Essa tese teve como objetivo avaliar todos os casos de candidose sistêmica por Candida albicans identificadas através de kit comercial ID 32C® (bioMérieux), diagnosticados no Laboratório de Micologia da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre/RS, durante o período de 1999 a 2009, buscando identificar a prevalência de C. dubliniensis, bem como avaliar os fatores de virulência e diferença de perfil de suscetibilidade antifúngica entre os isolados clínicos. Foi realizado um levantamento clínico-epidemiológico dos casos incluídos no estudo, avaliando sexo, idade, manifestações clínicas, evolução, região proveniente do paciente, doença de base, condições predisponentes, utilização de corticóides e antibióticos e resposta ao tratamento recebido. Para a diferenciação das duas espécies utilizou-se testes fenotípicos (arranjo dos clamidosporos, teste de termotolerância, formação do tubo germinativo, crescimento em meio hipertônico e niger), molecular (espectrometria de massa) e genotípico (reação em cadeia da polimerase - PCR). Em adição, foi avaliada a eficácia do método de conservação das leveduras estocadas a -20ºC e comparamos quatro substratos (soro fresco, soro congelado, ágar e caldo Mueller-Hinton) para a prova do tubo germinativo. Determinou-se a produção da fosfolipase e proteinase em isolados incluídos no estudo. A atividade in vitro dos antifúngicos fluconazol, anfotericina B e anidulafungina frente aos isolados estudados foi determinada através da concentração inibitória mínima (CIM), a concentração fungicida mínima (CFM) e ponto de corte epidemiológico (ECV). Os casos de candidemia por C. albicans diagnosticados durante 10 anos ocorreram com maior frequência em pacientes adultos com presença de cateteres. Observamos que houve maior chance de ocorrência desta em pacientes oncológicos. O percentual de alta nos pacientes foi baixo. O método utilizado para a conservação de leveduras nesse estudo apresentou taxa de 70% de viabilidade. O ágar e o caldo Mueller-Hinton demonstraram sensibilidade de 90% e especificidade de 100%. Os isolados de C. albicans provenientes de hemocultivos apresentaram produção de fosfolipase em 78% e proteinase em 97% dos isolados. A espécie C. dubliniensis não foi identificada em isolados de hemocultivos, sendo todos os casos de candidemia por C. albicans. Os testes microcultivo em ágar fubá, espectrometria de massa, caldo niger e caldo hipertônico concordaram com o teste genotípico. Os isolados de C. albicans apresentaram maior suscetibilidade a anidulafungina, entretanto, os menores valores obtidos em 90% dos isolados (CIM90) foi pela anfotericina B. E através do ECV, os isolados poderiam ser resistentes ao fluconazol, demonstrando a importância da associação desses dois parâmetros. / The aim this tesis was to evaluate systemic candidiasis cases by Candida albicans through ID 32C® (bioMérieux), at Mycology Laboratory of the Santa Casa de Porto Alegre/RS, during 1999 to 2009, seeking to identify the C. dubliniensis prevalence, as well as evaluating the virulence factors and antifungal susceptibility profile difference of among isolates. The clinical and epidemiological survey was made through gender, age, clinical manifestations, evolution, patient's region, underlying disease, predisposing conditions, steroids and antibiotics use, and response to treatment. The phenotypic tests (tthermotolerance, germ tube, hypertonic and Niger medium), molecular (mass spectrometry) and genotypic (polymerase chain reaction – PCR) was used for two species identification. We also assessed if the mantainance of C. albicans stored at - 20ºC in a freezer with sterile distilled water was usefull.The four substrate (fresh and frozen serum, agar and broth Mueller-Hinton®) were used for germ tube formation and the phospholipase and proteinase activity were evaluated. The in vitro activity of fluconazole, amphotericin B and anidulafungin were compared through the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum fungicidal concentration (MFC) and epidemiological cutoff value (ECV). The candidemia cases by C. albicans for ten years occurred more frequently in adult and catheters use. We observed the more chance this occurrence in cancer patients. The survival percentage was low. The used method in the study for yeast stored had 70% of viability. The agar and broth Mueller-Hinton were 90% sensitivity and 100% specificity. The boodstream isolates of C. albicans produce virulence factors, such the germ tube production and hydrolytic enzymes (78% of phospholipase and 97% of protease) production. The C. dubliniensis was not identified in bloodstream isolates, thus all candidemia cases were by C. albicans. The mass spectrometry, cornmeal agar, Niger and hypertonic broth agreed with genotypic test. The isolates exhibited more susceptibility to anidulafungin, and 90% of them (MIC90) exhibited the lowest values against amphotericin B. Based on ECV and Pfaller classification, isolates could be resistant to fluconazole, demonstrating the importance of the combination of these parameters.

Essa tese teve como objetivo avaliar todos os casos de candidose sistêmica por Candida albicans identificadas através de kit comercial ID 32C® (bioMérieux), diagnosticados no Laboratório de Micologia da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre/RS, durante o período de 1999 a 2009, buscando identificar a prevalência de C. dubliniensis, bem como avaliar os fatores de virulência e diferença de perfil de suscetibilidade antifúngica entre os isolados clínicos. Foi realizado um levantamento clínico-epidemiológico dos casos incluídos no estudo, avaliando sexo, idade, manifestações clínicas, evolução, região proveniente do paciente, doença de base, condições predisponentes, utilização de corticóides e antibióticos e resposta ao tratamento recebido. Para a diferenciação das duas espécies utilizou-se testes fenotípicos (arranjo dos clamidosporos, teste de termotolerância, formação do tubo germinativo, crescimento em meio hipertônico e niger), molecular (espectrometria de massa) e genotípico (reação em cadeia da polimerase - PCR). Em adição, foi avaliada a eficácia do método de conservação das leveduras estocadas a -20ºC e comparamos quatro substratos (soro fresco, soro congelado, ágar e caldo Mueller-Hinton) para a prova do tubo germinativo. Determinou-se a produção da fosfolipase e proteinase em isolados incluídos no estudo. A atividade in vitro dos antifúngicos fluconazol, anfotericina B e anidulafungina frente aos isolados estudados foi determinada através da concentração inibitória mínima (CIM), a concentração fungicida mínima (CFM) e ponto de corte epidemiológico (ECV). Os casos de candidemia por C. albicans diagnosticados durante 10 anos ocorreram com maior frequência em pacientes adultos com presença de cateteres. Observamos que houve maior chance de ocorrência desta em pacientes oncológicos. O percentual de alta nos pacientes foi baixo. O método utilizado para a conservação de leveduras nesse estudo apresentou taxa de 70% de viabilidade. O ágar e o caldo Mueller-Hinton demonstraram sensibilidade de 90% e especificidade de 100%. Os isolados de C. albicans provenientes de hemocultivos apresentaram produção de fosfolipase em 78% e proteinase em 97% dos isolados. A espécie C. dubliniensis não foi identificada em isolados de hemocultivos, sendo todos os casos de candidemia por C. albicans. Os testes microcultivo em ágar fubá, espectrometria de massa, caldo niger e caldo hipertônico concordaram com o teste genotípico. Os isolados de C. albicans apresentaram maior suscetibilidade a anidulafungina, entretanto, os menores valores obtidos em 90% dos isolados (CIM90) foi pela anfotericina B. E através do ECV, os isolados poderiam ser resistentes ao fluconazol, demonstrando a importância da associação desses dois parâmetros. / The aim this tesis was to evaluate systemic candidiasis cases by Candida albicans through ID 32C® (bioMérieux), at Mycology Laboratory of the Santa Casa de Porto Alegre/RS, during 1999 to 2009, seeking to identify the C. dubliniensis prevalence, as well as evaluating the virulence factors and antifungal susceptibility profile difference of among isolates. The clinical and epidemiological survey was made through gender, age, clinical manifestations, evolution, patient's region, underlying disease, predisposing conditions, steroids and antibiotics use, and response to treatment. The phenotypic tests (tthermotolerance, germ tube, hypertonic and Niger medium), molecular (mass spectrometry) and genotypic (polymerase chain reaction – PCR) was used for two species identification. We also assessed if the mantainance of C. albicans stored at - 20ºC in a freezer with sterile distilled water was usefull.The four substrate (fresh and frozen serum, agar and broth Mueller-Hinton®) were used for germ tube formation and the phospholipase and proteinase activity were evaluated. The in vitro activity of fluconazole, amphotericin B and anidulafungin were compared through the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum fungicidal concentration (MFC) and epidemiological cutoff value (ECV). The candidemia cases by C. albicans for ten years occurred more frequently in adult and catheters use. We observed the more chance this occurrence in cancer patients. The survival percentage was low. The used method in the study for yeast stored had 70% of viability. The agar and broth Mueller-Hinton were 90% sensitivity and 100% specificity. The boodstream isolates of C. albicans produce virulence factors, such the germ tube production and hydrolytic enzymes (78% of phospholipase and 97% of protease) production. The C. dubliniensis was not identified in bloodstream isolates, thus all candidemia cases were by C. albicans. The mass spectrometry, cornmeal agar, Niger and hypertonic broth agreed with genotypic test. The isolates exhibited more susceptibility to anidulafungin, and 90% of them (MIC90) exhibited the lowest values against amphotericin B. Based on ECV and Pfaller classification, isolates could be resistant to fluconazole, demonstrating the importance of the combination of these parameters.

Orientadores: Maria Luiza Moretti, Rogerio de Jeus Pedro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T04:29:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delgado_AnaCeciliaNastrini_D.pdf: 4216034 bytes, checksum: 9c8e2de690455b1af06e61e9e3ce2bd6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: OBJETIVOS: Avaliar a incidência de colonização oral por Candida spp. em pacientes com HIV em uso de terapia anti-retroviral, comparando os resultados dos grupos de pacientes colonizados e não colonizados, assim como estudar os aspectos microbiológicos das cepas isoladas. PACIENTES E MÉTODOS: Foi realizado estudo transversal de pacientes assistidos no HC/Unicamp, de agosto de 2003 a abril de 2004, com coleta única por paciente de swab da cavidade oral. CHROMagar Candida® e ID32C® foram utilizados no cultivo, isolamento e identificação de Candida spp. e Candida Check® na determinação dos sorotipos de C. albicans. C. dubliniensis foi identificada por seqüenciamento no aparelho ABI PRISM 3100® GENETIC ANALYZER. O perfil genômico foi estudado por PFGE, usando o sistema CHEF e a sensibilidade aos azólicos, 5-fluocitosina, anfotericina B e nistatina, baseada na microdiluição em caldo (CLSI). Por meio da revisão dos prontuários foi avaliado: gênero, idade, raça, ano de diagnóstico da infecção pelo HIV, tipo de exposição ao HIV, carga viral, contagem de linfócito TCD4+, infecções oportunistas, classificação clínica da infecção pelo HIV, terapia anti-retroviral e terapia antifúngica. RESULTADOS: Foram identificados 140/324 pacientes colonizados e 184/324 não colonizados: gênero masculino (63% e 60%), exposição sexual (81,5% e 80,5%) e idade média de 38,9 anos. A presença de colonização/infecção foi significativamente maior em pacientes com carga viral detectável (p=0,002) e CD4+<200/mm3 (p=0,006). Foi evidenciada incidência de candidíase oral (31,2%), tuberculose (20,9%), herpes zoster (16,3%), pneumonia por Pneumocystis carinii (PCP) (15,7%) e toxoplasmose (11,7%), no total de pacientes estudados. Não foi observada diferença significativa de colonização por Candida entre os pacientes em uso de TARV com ou sem IP. O uso prévio de nistatina foi maior no grupo colonizado (p=0,014). Foram isoladas 115/154 C. albicans sorotipo A, 15/154 C. albicans sorotipo B e 24/154 Candida não albicans. Doze pacientes apresentaram colonização mista. O estudo genômico de C. albicans sorotipo A identificou 15 perfis diferentes, com predomínio do A1 (56,5%), que mostrou similaridade de 100% entre o perfil de C. albicans sorotipo B predominante B1 (86,6%). O perfil genômico de C. glabrata mostrou-se heterogêneo. C. albicans sorotipo A e B mostraram-se sensíveis a todos os antifúngicos avaliados. C. glabrata e C. krusei apresentaram S-DD para os azólicos. CONCLUSÃO: O trabalho contribuiu de forma significativa para traçar o perfil epidemiológico/clínico dos pacientes HIV em uso de TARV e verificou que o uso de IP não influenciou na presença ou ausência de colonização oral por Candida / Abstract: OBJECTIVES: Evaluating de incidence of oral colonization by Candida spp. in patients in use of antiretroviral therapy, comparing the results of the groups of patients colonized and non-colonized, as well as study the microbiological aspects of the isolated strains. PATIENTS AND METHODS: It was made a cross sectional study assisted at HC/UNICAMP, from August, 2003 to April, 2004, with unique collect of the oral cavity by patient using a swab. CHROMagar Candida® and ID32C® were used in growth, isolation and identification of Candida spp. and Candida Check® for determination of C. albicans sorotypes. C. dubliniensis was identified by sequencing in ABI PRISM 3100® GENETIC ANALYZER device. The genomic profile was studied by PFGE, using the system CHEF and azoles, 5-FC, amphotericin B and nistatine sensibility, based broth microdilution (CLSI). It was evaluated through the review of the prontuaries: genre, age, race, year of HIV infection diagnosis, type of exposition, viral load, TCD4+ linfocyte counting, opportunistic infections, antiretroviral therapy and antifungal therapy. RESULTS: It was identified 140/324 colonized patients and 184/324 non-colonized patients: male gender (63% and 60%), sexual exposition (81,5% and 80,5%) and average age of 39,8 years old. The presence of colonization was significantly greater in patients with detectable viral load (p=0,002) e CD4+<200/mm3 (p=0,006). The incidence of oral candidiasis (31,2%), tuberculosis (20,9%), herpes zoster (16,3%), Pneumocystis carinii pneumonia (PCP) (15,7%) and toxoplasmosis (11,7%) was seen among the total of studied patients. It was not observed a significant difference regarding colonization by Candida among the patients in use of ARVT with or without usage of PI. The early usage of nistatine was bigger in the colonized group (p=0,014). It was isolated 115/154 C. albicans sorotype A, 15/154 C. albicans sorotype B and 24/154 non albicans Candida . Twelve patients presented mixed colonization. The genomic study of C. albicans sorotype A, identified 15 different profiles, with dominance of A1 (56,5%), which shown 100 % similarity between C. albicans sorotype B and predominant B1 (86,6%). The genomic profile of C. glabrata showed heterogeneous. C. albicans serotype A and B showed sensible to all evaluated antifugicals. C. glabrata e C. krusei showed S-DD to azoles. CONCLUSION: This work contributed significantly to trace an epidemiological/clinical profile of the HIV patients in usage of ARV therapy and the lack of influence of IP in the presence or absence of colonization of oral Candida / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Candida dubliniensis é uma espécie descrita como fenotipicamente semelhante a Candida albicans. Desde sua descrição, em 1995, em Dublin, Irlanda, por Sullivan et al, inúmeros relatos sobre esta levedura são encontrados com o objetivo de se conhecer a origem desta espécie, bem como distinguir as semelhanças e diferenças que existem entre elas. Alguns autores têm observado que esta levedura apresenta resistência a alguns antifúngicos, mais utilizados na prática médica, principalmente sob o ponto de vista imunológico, caso dos portadores de HIV. A gênese do processo de infecção se mostra pouco conhecida. A capacidade de adesão a superfície celular e a produção de exoenzimas são fatores determinantes para o desencadeamento da infecção. A susceptibilidade a toxinas Killer necessita ser estudada, pois permite determinar um significante número de tipos sensíveis de cepas de leveduras. Frente ao exposto, buscamos avaliar o comportamento desta espécie por meio da pesquisa de capacidade de adesão, produção de proteinase e fosfolipase, susceptibilidade a toxinas Killer e resistência a antifúngicos. O ensaio de adesão foi fortemente aderente para a amostra padrão ATCC 777, e aderente para os demais isolados. A atividade enzimática para produção de proteinase mostrou-se se fortemente positiva para a amostra padrão ATCC 777, amostra ATCC 778, CD 07 e CD 14 de C dubliniensis. Entre os isolados presuntivos de C dubliniensis 1 (038), positivo e nos demais 013, 058, 096 e 107, não se observou atividade enzimática. Para a produção de fosfolipase não houve um comportamento distinto entre as amostras de C dubliniensis e os isolados presuntivos. Nenhuma amostra deixou de produzir esta enzima. Os testes de sensibilidade das amostras frente às cepas padrão produtoras de toxinas Killer mostraram dois biótipos diferentes. Os mais freqüentes foram 888 e 688 do total dos 9 isolados estudados. O isolado biótipo 688 (ATCC- 777) de C dubliniensis foi sensível a toxina K2. As demais amostras de C dubliniensis, bem como os isolados presuntivos apesar de serem provenientes de indivíduos HIV+ foram resistentes a K2 e à todas as demais toxinas. Em relação à pesquisa de resistência a antifúngicos, as amostras e isolados presuntivos de C. dubliniensis utilizando se o E-test, foram sensíveis a família dos azóis com valores de CIM de 0.002 1.0 mg/ml e para Anfotericina B os valores de CMI estavam entre 0.002- 0.032. As condições desse estudo permitimo-nos comentar que excetuando a amostra padrão ATCC 777 que teve comportamento distinto em relação às demais amostras, identificadas por genotipagem, como C. dubliniensis e isolados presuntivos, todas apresentaram um comportamento semelhante entre si. Estudos com um maior número de amostras de C. dubliniensis e utilizando-se esses testes ainda são necessários para elucidar se realmente existe um comportamento fenotípico diferencial dessa levedura em relação a C. albicans. / Candida dubliniensis is a newly described specie which is closely related phylogenetically to Candida albicans. It was first identified as a new specie by Sullivan et al., in Dublin, Ireland, 1995.Numerous researches are attempting to identify more detailed characteristics of C. dubliniensis and similitudes and differences between the two related species.The resistence of C. dubliniensis to the usual drugs employed to treat candidosis, particularly in human immunodeficiency virus (HIV) infected individuals has been emphasizely described. The susceptibility to killer toxins may also contribute to explain some aspects of the resistence process in Candidal infection. Other characteristics such as adhesion capability and exoenzymes activity have been studied in comparision with this newer specie.The aim of this study was to evaluate adhesion capability, exoenzymes activity (proteinase and phospholipase), susceptibility to Killer toxins and sensibility to antifungal agents (azoles and amphotericin B) through E-test of 9 Candida dubliniensis isolates from HIV+ individuals.The adhesion test was strongly positive for the strain ATCC 777 and positive for the other strains. Proteinase activity was strongly posive for the strains ATCC 777, ATCC 778, CD 07, and CD 14, positive for the strain 038 and negative for the other. Phospholipase activity revealed strongly positive results for the strains ATCC 777, CD14, 038, 107. The strains ATCC 778, CD 07, 013, 058, and 096 had positive activity and activity was no absent. The Susceptibility to killer toxin showed to different biotypes: 888 and 688. Only the ATCC 777 strain was susceptible to K2 toxin. No strains presented resistance to azoles or amphotericin-B. The results showed MICs ranged between 0.002 1.0 mg/ml e 0.002- 0.032 respectively.