Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-01-03Bitstream added on 2014-06-13T21:06:00Z : No. of bitstreams: 1 furtado_ks_dr_botfm.pdf: 1065360 bytes, checksum: 96620ea9848aeb92bccef945922a61fc (MD5) / O café e a cafeína são dois potenciais agentes preventivos contra o desenvolvimento ou avanço dos processos de fibrose/cirrose e carcinogênese hepática em humanos, entretanto suas ações são controversas e muitas vezes inconclusivas. Devido a isto, o objetivo deste trabalho foi verificar a ação do café ou da cafeína isolada no fígado de ratos Wistar tratados com tioacetamida (TAA) ou tetracloreto de carbono (CCl4). Para tanto, os dados experimentais foram distribuídos em dois artigos. No primeiro artigo, foram avaliados os efeitos do café convencional, descafeinado e da cafeína isolada na hepatotoxicidade induzida pela TAA em ratos Wistar. Para tanto, 60 os animais foram divididos em 5 grupos experimentais: G1 (controle negativo), G2 (controle positivo tratado com TAA 200 mg/Kg i.p.), G3 (TAA + café convencional), G4 (TAA + café descafeinado) e G5 (TAA + cafeína a 0,1%). Ao final de 8 semanas de tratamento os ratos foram eutanasiados para coleta do sangue (análises séricas) e do fígado (análises histológicas, histoquímicas e moleculares). De maneira geral os animais tratados com café/cafeína (G3-G5) apresentaram níveis da enzima alanina aminotransferase (ALT), área ocupada por colágenos I e III e expressão da proteína TGF-β1 menores que o grupo controle positivo (G2). Adicionalmente, os grupos G3 e G5 apresentaram menor número de núcleos PCNA positivos em fase S do que o grupo G2. O grupo G3 também apresentou menor número de focos GST-P positivos que o grupo G2. Ademais, os grupos G4 e G5 apresentaram as maiores atividades de MMP-2 ativa. Em conclusão, tanto o café convencional como o descafeinado como a cafeína a 0,1% apresentaram efeitos benéficos, mostrando que os outros componentes do café, mesmo sem a cafeína, ou que somente a cafeína são capazes de reduzir a hepatotoxicidade no fígado de ratos Wistar tratados com TAA. No segundo artigo... / Consumption of coffee beverages reduces the incidence of liver disease. However, whether these beneficial effects on human health are due to caffeine or other specific components in the beverage remains controversial. There, the present study aimed to study evaluated the protective effects of coffee beverages or caffeine on liver toxicity induced by repeated administration of the hepatotoxicant thioacetamide (TAA) in male Wistar rats. Animals were randomized into five groups: untreated controls (G1) TAA only (G2, 200 mg/Kg b.w. twice a week for 8 weeks, i.p.), TAA+conventional coffee (G3), TAA+decaffeinated coffee (G4) and TAA+caffeine (G5, 0.1% in the drinking water). At the end of 8 weeks, the animals were euthanized and blood and liver samples were collected. Serum ALT levels were lower in animals that received coffee and caffeine (p < 0.001). In addition, liver oxidized glutathione (p < 0.05), fibrosis/inflammation score (p < 0.001) and TGF-β expression (p ≤ 0.001) was reduced in these groups when compared to TAA-only rats. Moreover, conventional coffee and caffeine reduced PCNA S-phase index (p < 0.001) but only conventional coffee reduced cleaved caspase-3 index (p < 0.001) and active metalloproteinase 2 (p ≤ 0.004) in the liver from TAA-treated animals. In conclusion, consumption of conventional and decaffeinated coffee and caffeine has beneficial effects against TAA-induced liver injury in Wistar rats

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-17Bitstream added on 2014-06-13T19:49:29Z : No. of bitstreams: 1 silva_jf_me_botib.pdf: 326535 bytes, checksum: fe0aa6d59a3acd2eb778f89a8d92390b (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O consumo de mate em altas temperaturas tem sido considerado um fator de risco para o desenvolvimento do carcinoma epidermóide de esôfago (CE) na América do Sul. Desta forma, os efeitos da ingestão de mate sobre danos de DNA e a carcinogênese de esôfago, induzidos pela dietilnitrosamina (DEN) e injúria térmica, foram avaliados em ratos Wistar machos. Na fase de iniciação, os animais foram iniciados com injeções i.p. da DEN (8 x 80 mg/Kg p.c.) e submetidos a injúria térmica (água a 65°C, lmIlrato, instilado no interior do esôfago) e receberam, concomitantemente, mate (2.0% p/v, grupo teste) ou chá-verde (2.0% p/v, grupo controle positivo) como única fonte de líquidos por oito semanas. Nenhum tratamento adicional foi introduzido durante a fase de pós-iniciação (nona a vigésima semana do experimento). Amostras de sangue periférico foram coletadas quatro horas após a última administração da DEN para o teste do cometa na oitava semana e amostras de esôfago e fígado foram coletadas na oitava e vigésima semanas do experimento. Na oitava semana, a ingestão de mate e chá-verde por si não foi genotóxica e reduziu de forma significativa os níveis de danos no DNA de leucócitos de sangue periférico nos animais tratados com a DEN. Além disso, uma redução significativa nos níveis de proliferação celular no epitélio do esôfago e no parênquima hepático e no número de lesões hepáticas pré-neoplásicas foram também observadas nos grupos iniciados e que receberam mate ou chá-verde. Na vigésima semana, uma menor incidência de neoplasias de esôfago e fígado foi observada nos grupos que receberam previamente mate e chá-verde quando comparado ao grupo iniciado pela DEN e submetido à injúria térmica. Os resultados do presente estudo indicam que a ingestão de mate se mostrou benéfica contra danos no DNA e a carcinogênese de esôfago e fígado induzidos pela DEN. / Drinking hot mate has been associated with risk for esophageal squamous cell carcinoma m South America. Thus, the modifying effects of mate tea intake on DNA damage and esophageal carcinogenesis induced by diethylnitrosamine (DEN) plus thermal injury were evaluated in male Wistar rats. In the initiation phase, rats were treated with DEN injections (8 x 80 mg/Kg b.w.) plus thermal injury (water 65°C, lml/rat, instilled into the esophagus) and concomitantly received mate tea (2.0% w/v, test group) or green tea (2.0% w/v, positive control group) as the sole source of drinking fluid for 8 weeks. Any additional treatment was introduced at post-initiation until week 20. Peripheral blood was collected 4 hr after the last DEN application for comet assay at week 8 and samples from esophagus and liver were collected at weeks 8 and 20. At week 8, mate or green tea intake itselfwere non-genotoxic and significantly decreased DNA damage levels in peripheral blood leucocytes from DEN-treated animaIs. Also, a significant reduction of cell proliferation rates in both esophageal epithelium and liver parenchyma and on the number of putative preneoplastic liver lesions were observed in initiated and mate or green tea-treated animaIs at week 8. A significant lower incidence of esophageal and liver neoplasms and tumor multiplicity was observed in the groups previously treated with mate or green tea when compared to the DEN initiated/thermal injury group at week 20. These data indicate that mate tea presented protective effects against DNA damage and esophageal and liver carcinogenesis induced by DEN.

Bei vielen Erkrankungen wie z.B. Herzhypertrophie, Diabetes und Entzündungen spielt die Raf-MEK-ERK-Signalkaskade eine wichtige Rolle. ERK1/2 ist in vielen zellulären Prozessen, u.a. Proliferation, Differenzierung, Wachstum, Hypertrophie und Apoptose involviert. Auch in der Tumorentstehung besitzt dieser MAPK-Signalweg eine signifikante Funktion, da er bei ca. 50% aller Krebsarten deutlich aktiviert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle einer neu entdeckten Phosphorylierungsstelle an Threonin188 an ERK2 bei der Entstehung und der möglichen Therapie von Tumoren zu erarbeiten. Dafür wurde ein Myc-ERK2309-357-Peptid verwendet, das 2013 in der Arbeitsgruppe Lorenz entwickelt wurde. Myc-ERK2309-357 zeigte in bisher unveröffentlichten Versuchen, dass es direkt an ERK2 bindet, eine Dimerisierung von ERK1/2 hemmen und eine vermehrte Lokalisation von ERK2 im Zellkern verhindern kann. Im Rahmen dieses Projekts konnten wir belegen, dass mit Hilfe des Myc-ERK2309-357-Peptids die Tumorzellproliferation von verschiedenen Krebszelllinien (Caco-2, SCC68, PC/1-1 und PC/13-1) um 60-80% vermindert werden konnte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Myc-ERK2309-357 keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 am TEY-Motiv besitzt. Die Aktivierung von ERK1/2 durch die Kinasen MEK1/2 wird somit nicht beeinflusst und die zytosolischen ERK-Funktionen, wie z.B. der anti-apoptotische Effekt, würden somit bestehen bleiben. Außerdem fanden wir heraus, dass Myc-ERK2309-357 im Vergleich zu den MEK-Inhibitoren U0126 und PD98059 und verglichen mit dem EGF-Rezeptor-Antikörper Cetuximab die Proliferation signifikant besser hemmt. / The Raf-MEK-ERK signaling cascade plays an important role in many diseases, such as cardiac hypertrophy, diabetes and inflammation. ERK1/2 is involved in many cellular processes, i.a. proliferation, differentiation, growth, hypertrophy and apoptosis. This MAPK signaling pathway also has a significant function in tumorigenesis because it is clearly activated in about 50% of all cancers. The aim of this work was to investigate the role of a newly discovered phosphorylation site on threonine188 in ERK2 in the genesis and possible therapy of tumors. For this, a Myc- ERK2309-357 peptide was used, which was developed in the research group Lorenz in 2013. It has previously been shown that Myc-ERK2309-357 binds directly to ERK2, inhibits ERK1/2 dimerization, and prevents increased localization of ERK2 in the nucleus. In this project we demonstrated that the Myc-ERK2309-357 peptide reduces the tumor cell proliferation of various cancer cell lines (Caco-2, SCC68, PC / 1-1 and PC / 13-1) by 60-80%. Furthermore, we could show that Myc-ERK2309-357 has no influence on the phosphorylation of ERK1/2 on the TEY motif. The activation of ERK1/2 by the kinases MEK1/2 is thus unaffected and the cytosolic ERK functions, e.g. the anti-apoptotic effect, would thus persist. In addition, we discovered that Myc-ERK2309-357 inhibits proliferation of the tumor cells significantly better compared to the MEK inhibitors U0126 and PD98059 and compared to the EGFR antibody Cetuximab.

Die vorliegende Arbeit untersuchte die Bedeutung von Mikrosatelliteninstabilitäten (MSI) als Ausdruck einer Defizienz des MMR Systems im Prostatakarzinom. Neben der Bestimmung der Prävalenz von MSI lag das Hauptaugenmerk auf der Analyse von Korrelationen zwischen dem Auftreten von Mikrosatelliteninstabilitäten in Prostatakarzinomen und klinisch prognostischen Parametern. Von den insgesamt 153 untersuchten Prostatakarzinomen konnte in 24 Fällen (15,7%) Mikrosatelliteninstabilität nachgewiesen werden. 9 davon (5,9%) waren mit zwei oder mehr nachgewiesenen Instabilitäten definitionsgemäß hochinstabil (MSI H). Diese Prävalenz hochinstabiler Prostatakarzinome ist im Vergleich zu anderen MSI Studien niedrig, steht aber im Einklang mit konzeptionell vergleichbaren und validen Studienergebnissen. Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem MSI Status und dem Alter der Patienten bei Diagnosestellung wurde beobachtet. Im untersuchten Patientenkollektiv traten hochinstabile Prostatakarzinome im Vergleich zu mikrosatellitenstabilen Karzinomen erst in einem deutlich höheren Lebensalter auf. Bezüglich der übrigen untersuchten Parameter zeigten die Analysen, dass hochinstabile Adenokarzinome der Prostata mit guter Differenzierung, niedrigeren Tumorstadien und fehlender Lymphknotenmetastasierung einhergehen. Den zweiten Schwerpunkt der Arbeit bildet die Detektion aberranter Expressionslevel der Spindelcheckpoint-Gene Bub1b und MAD2 und deren mögliche prognostische Bedeutung in Hinblick auf den klinischen Verlauf der Tumorerkrankung. Mittels quantitativer Expressionsanalysen wurden sowohl relative Über- als auch Unterexpressionen der Spindelcheckpoint-Gene Bub1b und MAD2 im Prostatakarzinom nachgewiesen. Im untersuchten Patientenkollektiv sind Überexpressionen dieser Gene vergleichsweise selten und scheinen somit für die Karzinomprogression keine bedeutende Rolle zu spielen. Hingegen weist eine Gruppe von Tumorproben insbesondere für Bub1b (19,1%), in geringerem Ausmaß auch für MAD2 (7,1%), vergleichsweise geringe Expressionslevel der untersuchten Spindelcheckpoint-Gene auf. Diese Prostatakarzinome mit reduzierten Expressionsleveln zeigen eine enge Assoziation mit verschiedenen biopathologischen Parametern. Prostatakarzinome mit reduzierter Bub1b Expression sind dabei in statistisch signifikantem Maße mit hohen Gleason-Scores, lokal fortgeschrittenen Tumorstadien und vermehrt lymphogener Metastasierung assoziiert. In Hinblick auf MAD2 sind mit der bislang untersuchten Patientenanzahl keine statistisch signifikanten Aussagen möglich. Jedoch fällt auch hier auf, dass untersuchte Prostatakarzinome mit reduzierter MAD2-Expression vergleichsweise schlecht differenzierte Karzinome in zum Großteil fortgeschritteneren Tumorstadien mit oftmals bereits nodaler Metastasierung sind. Die gezeigten Ergebnisse legen dem Spindelcheckpoint Gen Bub1b somit die Funktion eines Tumorsuppressors nahe. / The work at hand examined the significance of microsatellite instabilities (MSI) as an expression of a deficiency of the MMR-system in prostate carcinomas. Beside the determination of the prevalence of MSI the main focus was put on the analysis of correlations between the occurrence of microsatellite instabilities in prostate carcinomas and clinically prognostic parameters. From a total of 153 examined prostate carcinomas there were 24 cases (15.7%) in which instabilities of microsatellites could be proven. Nine of them (5.9%) had two or more detected instabilities and were consequently by definition highly instable (MSI-H). This prevalence of highly instable prostate carcinomas is low in comparison to other MSI-studies, it is, however, in accordance with conceptually comparable and valid study results. A statistically significant correlation between the MSI-status and the age of the patients at the time of the diagnosis was observed. Highly instable prostate carcinomas compared to microsatellite stable carcinomas occured only at a considerably higher age among the tested collective of patients. The analyses revealed in terms of the remaining tested parameters that highly instable prostate carcinomas are attended by well-differentiated carcinomas, lower tumour stages and absence of pathologic lymph nodes. The second focal point of this study depicts the detection of aberrant levels of expression of the spindle assembly checkpoint genes Bub1b and MAD2 and their possible prognostic relevance with regard to the clinical course of tumour disease. Via quantitative expression analyses both relative over- and underexpression of the spindle assembly checkpoint genes Bub1b and MAD2 in prostate carcinomas were verified. Within the examined collective overexpression of those genes occur comparatively rarely, thus they seem not to play a decisive role for the tumour progression. On the other hand, a group of tumour samples especially for Bub1b (19.1%), to a minor degree also for MAD2 (7.1%), features comparatively low expression levels of the examined spindle assembly checkpoint genes. Those prostate carcinomas with reduced expression levels display a close association with different various biopathologic parameters. At the same time prostate carcinomas with reduced Bub1b-expression are associated at a statistically significant rate with high Gleason-scores, locally advanced tumour stages and increased nodal metastasis. With the so far examined patient collective statistically significant conclusions with regard to MAD2 are impossible. Here, however, it is also striking that examined prostate carcinomas with reduced MAD2-expression are comparatively poorly differentiated carcinomas at in large part advanced tumour stages with often already nodal metastasis. The shown results suggest that the spindle assembly checkpoint gene Bub1b holds the function of a tumour suppressor.

Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system. / Extrazelluläre Signale werden über eine Serie von nacheinander geschalteten Proteinkinasen, den MAP-Kinasen (MAPK) weitergeleitet und multipliziert. Einer der MAPK-Signalwege, der RAS/RAF/MEK/ERK-Signaltransduktionsweg, leitet Signale von Tyrosinkinaserezeptoren weiter und spielt eine zentralle Role in der Regulation der Zellproliferation. RAF Kinasen (A-, B-, und CRAF) stehen am Anfang der Kaskade. Sie wandeln die signalbedingte strukturellen Änderungen der RAS-GTPase in ihre Kinaseaktivität um und phosphorylieren ihr direktes Substrat, MEK. Eine Störung in der Regulation der Kinaseaktivität des RAF-Proteins kann zur Tumorbildung führen, wie es bei vielen Krebsarten, vor allem Melanom und Schilddrüsenkarzinom (B-RAF), dokumentiert ist. A-RAF ist die bislang am wenigsten charakterisierte RAF-Kinase, möglicherweise aufgrund sihrer nidrigen intrinsischen Kinaseaktivität. Weiterhin weist die A-RAF defficiente Maus einen relativ milden hauptsächlich neuronalen Phänotyp auf, der sich unter anderem auch in einer Fehlfunktion des Cerebellums manifestiert. Dieser einzigartige Phänotyp weist darauf hin, dass eine Reihe zellulärer Prozesse spezifisch durch A-RAF und nicht durch aktiveren B- und C-RAF vermittellt wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle des A-RAF-Proteins im intrazellulären Membrantransport analysiert und eine spezifische A-RAF Funktion by endozytotischen Prozessen identifiziert. Diese Arbeit führte zur Entdeckung einer C-terminal verkürtzten Form von A-RAF, AR149, welche das Wachstum und die Polarisation von Hefezellen beeinträchtigt. In Säugetierzellen wirkt AR149 störend auf die Endozytose und die Aktinpolymerisation. Während des Entstehungsprozesses dieser Studie, wurden parallel zwei Spleißisoformen des A-RAF-Proteins, DARAF1 und 2, publiziert, die als natürliche Inhibitoren des RAS-RAF-MEK-ERK-Signalwegs in der myogenen Differenzierung agieren (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 beinhaltet die ersten 153 Aminosäuren des A-RAF Proteines und ist damit fast identisch mit AR149. Eigene Kolokalisierungund Koimmunopräzipitationsexperimente mit ARF6 weisen darauf hin, dass AR149 spezifisch in ARF6-positiven Recycling-Endosomen lokalisiert ist. Expression des AR149 Proteins bechindert das Recycling von endozytiertem Transferrin und die Aktin Polimerisation. Die endosomalen Kompartimente in denen internalisiertes Transferrin gefangen vor liegt, konntenals ARF6- und RAB11-positive endozytotische Vesikeln characterisiert werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine durch A-RAF Überexpression bzw. durch die Abwesenheit an A-RAF vermittelte Blokade des intrazellulären Transferrintransportes zwischen den tubulären- und Trans-Golgi-Netzwerk-assoziirten endosomalen Recycling-Kompartimenten schließen. Inhibierung der endogenen A-RAF-Expression durch siRNA oder Hemmung der MEK-Aktivität durch U0126 haben den selben Effekt wie AR149. Auf der Basis dieser Ergebnisse wird ein neues Modell für die Rolle der A-RAF regulierten ERK Signallwirkung auf Endosomen vorgestellt, bei dem das Zielprotein die ARF6 GTPase durch 3 AR149/DA-RAF2 negativ reguliert wird. Daruber hinaus deuten unsere Daten darauf hin, dass EFA6, ein GEF-Faktor von ARF6, als Kooperationspartner von A-RAF bei der ARF6-Aktivierung fungiert. Endocytose und das schnelle Recycling von synaptischen Vesikeln ist von besonderer Bedeutung für die Funktion von Neuronen. Aus dem Befund, dass A-RAF ein Regulator des endocytotischen Recyclings ist ergibt sich dacher eine neue Perspektieve für die Untersuchung der A-RAF Funktion im Nervensystem.

B-Zell-Lymphome des mukosaassoziierten lymphatischen Gewebes (MALT) entwickeln sich außerhalb des primären lymphatischen Gewebes und entstehen hauptsächlich im Magen aufgrund einer H. pylori-assoziierten chronischen Entzündung. Vorangegangene immunhisto-chemische und funktionelle Untersuchungen zeigten, daß die Tumorzellen phänotypisch Gedächtnis-B-Zellen entsprechen und Antigenrezeptoren auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. In der vorliegenden Arbeit konnten mit Hilfe von molekulargenetischen Antigenrezeptor-analysen die Tumorzellpopulationen identifiziert und charakterisiert werden. Dabei wurde deutlich, daß sowohl mono- als auch biklonale B-Zell-Lymphome existieren. Im Vergleich zu neueren veröffentlichten Daten von MALT-Typ Lymphomen aus der Speicheldrüse, konnte jedoch bei den hier untersuchten gastralen Tumoren keine VH-Gen-restriktion nachgewiesen werden. Die tumorspezifischen VH-Mutationsanalysen zeigten, daß es sich bei den Tumor-B-Zellen auch genotypisch um Gedächtnis-B-Zellen handelt, die jedoch offensichtlich unter-schiedlich lange dem Mechanismus der Keimzentrumsmaturation ausgesetzt worden waren. Zudem konnte bei mono- und biklonale Lymphomen, im Gegensatz zu Fällen mit poly-klonalem Entzündungsinfiltrat die Translokation t(11;18)(q21;q21) nachgewiesen werden. Ausgehend von der Tatsache, daß die Tumorprogression dieser B-Zell-Lymphome anfangs noch abhängig von dem lokal vorhandenen Mikromilieu zu sein scheint, wurden die tumorinfiltrierenden T-Zellen (TITL) genauer charakterisiert. Es wurden überwiegend CD4+ TITLs nachgewiesen, die sowohl aktiviert (C69+) als auch immunkompetent (CD28+) waren und die für T/B-Zell-Kooperationen essentiellen Moleküle wie CD40-Ligand und Fas-Ligand exprimierten. Zudem konnten im Tumorgewebe vor allem TH2/3-Typ Cytokine (IL10, IL13, TGFb1) nachgewiesen werden, die ebenfalls das Tumorwachstum in vitro positiv beeinflussen können. Um in Zukunft spezifischere Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen Tumor-B-Zellen und TITLs durchführen zu können, wurde abschließend ein Zellkultursystem ent-wickelt, mit dessen Hilfe es möglich sein wird das Tumormikromilieu in vitro spezifisch zu simulieren, um so das Verhalten der Tumor-B-Zellen auch ex vivo beobachten und analysieren zu können. Die Daten dieser Arbeit geben einen vertieften und verbesserten Einblick in die tumorspezifischen Mechanismen und ermöglichen den Entwurf eines neuen detaillierteren Mo-dells zur Tumorentstehung und -progression von niedrig-maligne MALT-Typ Lymphomen. / B-cell lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) arise in sites primarily devoid of lymphoid tissue, preferentially in the stomach preceded by a chronic inflammation associated with H. pylori infection. Previous studies suggested that the tumor cells are the malignant counterpart of memory B-cells and express functional antigen receptors on their cell surfaces with autoantigenic reactivity. In the present work the molecular structure of the tumor antigen receptor was described more detailed in several cases of gastric MALT-type lymphomas and compared with recently published data from normal B-cells and different tumor entities. These findings clearly showed the existence of mono- as well as biclonal B-cell lymphomas. However, in contrast to recent molecular data derived from salivary gland MALT-type lymphomas, no VH-gene restriction was found. The tumorspecific VH-gene analyses confirmed the memory B-cell phenotype of the tumor cells at the DNA level. Furthermore, it is likely that the tumor B-cells passed several rounds of maturation cycles in the germinal centres because of their mutation pattern in the hypervariable region of the antigen receptor. By comparing clonality of the tumors it became obvious that those lymphomas showing the t(11;18)(q21;q21) translocation were directed towards (mono-)clonality. Therefore this translocation appears to represent a major progression event in tumor establishment. Because at least low-grade MALT-type B-cell lymphoma growth is depended on the local microenvironment, the tumorinfiltrating T-lymphocytes (TITL) were investigated in detail. In the tumor tissue CD4+ TITLs were found predominantly which were activated (CD69+) as well as immuncompetent (CD28+) and express CD40-Ligand and Fas-Ligand, two molecules which play a keyrole in T/B-cell interactions in germinal centre reaction. In addition, TH2/3 cytokines (IL10, IL13, TGFb1) were detected in the tumor tissue. These cytokines were shown to stimulate the tumor growth in vitro. Therefore it will be mandatory to engage CD40-Ligand and FAS-Ligand simultaneously for further detailed investigations of early steps of tumor development. An in vitro system will offer the possibility to investigate and analyse the behaviour of tumor B-cells ex vivo and compare t(11;18) positive and negative cases and thus lead to a biological based model of tumor-development and -progression of low-grade MALT-type lymphomas.

B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben. / The largest group of extranodal lymphomas are B cell lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT)-type. They arise on the background of chronic inflammation, e.g. the Helicobacter pylori-associated gastritis in the stomach. The mechanism of MALT-type lymphomagenesis is still enigmatic. The finding of autoreactive malignant B cells which proliferate in response to antigen and T cell-mediated signals may suggest a failure of T cell control. For testing this hypothesis we examined both tumor-infiltrating T cells and malignant B cells of various MALT-type lymphomas. By expression analysis of the T cell receptor (TCR) Vb chain we showed clonal expansions of T cells due to antigenic stimulation. Furthermore we found similar antigen-binding regions (CDR3) in the TCR of tumor-infiltrating T cells in two different MALT-type lymphomas, that indicate potential antitumor-reactivity of the tumor-infiltrating T cells. Furthermore we established an in vitro T/B cell coculture assay for investigating the B cells and focused on the interaction of the pro-apoptotic molecule FasL on activated T cells with its corresponding death receptor Fas on malignant B cells. The malignant B cells from three out of seven MALT-type lymphomas and four out of five DLBL were resistant to FasL/Fas-mediated apoptosis. My results indicate that this is probably due to mutational inactivation of the Fas receptor. In Fas transcripts of malignant B cells from all cases investigated, 14 different point mutations leading to amino acid changes were found. Ten of these mutations were associated with resistance to apoptosis of malignant B cells. Additional investigations showed, that alternative mechanisms of resistance to apoptosis such as decreased expression of Fas, production of soluble Fas (sFas) or an impaired signalling cascade downstream of Fas were not operative. From the results we conclude the following: Resistance to FasL/Fas-mediated apoptosis is a mechanism of early MALT-type lymphomagenesis that could be due to certain Fas mutations. By this mechanism the B cells are able to escape T cell control while still receiving T cell help until they reach autonomous growth. The prolonged survival of the B cells might increase the risk of acquiring additional aberrations, such as the chromosomal translocation t(11;18)(q21;21) which is found in 50 per cent of all MALT-type lymphomas.

Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2008.

Regensburg, Univ., Diss., 2002. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2001