La production cyclique d'adénosine monophosphate (AMPc) régule certains aspects de la fonction mitochondriale des cardiomyocytes de rongeurs, tels que la production d'ATP, la consommation d'oxygène, les importations de calcium et la transition de perméabilité mitochondriale (MPT), mais le contrôle de ce pool d'AMPc n'est pas bien connu. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'expression, la localisation et l'activité de plusieurs enzymes dégradant l'AMPc, les phosphodiestérases (PDEs), dans des mitochondries cardiaques isolées de rongeurs. L'expression de la PDE2 a été principalement détectée dans les mitochondries sous-sarcologiques, et l'activité de la PDE2 stimulée par le GMPc était plus importante que celle de la PDE3 et de la PDE4; leurs activités ont ensuite été confirmées dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés par analyse FRET en temps réel. De plus, l’inhibition pharmacologique ou la surexpression cardiaque spécifique de la respiration mitochondriale modulée par la PDE2, la perte de potentiel de la membrane mitochondriale, le MPT et l’importation de calcium. Ainsi, la dégradation de l'AMPc par les PDE représente un nouveau mécanisme de régulation de la fonction mitochondriale et devient une cible potentielle dans le traitement des maladies cardiovasculaires.En outre, l'amélioration récente du traitement anticancéreux entraîne une augmentation du nombre de patients survivants, mais un risque de cardiotoxicité à long terme. Ainsi, dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons identifié des molécules cardioprotectrices à partir de bibliothèques chimiques en développant un test de criblage à haut débit. Nous avons identifié 6 molécules à effets puissants et spécifiqies et les avons validés dans 3 modèles cellulaires. Nous avons étudié les mécanismes d'action de chaque molécule en utilisant l’extinction par siARN, l'analyse par western blot, l'imagerie par fluorescence et les analyses métaboliques en temps réel. Trois molécules pourraient entrer rapidement dans les études précliniques et cliniques en association avec des agents de radiothérapie ou des agents chimiothérapeutiques pour le développement thérapeutique, tandis que les trois autres molécules pourraient nécessiter une optimisation chimique supplémentaire. / Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) production regulates certain aspects of mitochondria function in rodent cardiomyocytes, such as ATP production, oxygen consumption, calcium imports and mitochondrial permeability transition (MPT), but how this cAMP pool is controlled is not well known. In the first part of this thesis, we investigated the expression, localization and activity of several cAMP-degrading enzymes, phosphodiesterases (PDEs), in isolated rodent cardiac mitochondria. PDE2 expression was mainly detected in subsarcolemmal mitochondria, and cGMP-stimulated PDE2 activity was largest than PDE3 and PDE4, their activities were further confirmed in neonatal rat cardiomyocytes by real time FRET analysis. Moreover, the pharmacological inhibition or the cardiac-specific overexpression of PDE2 modulated mitochondrial respiration, mitochondrial membrane potential loss, MPT and calcium import. Thus, cAMP degradation by PDEs represents a new regulatory mechanism of mitochondrial function, and becomes a potential target in cardiovascular diseases therapy.In addition, the recent improvement of anticancer treatment results in an increase in surviving patients, but with a risk of long-term cardiotoxicity. Thus, in the second part of this thesis, we identified cardioprotective molecules from chemical libraries by developing a high throughput screening assay. We identified 6 potent and specific hits and validated them in 3 cellular models. We investigated the mechanisms of actions of each molecule and their cellular impact by using siRNA silencing, western-blot analysis, fluorescent imagery and real-time metabolic analyses. Three molecules could enter rapidly in preclinical and clinical studies in combination with radiation or chemotherapeutic agents for therapeutic development, while other three molecules may require further chemical optimization.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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L'infarctus du myocarde (IDM) est consécutif à une occlusion coronaire provoquant une ischémie prolongée. La taille de l'infarctus est le déterminant majeur de la récupération du myocarde et de la survie du patient. La reperfusion coronaire la plus précoce (par thrombolyse ou angioplastie) est reconnue comme étant le seul traitement recommandé. Cependant, malgré les effets bénéfiques, la reperfusion s'accompagne d'effets délétères appelés « lésions de reperfusion ». Récemment, l'efficacité du postconditionnement ischémique (PostC) a été démontrée en clinique. Il permet, lorsqu'il est utilisé au cours de l'angioplastie primaire ou de sauvetage, de réduire significativement la taille de l'infarctus. L'application du protocole de PostC reste cependant limitée aux patients admis dans les centres d'angioplastie, ce qui exclut tous les patients thrombolysés. Afin d'améliorer la cardioprotection, il est nécessaire de déterminer la fenêtre thérapeutique temporelle optimale d'administration du PostC. De plus, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques nouvelles, adjuvants de la reperfusion, qui pourront être administrées dès que le diagnostic d'IDM est posé. L'objectif de notre travail a donc été d'étudier l'influence du délai d'application du PostC sur l'efficacité de cardioprotection dans un modèle murin d'ischémie-reperfusion et de rechercher des substances pharmacologiques cardioprotectrices. Nos travaux révèlent que l'efficacité du PostC est maintenue s'il est appliqué les 30 premières minutes après le début de la reperfusion. D'autre part, nous avons évalué le potentiel thérapeutique de peptides inhibiteurs ciblant l'apoptose responsable de la mort cellulaire au cours de l'ischémie-reperfusion. L'utilisation de peptides Tat-BH4 et Pip2b-BH4 pour le traitement des lésions d'ischémie-reperfusion myocardique a fait l'objet d'une étude preuve-de-concept in vivo. Les constructions peptidiques inhibant l'interaction FAS-DAXX, injectées en intraveineuse au moment de la reperfusion, induisent une diminution de 50% de la taille d'infarctus et de l'apoptose. Ils ont fait l'objet d'un dépôt de brevet car ils constituent des outils pharmacologiques à haut potentiel thérapeutique. / Myocardial infarction (MI) results from a coronary occlusion leading to severe ischemia. Infarct size is a major determinant of myocardial salvage and mortality. Prompt revascularization (either by thrombolysis or primary angioplasty) is recommended for AMI patients but leads to deleterious effects called "reperfusion injury". Recently, ischemic postconditioning (PostC) efficiency has been reported in patients. However, its application during primary angioplasty is limited to patients admitted in angioplasty centers thereby excluding thrombolysed patients. In order to improve cardioprotection, it is necessary to define the time window for optimal cardioprotection and to develop new pharmacological strategies for AMI patients. Our work, using an in vivo mouse model of ischemia-reperfusion, shows that PostC efficiency is maintained if applied the first 30 minutes after the onset of reperfusion. Furthermore, we evaluated the therapeutic potential of peptide inhibitors targeting apoptosis, which is responsible for cell death during ischemia-reperfusion. As a proof-of-concept study, the cardioprotective effects of Tat-BH4 and Pip2b-BH4 peptidic constructs have been revealed in vitro and in vivo. The peptidic constructs targeting FAS-DAXX interaction, injected intravenously as a single bolus at the time of reperfusion, reduced by 50% both infarct size and apoptosis. These pharmacological tools have been patented due to their high therapeutic potential.

Chaque année, l’arrêt cardiaque extra-hospitalier, plus communément appelé mort subite, est responsable de plus de 40 000 décès en France. Le plus souvent, cela constitue l’ultime complication d’un infarctus du myocarde ou d’autres maladies cardiovasculaires. Le développement des méthodes de réanimation cardio-pulmonaire (RCP), leur diffusion publique et l’amélioration de la prise en charge pré-hospitalière (« chaîne de survie ») ontpermis une forte augmentation du pourcentage de patients réanimés après un arrêt cardiaque depuis une trentaine d’années. Malheureusement, la reprise d’une activité circulatoire spontanée ne constitue que la première étape de cette prise en charge et la majorité des patients décèdent dans les jours suivants de défaillances multiviscérales regroupées sous le nom de « syndrome post-arrêt cardiaque » 2. Seule une minorité de patients peut i fine survivire et sortirt de l’hôpital après une bonne récupération neurologique. Depuis de nombreuses années, les chercheurs tentent donc de découvrir des stratégies cardioprotectrices et neuroprotectrices dont l’application permettrait d’améliorer le pronostic de ces patients. / Summary not transmitted

Les phénomènes d’ischémie-reperfusion sont rencontrés dans plusieurs situations physiopathologiques. Le seul traitement de l’ischémie repose sur une restauration précoce du flux sanguin. Paradoxalement, la reperfusion génère des lésions supplémentaires, appelées « lésions de reperfusion », dont la mitochondrie est un acteur majeur via l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial (mPTP). L’ouverture du mPTP est principalement modulée par la cyclophiline D (CypD), une protéine de la matrice mitochondriale, dont l’inhibition pharmacologique par la cyclosporine A (CsA) permet de limiter l’ouverture du pore. Cette inhibition, obtenue in vitro et in vivo, permet de réduire les lésions de reperfusion. Néanmoins, de récents essais cliniques n’ont pas permis de confirmer ce bénéfice dans le cadre de l’infarctus du myocarde, soulignant la nécessité de développer de nouveaux inhibiteurs du mPTP. Dans ce travail, nous avons étudié l’effet de nouveaux ligands de la CypD sur l’ouverture du mPTP. Ces petites molécules innovantes, de structure radicalement différente de la CsA inhibent l’ouverture du mPTP de mitochondries isolées et le dérivé le plus actif, le C31, permet une inhibition plus efficace du mPTP que la CsA. Le C31 inhibe également le mPTP au niveau cellulaire, dans des hépatocytes primaires et dans des cardiomyocytes isolés. In vivo, le C31 atteint les mitochondries hépatiques et protège le foie dans un modèle d’ischémie-reperfusion hépatique. Cependant, la stabilité métabolique du C31 ne lui permet pas d’atteindre le cœur. La poursuite du développement de ces inhibiteurs pourrait aboutir à de nouveaux candidats pour protéger les organes des lésions de reperfusion. / Ischemia-reperfusion can occur in various pathophysiological situations such as myocardial infarction or organ transplantation. The only available treatment of ischemia relies on a timely reperfusion which paradoxically causes additional damage, so-called « reperfusion injury ». Mitochondria play a central role in this phenomenon through the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) which extends cell death. mPTP opening is modulated by the matrix protein cyclophilin D (CypD). CypD inhibition by cyclosporin A (CsA), the most described CypD inhibitor, limits reperfusion injury in vivo. Nevertheless, recent clinical trials failed to recapitulate such protection in the context of myocardial infarction, emphasizing the urge to develop new mPTP inhibitors. Here, we investigated the effects of new CypD ligands on mPTP opening. We demonstrated that these small molecules unrelated to CsA are potent mPTP inhibitors and that the most active compound, C31, exhibited stronger mPTP-inhibiting properties as compared to CsA. C31 also inhibited mPTP opening in primary hepatocytes and isolated cardiomyocytes. In vivo, C31 reaches liver mitochondria and protects mitochondrial function in a hepatic ischemia-reperfusion model. Nevertheless, C31 metabolic stability hampers cardiac uptake of the compound. Further development of these new inhibitors might lead to interesting candidates to protect organs against ischemia-reperfusion injury.

Au cours de l’infarctus du myocarde, aussi bien l’ischémie que la reperfusion (I/R) entrainent des dégâts irréversibles au sein du myocarde. Parmi ces lésions cellulaires, la dérégulation de l’homéostasie calcique mène à la mort cellulaire. Afin d’augmenter la récupération suite à un épisode d’I/R, le « remote », pré- et post-conditionnement ont été montré comme cardioprotecteur. En particulier, certaines stratégies basées sur des molécules pharmacologiques modulant les canaux TRPV1 (Transient Receptor Vanilloid 1) ont été utilisées. Le but de cette étude est de comprendre le rôle de TRPV1 dans la cardioprotection. Nous avons récemment montré que TRPV1 est exprimé et est fonctionnel dans des cardiomyocytes adultes de souris. En revanche, afin d’utiliser des sondes génétiques, un modèle alternatif aux cardiomyocytes a été utilisé dans cette étude : la lignée cellulaire de cardiomyoblastes de rats.Grâce à des techniques de Western blot et d’imagerie confocale, nous avons d’abord montré que TRPV1 est exprimé dans les H9C2 et semble être localisé à la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Puis, nous avons démontré grâce à des techniques d’imagerie calcique dans le cytoplasme et le réticulum (Fura2-AM et ErGAP1 respectivement) que TRPV1 est un canal de fuite calcique fonctionnel RE. Comme la synthèse d’ATP et le métabolisme cellulaire sont dépendants des échanges de calcium (Ca2+) entre le RE et la mitochondrie, nous avons analysé le rôle de TRPV1 en mesurant le Ca2+ mitochondrial avec la sonde R-GECO. Nous avons montré que la modulation pharmacologique de TRPV1 augmente à la fois les contenus en Ca2+ cytoplasmique et mitochondrial d’au moins 20%. Enfin, nous avons effectué des séquences d’hypoxie-reoxygenation et nous avons évalué la mort cellulaire par cytométrie en flux. Nous avons montré que l’activation de TRPV1 a des effets hétérogènes sur la viabilité cellulaire alors que l’inhibition de TRPV1 augmente systématiquement la survie cellulaire, d’au moins 22%. Des évènements de Ca2+ précis et spatiotemporel du RE à la mitochondrie sont nécessaires pour initier ou réguler des multitudes de processus tels que la balance entre la mort cellulaire et la survie cellulaire. Dans cette étude, nous avons montré que TRPV1 pouvait être un de ces canaux impliqués dans cet échange de Ca2+ entre le RE et la mitochondrie et que les H9C2 sont un modèle viable pour évaluer le rôle de TRPV1 dans les flux calciques au cours de l’ischémie-reperfusion / During myocardial infarction, both I/R cause irreversible myocardial injuries. Among the cellular damages, calcium dysregulation occurs leading to cell death. To improve the recovery from I/R episodes, remote, pre- and post-conditioning are recognized to be cardioprotective. In particular, some strategies based on molecules acting on the TRPV1 channels have been used. The aim of our work is to better understand TRPV1 role in cardioprotection. We have recently demonstrated that TRPV1 is expressed and functional in adult mouse cardiomyocytes. In order to perform live imaging with genetic probes, an alternative model to cardiomyocytes was used in the present work: H9C2 cells. Thanks to Western blot and confocal microscopy, we first showed that TRPV1 is expressed in H9C2 and seems to be localized at endoplasmic reticular (ER) plasma membrane. Secondly, we demonstrated that TRPV1 is a functional ER Ca2+ leak channel via cytoplasmic and reticular Ca2+ imaging (respectively with Fura-2 and ErGAP1). As ATP synthesis and cell fate are dependent of Ca2+ exchanges between ER and mitochondria, we have analyzed the role of TRPV1 in the mitochondrial [Ca2+] using R-GECO probe. We observed that pharmacological TRPV1 modulation increases both cytosolic and mitochondrial Ca2+ contents by at least 20%. Finally, we performed hypoxia-reoxygenation sequences and we evaluated cell death by flow cytometry. We showed that TRPV1 activation has heterogeneous effects on cell viability, whereas TRPV1 inhibition always improves cell survival (at least by 22%). Precise and spatiotemporal Ca2+ release events from ER to mitochondria are required to initiate or to regulate many processes like the balance between cell death/cell survival. In the present study, we show that TRPV1 could be one of the channels involved in Ca2+ exchanges between ER and mitochondria, and that H9C2 is a valuable model to evaluate the role of TRPV1 in Ca2+ fluxes during I/R

Strategies to reduce infarct size in ischaemia-reperfusion (IR) syndromes such as acute myocardial infarction are of high clinical and scientific interest. Remote ischaemic preconditioning (rIPC) is one such strategy but its mechanisms remain incompletely understood. Multiple lines of evidence from animal studies suggest that the endogenous purine nucleoside adenosine is a key mediator of preconditioning pathways but no evidence exists as to adenosine’s role in the more complex physiology of humans. The work in this thesis aims to elucidate the role of endogenous adenosine in the physiological phenomenon of rIPC and to examine the role of exogenous adenosine in triggering preconditioning-like states. In a randomised, placebo controlled study using healthy volunteers and the human forearm model of ischaemia-reperfusion injury, I demonstrate that delivery of the adenosine receptor antagonist caffeine, prior to the initiation of a rIPC stimulus abrogates the protective effect of rIPC on IR. By then selectively infusing caffeine to achieve high local but low systemic concentrations, I also demonstrate that adenosine receptor activation is important in the ‘trigger’ phase of rIPC rather than in the ‘effector’ phase and that blockade of the trigger phase effectively inhibits the release of a circulating humoral protective factor. These studies provide evidence of the crucial role of adenosine receptor activation in human rIPC, demonstrating their sites of action and illuminating their potential mechanism of action. To study whether exogenously delivered adenosine can recapitulate preconditioning-like states, in initial studies in a large mammal model of acute myocardial infarction, I demonstrate that adenosine, given after the onset of ischaemia, but prior to reperfusion, significantly reduces myocardial infarct size. In a subsequent study, translating these findings to humans with coronary disease, I demonstrate that the delivery of adenosine in a range of concentrations is able to illicit the release of a circulating preconditioning factor which is transferrable across species and can reduce infarct size in a murine model of myocardial IR.