natação forçada (TNF) e do tratamento crônico (14 dias), no comportamento tipo depressivo de ratos submetidos à privação materna (PM), bem como sobre atividades enzimáticas de histonas acetiltransferases (HAT), histonas desacetilases (HDAC) e DNA metiltransferases (DNAMT) nos animais submetidos a PM. A atividade enzimática da CRM variou de acordo com a concentração de quetiapina (20, 40 ou 80 mg/kg), a região cerebral e o tratamento agudo (uma injeção i.p.) ou crônico (14 dias). De uma forma geral a atividade dos complexos I a III foi aumentada, especialmente após a administração aguda. A administração aguda aumentou a atividade do complexo IV e da CK na amígdala, enquanto o complexo I foi inibido no córtex pré-frontal e no núcleo accumbens. A quetiapina reduziu o tempo de imobilidade no TNF após o tratamento agudo (20 mg/kg). Após o tratamento crônico, a quetiapina reduziu o tempo de imobilidade e aumentou o tempo de escalada. Sobre os parâmetros do estresse oxidativo, o tratamento agudo (20 mg/kg) reduziu a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) na amígdala. Após tratamento crônico (14 dias), a MPO foi reduzida na amígdala, córtex pré-frontal e hipocampo.

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença hereditária, degenerativa e progressiva dos músculos esqueléticos. É causada pela ausência da proteína distrofina e caracterizada pela perda progressiva da força muscular e deterioração da capacidade funcional. Alterações na regulação da homeostase do cálcio, proteólise e alterações metabólicas, especialmente mitocondriais, são parte da patogênese da doença. A coenzima Q (CoQ10), potente antioxidante que participa da atividade da cadeia respiratória, tem sido utilizada em ensaios clínicos, entretanto, não há estudos que evidencie seu comprometimento na DMD. O objetivo deste estudo foi avaliar a CoQ10 e a da atividade da cadeia respiratória em fragmentos de biópsia muscular de pacientes com DMD e sua correlação com parâmetros clínicos e a capacidade funcional. O estudo constitui de uma etapa retrospectiva, onde foram analisadas 22 biópsias musculares de pacientes com DMD, e outra prospectiva, onde foram avaliados dez pacientes com DMD. Dez pacientes controles foram utilizados nas duas etapas do estudo. A concentração da CoQ10 foi realizada através da técnica de cromatografia líquida de alta performance de fase reversa. As atividades das enzimas da cadeia respiratória foram medidas através de técnicas espectrofotométricas. A capacidade funcional foi mensurada através das escalas Medida da Função Motora (MFM) e Escala de Avaliação para deambulantes North Star (NSAA), e dos testes cronometrados: tempo para percorrer 10 metros (T10), tempo para realizar a manobra de Gowers (TGowers) e teste da caminhada dos 6 minutos (TC6min). Fase retrospectiva: a média de idade dos pacientes com DMD foi de 6,9 anos, (DP ±2,4) e controles de 8 anos, (DP ±2,69). A dosagem média de CoQ10 nos fragmentos de pacientes com DMD foi de 8,6 µg/g de tecido (DP ±3,9) e nos fragmentos dos controles foi de 31,6 µg/g de tecido (DP ±6,9). A média da área ocupada por fibras musculares nos pacientes com DMD foi de 27,3% (DP ±14,2%) e nos controles foi de 89,2% (DP ±3,3%). Evidenciou-se alta correlação entre aquantidade de CoQ10 e a área relativa ocupada por fibras musculares (r= 0,767 e p= 0,016). As atividades dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória dos pacientes com DMD não demonstraram deficiência. Já o resultado do ensaio conjunto dos complexos II+III, encontra-se significativamente reduzido nos pacientes com DMD. Etapa prospectiva: a média de idade dos pacientes com DMD foi de 6,5 anos, (DP ±2,4). A dosagem média de CoQ10 nos fragmentos de pacientes com DMD foi de 12,6 µg/g de tecido (DP ±5,1). A média da área ocupada por fibras musculares nos pacientes com DMD foi de 40,3% (DP ±20,4%). Houve alta correlação entre a quantidade de CoQ10 e a área relativa ocupada por fibras musculares (r= 0,690 e p= 0,058). A correlação da dosagem da CoQ10 com os instrumentos de avaliação da capacidade funcional foi alta com o TGowers e moderada com MFM total e dimensões 1 e 2, NSAA, T10 e TC6min. Em relação à área relativa de fibras musculares, houve moderada correlação com a dimensão 1 da MFM e com o TGowers. Não houve correlação da CoQ10 e da área relativa ocupada por fibras musculares com os parâmetros clínicos: idade no momento da biópsia, idade do início dos sintomas e tempo de evolução da doença. No presente estudo, concluímos que existe uma deficiência secundária de CoQ10 em pacientes com DMD, a qual contribui para entender a fisiopatologia da doença e com grande relevância para as propostas terapêuticas. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary, degenerative and progressive skeletal muscles disease. It is caused by the absence of the protein dystrophin and characterized by progressive loss of muscle strength and deterioration of functional capacity. Alterations in the regulation of calcium homeostasis, proteolysis and metabolic abnormalities, especially mitochondrial dysfunction, are part of the pathogenesis of the disease. Coenzyme Q (CoQ10), a potent antioxidant that participates in respiratory chain activity, has been used in clinical trials, however, there are no studies showing its involvement in DMD. The purpose of this study was to investigate CoQ10 content and respiratory chain activity in muscle biopsy of patients with DMD and its correlation with clinical parameters and functional capacity. The study consisted of a retrospective phase, in which 22 muscle biopsies from patients with DMD were analyzed, and a prospective phase, where ten patients with DMD were evaluated. The same control group of ten patients were used in the two phases of the study. The concentration of CoQ10 was measured using the reverse phase high performance liquid chromatography technique. Activities of the respiratory chain enzymes were measured by spectrophotometry. The functional capacity was evaluated using the Motor Function Measurement (MFM) and North Star Ambulatory Assessment (NSAA) and the following timed tests: to run 10 meters (T10), to perform the Gowers maneuver (TGowers) and the 6-minute walk test (6MWT). Retrospective phase: the mean age of patients with DMD was 6.9 years (SD ± 2.4) and of controls was 8 years (SD ± 2.69). The mean CoQ10 content in fragments from patients with DMD was 8.6 ?g / g tissue (DP ± 3.9) and in fragments from controls was 31.6 ?g / g tissue (DP ± 6.9). The mean area occupied by muscle fibers in patients with DMD was 27.3% (SD ± 14.2%) and in controls was 89.2% (SD ± 3.3%). There was a high correlation between the amount of CoQ10 and the relative area occupied by muscle fibers (r= 0.767 and p= 0.016). The activities of respiratory chain enzymes from patients with DMD were not deficient. On the other hand, the results of the combined analysis of complexes II + III were significantly reduced in patients with DMD. Prospective phase: the mean age of patients with DMD was 6.5 years (SD ± 2.4). The mean CoQ10 content in fragments from patients with DMD was 12.6 ?g / g tissue (SD ± 5.1). The mean area occupied by muscle fibers in patients with DMD was 40.3% (SD ± 20.4%). There was a high correlation between the amount of CoQ10 and the relative area occupied by muscle fibers (r= 0.690 and p= 0.058). The correlation between the amount of CoQ10 and the functional capacity assessment instruments was high forTGowers and moderate for MFM total and dimensions 1 and 2, NSAA, T10 andd TC6min. Regarding the relative area of muscle fibers, there was a moderate correlation with MFM dimension 1 (standing position and transfers) and TGowers. There was no correlation between CoQ10 and relative area occupied by muscle fibers with clinical parameters: age at time of biopsy, age of onset of symptoms and time of disease progression. In the present study, we conclude that there is a secondary deficiency of CoQ10 in patients with DMD, which contributes for the understanding of its physiopathology and is relevant for therapy.

As distrofias musculares de cinturas (DMC) representam um grupo heterogêneo de desordens hereditárias e degenerativas da musculatura esquelética, com evolução progressiva, caracterizadas principalmente pelo acometimento predominante das cinturas escapular e/ou pélvica. São classificadas de acordo com o padrão de herança e o gene envolvido, podendo ser autossômicas dominantes ou autossômicas recessivas. Embora as disfunções mitocondriais tenham sido pouco descritas nas DMC, alguns estudos apresentaram evidências morfológicas e bioquímicas de alterações secundárias na cadeia respiratória mitocondrial. As razões envolvidas em tais disfunções na DMC permanecem pouco compreendidas. Portanto, é imprescindível uma caracterização detalhada da disfunção mitocondrial nos pacientes com DMC para uma melhor compreensão dos processos fisiopatológicos envolvidos na doença. Os objetivos do estudo foram: quantificar a CoQ10 em fragmentos do músculo esquelético de pacientes com DMC; quantificar a atividade enzimática de cada complexo da cadeia respiratória isoladamente; quantificar a atividade dos complexos II+III em conjunto como avaliação indireta da CoQ10; verificar a relação entre a área relativa de fibras musculares no fragmento de biópsia e o grau de disfunção mitocondrial nesses fragmentos; correlacionar a função mitocondrial com parâmetros clínicos de pacientes com DMC. Participaram do estudo 21 pacientes com DMC e 9 controles saudáveis. Os parâmetros clínicos incluídos foram idade no momento da biópsia, idade de início dos sintomas e tempo de evolução da doença. A análise do metabolismo mitocondrial foi realizada por: quantificação da coenzima Q10 nos fragmentos de biópsia muscular e quantificação da atividade dos complexos enzimáticos mitocondriais I, II, III, II+III e IV da cadeia respiratória e da enzima da matriz mitocondrial citrato sintase. Foram correlacionados os parâmetros clínicos, a proporção de fibras na biópsia muscular e os resultados das análises bioquímicas para a caracterização da função mitocondrial. A média dos pacientes com DMC em relação à idade no momento da biópsia, início dos sintomas e tempo de evolução da doença foi de 28,9 anos (DP ±11,7), 16,7 anos (DP ±10,3) e 12,1 anos (DP ±10,9), respectivamente. O grupo controle apresentou média de idade no momento da biópsia de 29,6 anos (DP ±10,3). A dosagem média de CoQ10 nos fragmentos de biópsia de pacientes com DMC foi de 17,9 µg/g de tecido (DP ±9,2) e nos fragmentos dos controles foi de 29,5 µg/g de tecido (DP ±4,4). Não foi observada alteração das atividades isoladas dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória. Houve deficiência da atividade do conjunto de complexos II+III nos pacientes com DMC. A média da área ocupada por fibras musculares nos pacientes com DMC foi de 58,5% (DP ±26,1%) e nos controles foi de 76,35% (DP ±1,9%). Observou-se correlação moderada entre a quantidade de CoQ10 e a área relativa de fibras musculares (r= 0,57 e p= 0,007). Não houve correlação da CoQ10 com os parâmetros clínicos. No presente estudo, concluímos que existe uma deficiência secundária de CoQ10 em pacientes com DMC, sendo um achado importante para melhor entendimento do acometimento mitocondrial nessa doença e uma abordagem terapêutica mais eficaz. / The limb-girdle muscular dystrophy (LGMD) is a group of inherited and degenerative disorders of the skeletal muscle, with a progressive clinical course and predominant involvement of the scapular and/or pelvic girdles. They are classified according to the pattern of inheritance (autosomal dominant or autosomal recessive) and the gene involved. Mitochondrial dysfunction has been reported in the LGMD, some studies have described morphological and biochemical evidences of secondary mitochondrial respiratory chain alterations in patients with LGMD. The reasons involved in such dysfunctions in the LGMD remain poorly understood. Therefore, a detailed characterization of the mitochondrial dysfunction in patients with LGMD allows a better understanding of the pathophysiological processes involved in the disease. Therefore, a detailed characterization of mitochondrial dysfunction in patients with LGMD is essential for a better understanding of the pathophysiological processes involved in the disease. The purposes of the study were: to quantify CoQ10 in fragments of muscle biopsy of patients with LGMD; quantify the enzymatic activity of each respiratory chain complex isolated; quantify the activity of the II + III complexes together as an indirect measure of CoQ10; to verify the relation between the relative area of muscular fibers in the fragment of biopsy and the degree of mitochondrial dysfunction in these fragments; correlate mitochondrial function with clinical parameters of patients with LGMD. Twenty-one patients with LGMD and nine healthy controls participated in the study. The clinical parameters included were age at the time of biopsy, age of onset of symptoms and time of disease progression. The analysis of mitochondrial metabolism was performed by: quantification of CoQ10 in the muscle biopsy fragments and quantification of the activity of the mitochondrial enzyme complexes I, II, III, II + III and IV of the respiratory chain and the enzyme of the mitochondrial matrix citrate synthase. We analyzed the correlation of the clinical parameters, the proportion of fibers in the muscle biopsy and the results of the biochemical analyzes for the characterization of the mitochondrial function. For the LGMD groups, the mean age at the time of biopsy, onset of symptoms and disease duration was 28.9 years (SD ± 11.7), 16.7 years (SD ± 10.3) and 12.1 years (SD ± 10.9), respectively. The control group presented a mean age at the time of biopsy of 29.6 years (SD ± 10.3). The mean CoQ10 dosage in the biopsy specimens of patients with LGMD was 17.9 ?g / g tissue (SD ± 9.2) and in the fragments of the controls was 29.5 ?g / g tissue (SD ± 4, 4). No alterations were observed in the isolated activities of the enzymatic complexes of the respiratory chain. There was a deficiency of the activity of complexes II + III in patients with LGMD. The mean area occupied by muscle fibers in patients with LGMD was 58.5% (SD ± 26.1%) and in controls it was 76.35% (SD ± 1.9%). A moderate correlation was observed between the amount of CoQ10 and the relative area of muscle fibers (r = 0.57 and p = 0.007). There was no correlation of CoQ10 with clinical parameters. In the present study, we conclude that there is a secondary deficiency of CoQ10 in patients with LGMD, which has important implications in the understanding of mitochondrial involvement in this group of diseases and the development of a more effective therapeutic approach.

N,N,N\',N \'-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD) catalisa a autoxidação de coenzimas piridínicos (NADH, NADPH) e modelos (ClBCH ,ClPCH ) ao cátion piridínico com rendimentos de 80-100%. A velocidade destas reações mostrou dependência de primeira ordem com respeito à concentração da 1,4-dihidronicotinamida e de meia ordem em relação às concentrações de O2 e TMPD. Estes dados cinéticos e testes com captadores de ion superóxido e superóxido dismutase indicam que os radicais HO•2 oriundos da autoxidação lenta do TMPD promovem a oxidação da dihidronicotinamida numa reação em cadeia; no término os radicais HO•2 se aniquilam por dismutação. O mecanismo proposto também é confirmado (1º) pela razão kC-H/kC-D=2,3 quando se substitui um dos hidrogênios do C4 de ClBCH por deutério, (2º) pelas idênticas velocidades iniciais em H2O e D2O, (3º) pelo valor da Ea = 10 kcal/mol na autoxidação do NADH e (4º) pelo aumento da velocidade de pH = 7,8 a pH 6,5. TMPD também promove a autoxidação do derivado 5, 6-hidratado (PHTN) da dihidronicotinamida ao cátion piridínico (ClPC+) apenas de fosfato ou arsenato estão presentes. O ClPC+ nã o se forma a partir do ClPCH em equilíbrio com o PHTN. Muito provavelmente se forma a partir do intermediário fosforilado no C6 por oxidação no C4 seguida de eliminação de fosfato. Quando PHTN e ClPCH foram oxidados pelo sistema O2/TMPD na presença de fosfato de piridínio ou de tetra-n-butilamônio em meio piridínico houve formação de pirofosfato, isolado por cromatografia de papel e por resina de troca aniônica. Adicionando-se ADP de tetra-n-butilamôneo ao sistema, constatou-se a formação de pirofosfato e de ATP com rendimentos mínimos de 5% e 3% , respectivamente. Por outro lado se a mistura de reação contém AMP de tetra-n-butilamôneo pôde-se verificar a formação de pirofosfato, ADP e ATP com rendimento total de 28% de \"ligações ricas\". A reação estudada foi proposta como modelo para síntese de ATP no sítio I da cadeia respiratória. / N,N,N\',N\'-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) catalyses the autoxidation of the pyridine coenzymes and of their models to the pyridinium form (80-100% yields). The first arder dependence of the rate upon the dihidronicotinamide concentration and half order upon both the O2 and TMPD concentrations, indicates that the relatively slow autoxidation of TMPD is the source of free radicals: dihydronicotinamide autoxidizes by the HO•2 chain mechanism and in the termination step the HO•2 radicals decay by dismutation. Such a mechanis is also supported by the inhibitory effects of cathecol, a scavenger of the HO•2 radical, and of superoxide dismutase, an enzyme which accelerates the dismutation of the O-2/ HO•2 species. The mecanism is further supported by (1) kC-H/kC-D=2,3 for substitution in 1-benzyl-1,4-dihydronicotinamide (ClBCH), (2) identical rates in H2O and D2O buffers, (3) Ea = 10 kcal/mole in the autoxidation of NADH and (4) the increase in rate from pH 7,8 to 6,5. TMPD promotes also the autoxidation of 1-n-propyl-6-hydroxy-1,4,5,6 - tetrahydronicotinamide (PHTN) to the 1-propyl-3-carboxamidopyridinium cation (ClPC+) provided phosphate ar arsenate are present. ClPC+ originates not from 1-n-propyl-1,4-dihydronicotinamide (ClPCH) in equilibrium with PHTN but most certainly from a C6 phosphorylated intermediate by oxidation at C4 and loss of phosphate. When PHTN an ClPCH were oxidated by the system O2/TMPD in the presence of pyridinium phosphate or tetra-n-butylammonium phosphate in pyridineas solvent, formation of pyrophosphate occurred. Pyrophosphate was isolated and identified by paper and ionic exchange resin chromatography. If tetra-n-butylammonium ADP is also present in the system, one can observe the formation of both pyrophosphate and ATP (5% and 3% minimum yields, respectively). In the presence of tetra-n-butylammonium AMP there, formation of pyrofosphate, ADP and ATP occurs. The total yield of energy rich bond is 28%. We suggest that the reaction is a model for the generation of the first ATP in the respiratory chain.

N,N,N\',N \'-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD) catalisa a autoxidação de coenzimas piridínicos (NADH, NADPH) e modelos (ClBCH ,ClPCH ) ao cátion piridínico com rendimentos de 80-100%. A velocidade destas reações mostrou dependência de primeira ordem com respeito à concentração da 1,4-dihidronicotinamida e de meia ordem em relação às concentrações de O2 e TMPD. Estes dados cinéticos e testes com captadores de ion superóxido e superóxido dismutase indicam que os radicais HO•2 oriundos da autoxidação lenta do TMPD promovem a oxidação da dihidronicotinamida numa reação em cadeia; no término os radicais HO•2 se aniquilam por dismutação. O mecanismo proposto também é confirmado (1º) pela razão kC-H/kC-D=2,3 quando se substitui um dos hidrogênios do C4 de ClBCH por deutério, (2º) pelas idênticas velocidades iniciais em H2O e D2O, (3º) pelo valor da Ea = 10 kcal/mol na autoxidação do NADH e (4º) pelo aumento da velocidade de pH = 7,8 a pH 6,5. TMPD também promove a autoxidação do derivado 5, 6-hidratado (PHTN) da dihidronicotinamida ao cátion piridínico (ClPC+) apenas de fosfato ou arsenato estão presentes. O ClPC+ nã o se forma a partir do ClPCH em equilíbrio com o PHTN. Muito provavelmente se forma a partir do intermediário fosforilado no C6 por oxidação no C4 seguida de eliminação de fosfato. Quando PHTN e ClPCH foram oxidados pelo sistema O2/TMPD na presença de fosfato de piridínio ou de tetra-n-butilamônio em meio piridínico houve formação de pirofosfato, isolado por cromatografia de papel e por resina de troca aniônica. Adicionando-se ADP de tetra-n-butilamôneo ao sistema, constatou-se a formação de pirofosfato e de ATP com rendimentos mínimos de 5% e 3% , respectivamente. Por outro lado se a mistura de reação contém AMP de tetra-n-butilamôneo pôde-se verificar a formação de pirofosfato, ADP e ATP com rendimento total de 28% de \"ligações ricas\". A reação estudada foi proposta como modelo para síntese de ATP no sítio I da cadeia respiratória. / N,N,N\',N\'-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) catalyses the autoxidation of the pyridine coenzymes and of their models to the pyridinium form (80-100% yields). The first arder dependence of the rate upon the dihidronicotinamide concentration and half order upon both the O2 and TMPD concentrations, indicates that the relatively slow autoxidation of TMPD is the source of free radicals: dihydronicotinamide autoxidizes by the HO•2 chain mechanism and in the termination step the HO•2 radicals decay by dismutation. Such a mechanis is also supported by the inhibitory effects of cathecol, a scavenger of the HO•2 radical, and of superoxide dismutase, an enzyme which accelerates the dismutation of the O-2/ HO•2 species. The mecanism is further supported by (1) kC-H/kC-D=2,3 for substitution in 1-benzyl-1,4-dihydronicotinamide (ClBCH), (2) identical rates in H2O and D2O buffers, (3) Ea = 10 kcal/mole in the autoxidation of NADH and (4) the increase in rate from pH 7,8 to 6,5. TMPD promotes also the autoxidation of 1-n-propyl-6-hydroxy-1,4,5,6 - tetrahydronicotinamide (PHTN) to the 1-propyl-3-carboxamidopyridinium cation (ClPC+) provided phosphate ar arsenate are present. ClPC+ originates not from 1-n-propyl-1,4-dihydronicotinamide (ClPCH) in equilibrium with PHTN but most certainly from a C6 phosphorylated intermediate by oxidation at C4 and loss of phosphate. When PHTN an ClPCH were oxidated by the system O2/TMPD in the presence of pyridinium phosphate or tetra-n-butylammonium phosphate in pyridineas solvent, formation of pyrophosphate occurred. Pyrophosphate was isolated and identified by paper and ionic exchange resin chromatography. If tetra-n-butylammonium ADP is also present in the system, one can observe the formation of both pyrophosphate and ATP (5% and 3% minimum yields, respectively). In the presence of tetra-n-butylammonium AMP there, formation of pyrofosphate, ADP and ATP occurs. The total yield of energy rich bond is 28%. We suggest that the reaction is a model for the generation of the first ATP in the respiratory chain.