Depuis 20 ans, certains patients porteurs d’une carcinose péritonéale sont traités par une chirurgie de cytoréduction combinée avec une chimiohyperthermie intrapéritonéale (CHIP). Bien que l’oxaliplatine (OX) soit couramment utilisée lors de CHIP, une telle utilisation chez l’humain n’est supportée que par des études de phase II et il n’y a pas d’études précliniques caractérisant les propriétés de l’OX dans le contexte d’administration intrapéritonéale. L’objectif de ce projet de maîtrise est d’étudier l’effet de la température sur l’absorption tissulaire et systémique de l’OX administrée par voie intrapéritonéale chez le rat. Nous avons procédé à une perfusion intrapéritonéale de 3 différentes doses d’OX à 3 différentes températures pendant 25 minutes chez une total 35 rats Sprague-Dawley, puis effectué le dosage des concentrations d’OX dans différents compartiments. Nous avons observé une augmentation linéaire (p<0,05) entre la dose d’OX administrée et sa concentration dans tous les compartiments (péritoine, mésentère, sang portal et systémique). De plus, avec l’augmentation de la température de perfusion, nous avons observé une augmentation de la concentration d’OX dans le péritoine mais une diminution de sa concentration dans les compartiments systémique et portal (p<0,05). Ces résultats démontrent donc que la dose et l’hyperthermie augmentent indépendamment la pénétration tissulaire de l’OX et que l’hyperthermie limite son absorption systémique. Ces observations suggèrent que l’hyperthermie pourrait réduire la toxicité systémique de l’OX. Pour connaître la cinétique de l’OX, des études subséquentes doivent être faites. / Over the last twenty years, certain patients afflicted with peritoneal carcinomatosis have been treated with a combination of cytoreductive surgery and hyperthermic intraperitoneal chemoperfusion. Supported by phase II studies only, Oxaliplatin (OX) is commonly used in this context. However, pre-clinical studies to characterize its properties in such conditions are lacking. The purpose of this project is to study the effect of temperature on tissue and systemic absorption of OX when administered by intraperitoneal route in the rat. By intraperitoneal route, we administered 3 different doses of OX at 3 different temperatures for 25 minutes on 35 Sprague-Dawley rats. Samples from selected compartments were harvested and OX concentration was measured using high performance liquid chromatography. We obtained a linear correlation (p<0.05) between OX dose and tissue concentration in every compartments analyzed (peritoneum, mesentery, systemic and portal blood). With hyperthermia, we observed an increase in peritoneum and mesentery concentration of OX, but a decrease it its systemic and portal concentration (p<0.05). Intraperitoneal administration of OX leads to high concentration of drug in local tissues. Hyperthermia enhances tissue absorption and minimizes systemic absorption suggesting it could reduce systemic toxicity. Additional studies are needed to further define the pharmacokinetics of OX administered by intraperitoneal route.

Résumé:IntroductionLa chirurgie reste le seul traitement à visée curative pour les patients porteurs d’un cancer colorectal (CCR) primitif ou métastatique. L’établissement précis de l’extension de la maladie, au niveau de la tumeur primitive, des ganglions loco-régionaux et des métastases à distance représente un élément essentiel pour la prise en charge thérapeutique. Les ganglions locorégionaux et la technique du ganglion sentinellePour les patients présentant un CCR non métastatique, l’analyse pathologique des ganglions (pN) conditionne la décision d’administrer ou non une chimiothérapie adjuvante. Les patients présentant un envahissement ganglionnaire (pN+) recevront un traitement adjuvant, celui-ci n’étant le plus souvent pas indiqué chez les patients sans envahissement ganglionnaire (pN0). Près de 20 à 30% des patients classés pN0 vont cependant développer des récidives tumorales. Parmi ces patients, il est probable qu’une partie ait été sous-classée au moment du diagnostic. La technique du ganglion sentinelle (GS) permet d’identifier les ganglions les plus susceptibles d’être envahis et de réaliser des analyses anatomopathologiques plus approfondies sur un nombre plus limité d’échantillon. Cette technique est recommandée dans le cancer du sein et dans le mélanome, mais son rôle reste discuté dans le CCR. Le premier volet de cette thèse concerne les résultats d’études cliniques que nous avons menées pour évaluer le rôle de la technique du GS au bleu patenté (BP) et de l’imagerie en fluorescence (IF) au vert d’indocyanine ou indocyanine green (ICG) dans le staging ganglionnaire des patients présentant un CCR. Les principaux objectifs de ces travaux étaient d’évaluer la faisabilité de ces techniques et leur apport dans le staging des patients présentant un CCR.Notre première étude sur la technique du GS au BP, représentant la plus grande cohorte monocentrique européenne, a permis de démontrer la faisabilité de la technique. En outre, cette approche a modifié le geste chirurgical dans 12% des cas (technique in vivo) et a permis de reclasser 10% des patients initialement classés pN0 en pN+ par la réalisation de coupes sériées spécifiquement réalisées sur les ganglions démontrés comme GS. Dans une seconde étude sur la technique du GS comparant l’IF-ICG à la technique au BP, nous avons montré que ces 2 techniques étaient complémentaires, permettant d’augmenter la sensibilité globale pour la détection des métastases ganglionnaires. De plus, l’IF-ICG apparaît comme plus sensible chez les patients présentant une surcharge pondérale. En termes de sensibilité, la recherche du GS par IF est supérieure à la technique BP, ces résultats restant cependant limités, notamment en raison d’un taux élevé de faux négatifs (FN) pour les tumeurs localement avancées (pT3-4). Les métastases ganglionnaires et la carcinose péritonéaleDans le CCR, les patients métastatiques, présentant une carcinose péritonéale (CP) et/ou un envahissement ganglionnaire, ont un pronostic sombre. La chirurgie d’exérèse de la CP associée à une chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale (CHIP) et la réalisation de curages ganglionnaires chez les patients porteurs d’une maladie oligométastatique permettent toutefois d’obtenir des survies prolongées et parfois des guérisons, avec des résultats similaires à ceux observés chez les patients opérés pour métastases hépatiques isolées. Pour la CP, l’étendue de la maladie et la radicalité de la résection sont les principaux facteurs pronostiques de survie. La sensibilité des examens d’imagerie conventionnelle et métabolique reste cependant faible pour déterminer l’extension de la maladie péritonéale. L’évaluation de l’étendue de la CP et son exérèse sont donc essentiellement fondées sur la palpation et l’exploration visuelle réalisée durant l’intervention chirurgicale, représentant un facteur limitant pour la radicalité de la chirurgie. De façon similaire, chez les patients présentant une maladie métastatique ganglionnaire limitée, la détection peropératoire est souvent difficile, nécessitant la réalisation de curages étendus de principe, afin de s’assurer de l’exérèse des ganglions pathologiques.L’utilisation de l’IF après injection iv intra-opératoire d’ICG a été rapportée comme une technique permettant la détection de tissu tumoral tant visible que non visible (infraclinique), pouvant potentiellement aider le chirurgien et guider les gestes de résection. Aucune étude n’avait particulièrement analysé le rôle de l’IF-ICG dans la détection de CP et de métastases ganglionnaires de CCR. Le second volet de cette thèse concerne l’évaluation de l’apport de l’IF après injection iv d’ICG pour la détection de la CP et des métastases ganglionnaires dans le CCR. L’objectif primaire était de vérifier si les métastases péritonéales (MP) et ganglionnaires visibles par le chirurgien étaient effectivement détectées par l’IF-ICG peropératoire. En parallèle, nous avons évalué si l’IF-ICG permettait de détecter une maladie infraclinique, non détectée par le chirurgien dans les conditions habituelles. La première étude de cette seconde partie a permis de montrer que les MP étaient visualisées comme hyperfluorescentes à l’IF-ICG pour autant qu’elles ne soient pas d’origine mucineuse. De plus, l’IF-ICG a permis de détecter des MP non visualisées en lumière visible, permettant d’adapter le geste chirurgical et d’augmenter la radicalité de la résection dans près de 38% des cas. Dans une seconde étude, nous avons rapporté que la technique d’IF utilisée in vivo et ex vivo après injection iv d’ICG permettait d’identifier des ganglions métastatiques, détectés ou non par les imageries conventionnelles et métaboliques préopératoires. Les résultats de cette étude constituant une preuve de concept ont été ensuite confirmés dans une étude rétrospective réalisée sur l’analyse ex vivo des ganglions de patients ayant reçu une injection iv d’ICG. Dans ce travail, nous avons montré que les ganglions envahis étaient plus fluorescents que les ganglions non envahis. Toutefois, cette preuve de concept doit encore être confirmée et évaluée plus largement dans une étude prospective. Ces 2 travaux montrent donc le bénéfice potentiel de l’utilisation de l’IF après injection iv d’ICG à 2 niveaux, pour guider la chirurgie en améliorant la détection peropératoire des sites métastatiques infracliniques et pour guider l’analyse histologique, en identifiant des ganglions fluorescents sur la pièce de résection, permettant une étude anatomopathologique plus ciblée et plus approfondie. Conclusions et perspectivesNos travaux sur la recherche du GS dans le CCR par la technique au BP et à l’IF-ICG ont montré que ces techniques étaient faisables mais que leurs sensibilités restaient limitées, en particulier chez les patients porteurs de tumeurs localement avancées. Dans la CP d’origine colorectale, nous avons montré que l’IF-ICG permettait d’améliorer la stadification de la CP des patients opérés de métastases péritonéales non mucineuses, de révéler des lésions non visibles dans les conditions standards et d’améliorer la radicalité de la chirurgie. Pour la détection de ganglions métastatiques, nous avons montré que l’IF-ICG permettait, in vivo, de détecter des ganglions infracliniques durant l’intervention et ex vivo, de guider l’analyse anatomopathologique de la pièce de résection. Enfin, nous pensons que ces observations pourraient nous permettre d’élaborer un nouveau concept de GS systémique par opposition au GS classique correspondant aux ganglions de drainage anatomique de la tumeur. Nous proposons que les capacités particulières de rétention de l’ICG dans les tissus cancéreux après injection par voie systémique pourraient permettre d’identifier des sites ganglionnaires métastatiques en dehors des sites de drainage révélés par les injections de marqueurs au sein ou en périphérie de la tumeur elle-même. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons élaboré un nouveau protocole d’une étude clinique prospective dans laquelle la détection du GS systémique après injection iv d’ICG sera comparée aux résultats obtenus suite à l’injection péritumorale de BP. Les ganglions révélés par ces 2 techniques seront recherchés ex vivo sur la pièce de résection et analysés en anatomopathologie. Outre la démonstration de métastases ganglionnaires extra-anatomiques, nous pensons que cette approche systémique pourrait permettre de réduire le taux de FN observé suite à une injection péritumorale, notamment pour les tumeurs localement avancées, celles-ci pouvant perturber le drainage lymphatique selon les voies anatomiques. Summary:This thesis reports several clinical research works on the role of indocyanine green (ICG) fluorescence imaging (FI) for the detection of colorectal tumoral tissue. We first evaluate and compare the role of ICG-FI in the detection of sentinel lymph node (SLN) in colorectal cancer (CRC) in view to upstage patients. We have reported that both techniques (blue dye and ICG-FI) are similar in term of sensitivity with a high rate of false negative results. Therefore, we think that new approaches for SLN detection should be developped in CRC. Secondarily, we evaluate the role of ICG-FI after IV ICG injection for the detection of peritoneal carcinomatosis (PC) from CRC origin. We have reported that ICG-FI is able to detect non-mucinous PM with a sensitivity of 86%. Moreover, ICG-FI was able to guide surgery modifying the surgical procedure in 38% of patients. Thirdly, we investigate the role of ICG-FI for the detection lymph node (LN) metastases. We have reported that ICG-FI performed after IV ICG injection is able to detect LN metastases both in vivo and ex vivo. These findings have been confirmed in a retrospective study. Fiinally, we propose a new protocol to evaluate a new approach for SLN detection. In comparison with the standard technique using peritumoral injection, we propose a new approach using systemic (intravenous) ICG injection. We have called this approach the 'systemic' SLN detetion. This approach will be compared with the standard one using peritumoral blue dye injection. Sensitivity, specificity of both technique will be compared. In conclusion, the results of these preliminary clinical studies using ICG-FI for tumoral staging and treatment are encouraging and further larger studies should be performed. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans notre travail de thèse, nous nous sommes attachés à répondre à cette question : peut-t-on améliorer la résécabilité tumorale dans le métastases hépatiques et péritonéales du cancer colorectal? Pour cela nous nous sommes appuyés sur deux éléments : la fluorescence du vert d’indocyanine et sa détection par la caméra NIR. Dans un premier temps, après une mise au point en laboratoire, nous avons appliqué cette technique aux résections hépatiques. Nous avons montré que cette technique a un double intérêt : la détection des lésions tumorales et l’amélioration de la marge de résection oncologique. La question encore ouverte est le pourcentage de cellules cancéreuses ou précancéreuses présentent dans cette couronne fluorescente. Dans un deuxième temps nous avons appliqué cette technique dans la carcinose péritonéale. Il s’agit d’une première étude de faisabilité car nous n’avons retrouvé aucune publication sur ce sujet. Nous avons pu montrer des similitudes avec l’étude sur le foie. La fluorescence de l’ICG permet de détecter des tumeurs du péritoine difficilement visibles à l’œil nu grâce à l’intensité et à la qualité de la fluorescence même. Les perspectives sont centrées sur deux axes: l’agent fluorescent, le vert d’indocyanine, et les caméras NIR / In our work of PhD, we endeavored to answer this question: do we can improve tumor resectability in the liver and peritoneal metastases of colorectal cancer? For this, we relied on two elements: the fluorescence of indocyanine green and its detection by NIR camera. Initially, after formal laboratory development, we applied this technique to liver resections. We have shown that this technique has two advantages: the detection of tumor lesions and improving the margin of oncologic resection. The still open question is the percentage of cancerous or precancerous cells present in the fluorescent ring. Secondly, we applied this technique in peritoneal carcinomatosis. This is a first feasibility study because we did not find any publications on this topic. We could show similarities with the study on the liver. The fluorescence from ICG can detect tumors of the peritoneum hardly visible to the naked eye through the intensity and quality of the fluorescence. The outlook is focused on two areas: the fluorescent agent, indocyanine green, and NIR cameras

Carcinomatose péritonéale est un terme utilisé pour désigner la dissémination métastatique généralisée du cancer dans la cavité péritonéale. Il se caractérise par l’accumulation de liquide appelé « ascite » et est considéré comme étant au stade terminal du cancer, car il est difficile à traiter. L'ascite accumulée dans la PC comprend des cellules tumorales, cytokines et cellules immunitaires. Les cellules cancéreuses expriment des protéines spécifiques qui les aident à supprimer les cellules immunitaires et à survivre, appelées points de contrôle immunitaires. Des points de contrôle immunitaires sont présents pour réguler le système immunitaire et sont cruciaux contre la tolérance de soi. PD-1 / PD-L1 et CTLA-4 sont des voies de contrôle immunitaire bien établies adaptées au cancer pour échapper à l'immunité. Récemment, HLA-G a été reconnu comme un point de contrôle et il a été constaté que la survie globale était diminuée dans plusieurs types de cancers solides.Au cours de ma thèse, nous avons évalué l'expression de HLA-G dans la carcinomatose ovarienne. Nous avons constaté que les cellules cancéreuses dans l'ascite de presque tous les patients atteints de carcinomatose ovarienne exprimaient HLA-G. De plus, des taux croissants de sHLA-G1 et de HLA-G5 ont été trouvés dans les ascites. Cette présence de sHLA-G s'est révélée être corrélée positivement avec les Tregs et en corrélation négative avec les cellules T cytotoxiques (CD8) et les cellules NK. De plus, nous avons constaté que les ascites peuvent induire l’expression de HLA-G dans des «Hospicells» via des cytokines inflammatoires. Parmi les cytokines inflammatoires, le TGF-β et IL-1β ont une importance capitale dans l’induction de HLA-G. En outre, nous avons constaté que IL-1β implique la voie NF-κB. Dans une cohorte distincte de carcinomatose péritonéale, composée de patients atteints de PC d'origine différente, nous avons constaté que le groupe de cellules cancéreuses dans l'ascite avait une expression génique hétérogène de PD-L1, CTLA-4 et HLA- G. En outre, nous avons constaté que tous les patients présentaient des taux solubles de HLA-G et PD-L1 dans leur ascite. Cependant, seulement 5 patients présentaient des taux de CTLA-4 solubles dans leur ascite. De plus, nous avons trouvé une très forte corrélation positive entre le niveau de gène de PD-L1 et de CTLA-4, alors qu'aucune corrélation n'a été trouvée pour HLA-G avec PD-11 et CTLA-4 suggérant que HLA-G agit indépendamment des deux points de contrôle immunitaires. En outre, nous avons évalué l'expression de ces points de contrôle immunitaires par des nodules de cancer présents sur la membrane péritonéale. Nous avons trouvé une faible expression de HLA-G et PD-L1, mais la moitié des échantillons étaient fortement positifs pour sHLA-G. Nous avons également constaté que le sHLA-G pouvait être absorbé par l'ascite par la couche mésothéliale. Cette sHLA-G absorbée peut fournir un environnement immunosuppresseur pour la fixation des grappes de cellules cancéreuses à la membrane péritonéale. In vitro, nous avons constaté que l'ascite peut exercer une action immunosuppressive et retarder la lyse des cellules cancéreuses par les cellules immunitaires.De plus, nous avons constaté que la différenciation des cellules cancéreuses se traduit par une augmentation des propriétés immunosuppressives par une expression accrue de HLA-G ou PD-L1. En outre, l'expression de HLA-G et PD-L1 dépend de la phase du cycle cellulaire. Les cellules cancéreuses, si elles sont bloquées dans les cellules mitotiques, expriment des niveaux élevés de HLA-G et de PD-L1, tandis qu'une expression plus faible a été observée en phase G1. Par conséquent, nous suggérons d’éviter l’utilisation d’inhibiteurs de la mitose car ils pourraient augmenter la suppression immunitaire du cancer. De plus, le Ki-67 étant directement lié à l'index mitotique, nous suggérons de développer une échelle de Ki-67 pour évaluer le profil d'immunosuppresseur des patients cancéreux. / Peritoneal carcinomatosis (PC) is a term used for widespread metastatic dissemination of cancer to the peritoneal cavity. It is characterized by the accumulation of fluid called “ascites” and is considered a terminal stage of cancer, as it is hard to treat. The overall survival rate for untreated patients is six-months. However, owing to modern techniques like HIPEC, the survival rate can be increased up to five years. The ascites accumulated in PC, consists of tumor cells, cytokines and immune cells. Cancer cells express specific proteins to suppress immune cells activity and their attack, known as immune checkpoints. PD-1/PD-L1 and CTLA-4 are well established immune checkpoint pathways adapted by cancer in evading immunity. Recently, HLA-G has been recognized as an immune checkpoint and has been found to decrease overall survival in several types of solid cancers. We evaluated the expression of HLA-G in ascites from ovarian carcinomatosis. We found that HLA-G is expressed by cancer cells in ascites from all of the patients(n=16) with ovarian carcinomatosis. Moreover, increased levels of sHLA-G1 and HLA-G5 were found in ascites. This presence of sHLA-G isoforms was found to be positively correlated with Tregs and negatively correlated with cytotoxic T-cells (CD8) and NK-cells suggesting the role of HLA-G in immune suppression. Further, we found that ascites can induce the expression of HLA-G in “Hospicells” via inflammatory cytokines. Among the inflammatory cytokines, TGF-β and IL-1β are of crucial importance in HLA-G induction with IL-1β being more potent compared to TGF-β. Further, we found that IL-1β induces HLA-G expression through NF-κB pathway.In a separate cohort of peritoneal carcinomatosis(n=27), consisting of patients with cancer from a different origin, we found that cancer cell cluster in ascites (n=23) had a heterogeneous gene expression of PD-L1, CTLA-4 and HLA-G. Further, we found that all of the patients presented soluble levels of HLA-G in their ascites. However, one patient was negative for soluble PD-L1 and only 5 patients presented soluble CTLA-4 levels in their ascites. This heterogeneity explains why some of the patients respond to immune therapy while others don’t. This also suggests the need for prescreening patients before immune therapy. Moreover, we found a very strong positive correlation (rs=0.793) between gene level of PD-L1 and CTLA-4, while no correlation was found for HLA-G with PD-L1 and CTLA-4 suggesting that HLA-G acts independently of both the immune checkpoints. Also, we evaluated the expression of these immune checkpoints by cells in peritoneal tissue (n=20). We found low expression of HLA-G and PD-L1, but the majority of the samples were found strongly positive for sHLA-G presence. This sHLA-G can provide an immune-suppressive environment for the attachment of the cancer cell clusters to the peritoneal membrane to form cancer nodule. Additionally, we developed an in-vitro cytotoxicity assay to show that the ascites can provide the immune-suppressive action by interfering with immune cell interaction and delaying the lysis of cancer cells by the immune cells.In parallel, we found that the differentiation of the cancer cells results in increased expression of immune checkpoints like HLA-G or PD-L1. This may render these cells more immune resistant and can protect against immune attack. However, in-vivo mice model is needed to study the oncogenic potential of these differentiated cells. Further, we report that the expression of HLA-G and PD-L1 is dependent on the cell cycle phase. The cancer cells, if blocked in mitotic phase express high levels of HLA-G and PD-L1, while lowest expression was observed in G1-phase. Therefore, we suggest avoiding the use of mitotic inhibitors as it may increase the immune suppression of cancer. Moreover, as Ki-67 is directly related to the mitotic index, we suggest developing a Ki-67 scale to evaluate the immune-suppressive profile of cancer patients.