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Molecular Profiling in Pediatric Oncology – the MOSCATO-01 Experience // Characterization of SMARCB1-Altered Soft Tissue Sarcomas in Response to Pharmacological HDAC Inhibition / Profilage moléculaire en oncologie pédiatrique – expérience de l'essai MOSCATO-01 // Caractérisation des sarcomes des tissus mous présentant des altérations de SMARCB1 traités par des inhibiteurs des HDAC

Harttrampf, Anne Catherine 10 December 2018 (has links)
1ère partie: Bien que les patients pédiatriques présentent généralement des taux de survie élevés, environ 20% d’entre eux ne peuvent être guéris avec des approches thérapeutiques standards, principalement ceux souffrant de sarcomes métastatiques, neuroblastomes, tumeurs cérébrales et tumeurs rares. Afin d’établir de nouvelles modalités thérapeutiques en identifiant des facteurs moléculaires qui puissent être ciblés par des approches pharmacologiques, les essais cliniques MOSCATO-01 (Molecular Screening for Cancer Treatment Optimization, NCT01566019) et MAPPYACTS (NCT02613962) ont été respectivement initiés en 2011 et en 2016. Une caractérisation moléculaire systématique des biopsies tumorales de patients avec des tumeurs réfractaires ou en rechute a été réalisée afin de pouvoir proposer des traitements ciblés. Chez 75 patients pédiatriques inclus dans MOSCATO-01 avec des cancers solides comprenant des tumeurs cérébrales, nous avons mis en oeuvre des approches d’hybridation génomique comparée (CGH), de séquençage d’un panel de mutations présélectionnées et de séquençage des exomes et transcrits. Des altérations génomiques pouvant être ciblées ont été identifiées dans 60% des cas, incluant des variations du nombre de copies (42%), des mutations (33%), et des transcrits de fusion (2%). Ces altérations affectent des voies de signalisation oncogéniques majeures, incluant des récepteurs tyrosine kinases et leurs cibles. Des mutations germinales ont été identifiées chez 10% des patients. Quatorze patients ont reçu 17 traitements ciblés; une réponse objective ou une maladie sans progression a été observée chez 5 patients. Nos résultats montrent qu’une approche de médecine de précision peut être envisagée et que des altérations ciblables sont présentes dans les cancers pédiatriques. Les obstacles à franchir concernent l’identification et la sélection des cibles, et la mise en pratique clinique des approches thérapeutiques.2ème partie: Les sarcomes épithélioïdes, des tumeurs très rares, affectent tous les groupes d’âge, dont les adolescents, et présentent à la fois des caractères épithéliaux et mésenchymateux. Comme les tumeurs rhabdoïdes affectant les jeunes enfants, les sarcomes épithélioïdes sont caractérisés par des altérations de SMARCB1, un membre central du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF. Le phénotype agressif et l’implication fréquente des RTKs dans ces deux tumeurs ainsi que leur similarité (épi-)génétique nous ont conduit à approfondir les relations fonctionnelles entre la régulation des RTKs, la signalisation cellulaire, et les effets de la modulation épigénétique. Des lignées cellulaires de chacun des types de tumeurs ont été étudiées pour déterminer la réponse à l’inhibition pharmacologique des RTKs et des HDAC, ainsi que mTOR et EZH2. La sensibilité la plus grande in vitro a été observée avec le Panobinostat, un inhibiteur de HDAC. Le Panobinostat induit la mort cellulaire et inverse partiellement la transition épithéliale-mésenchymateuse, qui pourrait être corrélée à une régulation différentielle des RTKs EGFR et FGFR2. Comme souvent observé dans le traitement des tumeurs solides par les seuls inhibiteurs de HDAC, le Panobinostat est associé à une inhibition modérée de la croissance tumorale in vivo dans un modèle de sarcome épithélioïde. La combinaison de l’inhibition des HDAC et de l’EGFR augmente la sensibilité vis-à-vis de cette dernière à la fois dans les sarcomes épithélioïdes et les tumeurs rhabdoïdes et représente une stratégie prometteuse pour le traitement des tumeurs solides. / Part 1: Although pediatric cancer patients have high survival rates, 20% cannot be cured with standard therapeutic regimens, predominantly those with metastatic sarcomas, neuroblastomas, malignant brain tumors and rare tumor types. To provide a new rationale for treatment definition by identifying new molecular targets that can be pharmacologically addressed, the Molecular Screening for Cancer Treatment Optimization (MOSCATO-01/NCT01566019) and the MAPPYACTS (NCT02613962) trials are running at Gustave Roussy since 2011 and 2016, respectively. Patients with relapsed or refractory malignancies are undergoing biopsy or surgical intervention at treatment failure for molecular characterization that allows the suggestion of a targeted treatment. In 75 pediatric patients with solid malignancies including brain tumors included in MOSCATO-01, we developed further the initial CGHarray and targeted gene sequencing panel, to whole-exome and RNA sequencing which is currently employed in the international follow-up trial MAPPYACTS. Actionable genomic alterations were identified in 60%, representing a copy number change in 42%, a mutation in 33% and a fusion transcript in 2%. Pathway allocation showed that these targets mainly affected prominent oncogenic signaling pathways including receptor tyrosine kinases and associated downstream signaling. Germline alterations were identified in 10% of patients. Fourteen patients received 17 targeted treatment approaches; objective response or prolonged stable disease was seen in five patients. Our results showed that this approach is safe and feasible in minors and that actionable alterations are present. Significant challenges were encountered in pipeline workflows, target definition, interpretation and selection, and clinical implementation.Part 2: Epithelioid sarcoma is an exceedingly rare soft tissue sarcoma occuring in all age groups, including adolescents and displays both epithelial and mesenchymal features. As rhabdoid tumors, a deleterious entity affecting very young children, epithelioid sarcoma is characterized by alterations affecting core SWI/SNF chromatin remodeling complex member SMARCB1. The aggressive phenotype and frequent involvement of receptor tyrosine kinases in both epithelioid sarcoma and rhabdoid tumor as well as their (epi-)genetic parallels led us to take deeper insight into the relation between tyrosine kinase regulation, signaling and effects of epigenetic modulation. Cell lines of both tumor types were studied in order to determine response to pharmacological inhibition by receptor tyrosine kinase and HDAC inhibitors as well as by agents inhibiting mTOR and EZH2. Both tumor types displayed highest in-vitro sensitivity towards pan-HDAC inhibitor panobinostat. Panobinostat sufficiently induced cell death and partially reversed epithelial-to-mesenchymal transition which could be related to differential regulation of receptor tyrosine kinases EGFR and FGFR2. As often observed in treatment of solid tumors with single agent HDAC inhibitors, panobinostat led to slight tumor growth inhibition in an in-vivo epithelioid sarcoma model. The combination of HDAC and EGFR inhibition increased sensitivity towards the latter in both epithelioid sarcoma and rhabdoid tumor and might be a promising strategy to sufficiently translate HDAC inhibitors into clinics for solid tumors.
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Typage de la classe génotypique du gène PRDM9 à partir de données de séquençage de Nouvelle Génération

Ang Houle, Marie-Armande 07 1900 (has links)
Les positions des évènements de recombinaison s’agrègent ensemble, formant des hotspots déterminés en partie par la protéine à évolution rapide PRDM9. En particulier, ces positions de hotspots sont déterminées par le domaine de doigts de zinc (ZnF) de PRDM9 qui reconnait certains motifs d’ADN. Les allèles de PRDM9 contenant le ZnF de type k ont été préalablement associés avec une cohorte de patients affectés par la leucémie aigüe lymphoblastique. Les allèles de PRDM9 sont difficiles à identifier à partir de données de séquençage de nouvelle génération (NGS), en raison de leur nature répétitive. Dans ce projet, nous proposons une méthode permettant la caractérisation d’allèles de PRDM9 à partir de données de NGS, qui identifie le nombre d’allèles contenant un type spécifique de ZnF. Cette méthode est basée sur la corrélation entre les profils représentant le nombre de séquences nucléotidiques uniques à chaque ZnF retrouvés chez les lectures de NGS simulées sans erreur d’une paire d’allèles et chez les lectures d’un échantillon. La validité des prédictions obtenues par notre méthode est confirmée grâce à analyse basée sur les simulations. Nous confirmons également que la méthode peut correctement identifier le génotype d’allèles de PRDM9 qui n’ont pas encore été identifiés. Nous conduisons une analyse préliminaire identifiant le génotype des allèles de PRDM9 contenant un certain type de ZnF dans une cohorte de patients atteints de glioblastomes multiforme pédiatrique, un cancer du cerveau caractérisé par les mutations récurrentes dans le gène codant pour l’histone H3, la cible de l’activité épigénétique de PRDM9. Cette méthode ouvre la possibilité d’identifier des associations entre certains allèles de PRDM9 et d’autres types de cancers pédiatriques, via l’utilisation de bases de données de NGS de cellules tumorales. / The positions of recombination events cluster tightly together in recombination hotspots, which are determined in part by the rapidly evolving protein PRDM9 via its tri- methyltransferase activity. The locations of hotspots are determined by the repetitive ZnF array of PRDM9, which binds to DNA. Alleles of PRDM9 containing the k-ZnF have previously been associated with patients affected with childhood acute lymphoblastic leukaemia. PRDM9 alleles are notoriously difficult to type due to the repetitive nature of the ZnF arrays. Here, we propose a method to characterize the alleles of PRDM9 from next- generation sequencing samples, by identifying the number of alleles containing a specific ZnF type. Our method is based on the correlation between profiles from the sample, representing the counts of nucleotide sequences unique to each ZnF, and from ideal sets of short reads representing an allele pair. We conduct a simulation analysis to examine the validity of the predictions obtained by our method with all pairs of known alleles. We confirm that the method can accurately genotype previously unobserved PRDM9 alleles. We also conducted a preliminary analysis to identify the PRDM9 k-ZnF genotype in a cohort of paediatric glioblastoma (pGBM), a childhood cancer characterized by the recurrent mutations in the coding sequence of the histone H3, the target of the enzymatic activity of PRDM9. Although no associations of k-ZnF containing PRDM9 alleles is found in our pGBM cohort, this method opens the possibility of identifying associations between certain PRDM9 alleles with other types of early onset childhood cancers, through a data-mining effort in public cancer databases.
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EVALUATION DE L’INHIBITION DE L’ANGIOGENESE DANS LE NEUROBLASTOME ET CARACTERISATION DE MECANISMES DE RESISTANCE / EXPLORATION OF ANGIOGENESIS INHIBITION IN NEUROBLASTOMA AND CHARACTERIZATION OF ESCAPE MECHANISMS

Daudigeos -Dubus, Estelle 16 December 2014 (has links)
Adulte ou pédiatrique, les tumeurs solides ont besoin d’oxygène et de nutriments pour se développer et métastaser. Leur apport est assuré par la néo-vascularisation tumorale issue d’un processus multifactoriel appelé l’angiogénèse. Son équilibre est maintenu par une balance entre facteurs pro- et anti-angiogéniques. Elle fait partie des principales cibles pour traiter les cancers et l’inhibition de la voie VEGF en est un facteur clé. Cependant, la réponse aux agents anti-angiogéniques a montré, malgré des résultats encourageants, un effet transitoire associé à l’apparition d’une résistance adaptative de la tumeur.Nous avons étudié l’inhibition de l’angiogénèse et les mécanismes potentiels d’échappement dans les tumeurs pédiatriques solides, et principalement dans le neuroblastome. Le neuroblastome est une tumeur originaire de la crête neurale et atteint généralement l’enfant jeune. Nous avons exploré l’effet anti-tumoral de l’inhibition sélective des récepteurs 1, 2, 3 du VEGF à l’aide de l’inhibiteur à tyrosine kinase axitinib dans divers modèles précliniques de neuroblastome. L’axitinib a montré une activité anti-tumorale modérée associée à une inhibition de la vascularisation. Néanmoins, après un traitement prolongé in vitro, les cellules tumorales IGR-N91-Luc deviennent résistantes à l’axitinib. Elles prolifèrent normalement mais secrètent de «l’ hepatocyte growth factor» (HGF) et activent la voie MAPK. In vivo, le traitement prolongé par axitinib entraîne le développement d’un phénotype plus agressif de la tumeur avec l’augmentation du nombre d’animaux présentant des métastases, associée à une activation de la voie SRC. Ceci nous a conduit à explorer l’effet d’une inhibition ciblant principalement VEGFR2 et MET (récepteur à l’HGF) avec le cabozantinib. Ainsi nous avons contrôlé le développement tumoral en inhibant la néo-vascularisation et l’activation de SRC, et induit la mort cellulaire dans le modèle orthotopique IGR-N91-Luc et inhibé le développement métastatique dans le modèle systémique IMR-32-Luc. Par ailleurs, nous avons étendu notre exploration à d’autres facteurs jouant un rôle dans l’angiogénèse comme FGFR ou PDGFR car ils représentent, comme MET, de puissants oncogènes. Pour cibler simultanément VEGFR et PDGFR, nous avons utilisé l’inhibiteur multi-kinase regorafenib. In vivo, à des doses bien tolérées qui permettent un traitement prolongé, le regorafenib a montré une activité anti-tumorale significative. Cet effet a été associé principalement à une forte inhibition de la vascularisation mais également à l’induction de la mort cellulaire. En élargissant notre étude à d’autres modèles de tumeurs pédiatriques, nous avons observé que son activité est indépendante du type histologique. Compte tenu du caractère oncogénique de PDGFR, nous avons évalué cet inhibiteur dans des modèles présentant une amplification du gène PDGFRA, qui entraine une surexpression et une activation forte du récepteur. Combiné avec des thérapies standards capables d’induire des dommages à l’ADN telles que l’irradiation ou l’irinotecan, l’effet du regorafenib a été potentialisé, notamment dans les modèles amplifiés pour le gène PDGFRA se traduisant par des régressions tumorales. Ces évaluations précliniques soutiennent le développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour les enfants atteints de tumeurs solides. / Solid tumors either adult or pediatric need oxygen and nutrients to grow and metastasize. Their input is provided by tumor neovascularization after a multifactorial process called angiogenesis. Balance is maintained by equilibrium between pro and anti-angiogenic factors. It is one of the main targets for treating cancers and the inhibition of the VEGF pathway is a key factor. However, despite encouraging results, the response to anti-angiogenic agents showed a transient effect associated with the development of an adaptive tumor resistance. We studied the inhibition of angiogenesis and potential escape mechanisms in solid pediatric tumors, mainly in neuroblastoma. Neuroblastoma is a solid tumor derived from the neural crest and it usually affects childhood. We investigated the anti-tumor effect of selective inhibition of VEGF receptors 1, 2, 3 using the tyrosine kinase inhibitor axitinib in various preclinical neuroblastoma l models. Axitinib showed a moderate anti-tumor activity associated with the inhibition of vascularization. However, after prolonged treatment in vitro, tumor cells IGR-N91-Luc become resistant to axitinib. They proliferate normally but secrete the "hepatocyte growth factor" (HGF) and activate the MAPK pathway. In vivo, prolonged treatment by axitinib results in the development of a more aggressive tumor phenotype with an increase in the number of animals exhibiting metastases associated with an activation of SRC signaling. This led us to explore the effect of inhibiting concomitant VEGFR2 and MET (HGF receptor), main cabozantinib targets. So we stabilized tumor growth by inhibiting the neovascularization and activation of SRC, induced cell death in the orthotopic model IGR-N91-Luc and inhibited metastatic development in the IMR-32-Luc systemic model. In addition, we extended our exploration of other factors that play a role in angiogenesis like FGFR or PDGFR because they represent, like MET, powerful oncogenes. To simultaneously target VEGFR and PDGFR, we used the multi-kinase inhibitor regorafenib. In vivo, at well-tolerated doses that allow prolonged treatment, regorafenib showed significant anti-tumor activity. This effect was mainly associated with a strong inhibition of vascularization, but also (with) induction of cell death. By expanding our study to other models of pediatric tumors, we observed that its activity was independent of histologic type. Given the oncogenic character of PDGFR, we evaluated the inhibitor in models which present a PDGFRA gene amplification, which results in a strong activation of the receptor. Combined with standard therapies that can induce DNA damages such as irinotecan or radiation, the effect of regorafenib was potentiated, mainly in PDGFRA gene amplified models, where tumor regressions were obtained. These preclinical evaluations support the development of a new therapeutic strategy for children with solid tumors.

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