Orientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Fernando Batista da Costa / Banca: João Carlos Palazzo de Mello / Resumo: Tendo em vista o pequeno acervo de padrões de referência disponíveis para uso no controle de qualidade de fitoterápicos preparados a partir de espécies nativas brasileiras, este trabalho tem como objetivos preparar e caracterizar padrões de alta pureza de casearinas a partir de Casearia sylvestris, uma planta nativa da flora brasileira, que há muito tempo vem sendo usada pela população. A estratégia utilizada para o isolamento das casearinas consistiu no fracionamento do extrato etanólico das folhas por extração em fase sólida utilizando sílica e carvão ativo, cromatografia em coluna em fase normal, além de desenvolvimento de método em CLAE preparativo em fase reversa no modo isocrático e reciclante. Para as análises por CLAE preparativo no modo isocrático, inicialmente, alguns parâmetros como resolução, carga e volume de injeção foram otimizados em coluna analítica e posteriormente foi feita a transferência de escala para coluna preparativa utilizando fator de escalonamento de 21,2. A transferência foi adequada, resultando no isolamento de 10,5 mg da casearina J, 30,0 mg da casearina X e 3,0 mg da casearina Z. Em modo reciclante, foram isolados 60,0 mg da caseargrewiina F. As análises de pureza dessas substâncias foram feitas através de CLAE- DAD, calculando-se primeiramente a pureza de pico, que foi de 100% para as três casearinas analisadas e, posteriormente, a pureza cromatográfica, pelo método de normalização de área, sendo de 85,5, 97,2, e 98,6% para as casearinas J, X e caseargrewiina F, respectivamente. As análises por CLAE-DAD-EM foram importantes para confirmar o resultado de pureza de pico, assim como para obter os dados de massas dos contaminantes presentes nessas amostras. O grau de pureza por DSC não pôde ser obtido, devido à ausência do pico referente à fusão das casearinas, inferindo que as substâncias... (resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Taking into account the few library of reference standards available for the use in quality control of phytotherapic agents from Brazilian native species, the aim of this work was to prepare and characterize high purity standards of casearins from Casearia sylvestris, a native plant of the Brazilian flora that has been used traditionally by population for a long time as remedy. The strategy to isolate the casearins was to fraction at the ethanolic extract from leaves by solid phase extraction using silica and active charcoal, column chromatography (normal phase) and, additionally, the method development in preparative HPLC (reverse phase) using isocratic e recycling mode. For the analyses by preparative HPLC using isocratic mode, firstly of all some parameters like resolution, amount of sample and volume injection were optimized in analytical column and then the scale-up to preparative column was carried out using a scale factor of 21.2. The scale-up was appropriate, leading to the isolation of 10.5 mg of the casearin J, 30.0 mg of the casearin X and 3.0 mg of the casearin Z. In recycling mode, 60.0 mg of the caseargrewiin F were isolated. The purity analyses of these substances were carried out by HPLC-DAD, firstly measuring the peak purity, wich was 100.0% for the three analyzed casearins, and then, the chromatographic purity, by the area normalization method, wich was 85.5, 97.2 and 98.6% for the casearins J, X and caseargrewiin F, respectively. The HPLC-DAD-MS analyses were important to confirm the peak purity results as well as to obtain the mass data of contaminants wich are usually present in these samples. The measurement of the purity degree by DSC method was not possible due to the absence of fusion peak, thus it suggests an amorphous state for these substances. From the TG/DTG/DTA curves, it was possible to suggest the absence of volatile... ((Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo produzir ferramentas e informações úteis para a conservação e exploração racional de Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae), uma espécie que produz diterpenos clerodânicos de grande importância farmacológica (casearinas), e que é explorada por extrativismo. Tal objetivo foi alcançado através do desenvolvimento de marcadores microssatélites específicos para C. sylvestris e de um estudo da diversidade genética e química existente entre e dentro de populações do Estado de São Paulo. Tradicionalmente são reconhecidas duas variedades em C. sylvestris (var. sylvestris e var. lingua), o que é motivo de debate devido à existência de formas intermediárias. Este trabalho objetivou, adicionalmente, contribuir com argumentos genéticos para esta discussão. Foi construída uma biblioteca enriquecida em microssatélites, a partir da qual obtiveram-se e validaram-se dez pares de iniciadores (primers) microssatélites específicos para C. sylvestris. Estes pares de iniciadores foram utilizados para o estudo da estrutura genética de populações de C. sylvestris através da amostragem de 376 indivíduos em nove populações distribuídas em quatro ecossistemas (Floresta Ombrófila Densa, Floresta Estacional Semidecidual, Cerrado e ecótonos). As duas variedades foram amostradas de acordo com sua distribuição nestes ecossistemas. A genotipagem dos indivíduos para os locos amostrados foi realizada através de eletroforese em gel de acrilamida lido a 700 e 800 nm por um seqüenciador IR2-DNA Analyser (LI-COR). Os dados foram analisados através de abordagens frequentistas, bayesianas e baseadas na teoria de coalescência, utilizando-se diversos programas computacionais. Para o estudo da diversidade química, as mesmas populações foram amostradas, selecionando-se 12 indivíduos por população, totalizando 108 indivíduos. Adicionalmente, foram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work aimed obtaining tools and information for the conservation and rational exploitation of Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae), a tree species which produces casearins, pharmacologically important clerodane diterpenes. This goal was achieved through the development of a set of polymorphic microsatellite markers, and through the study of chemical and genetic diversity in populations of C. sylvestris from São Paulo State. Also, we aimed contributing for the debate on the existence of two varieties within this species (var. sylvestris e var. lingua). A genomic library was constructed and 10 primer pairs were obtained. Those primers were utilized for a population genetic structure analysis, in which 376 individuals from nine populations distributed on four different ecosystems (Evergreen Atlantic Forest, Semideciduous Atlantic Forest, Cerrado and ecotones) were sampled. The two varieties were sampled according to its distribution among these populations. Genotyping was performed at 700 and 800 nm by electrophoresis on an IR2-DNA Analyser (LI-COR). The data were analyzed through frequentist, Bayesian and coalescence-based approaches, through the use of several softwares. Chemical diversity was studied by sampling in the same populations (12 individuals per population, i.e. 108 individuals). Also, cuttings of these individuals were prepared, aiming to verify its' chemical compounds after a year of green-house cultivation. Cuttings' rooting was problematic and a methodology was developed. Only 46 cuttings survived. Casearins from these 154 individuals (108 + 46) were extracted and analyzed by HPLC. Genetic analysis results suggests a partial genome duplication, as more than two alleles for the same locus were observed in 8% of var. sylvestris individuals and in 70% of var. lingua individuals. Additional studies are necessary to verify the hypothesis of partial genome duplication... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Marcos Aparecido Gimenes / Coorientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Roseli B. Torres / Banca: Maria Imaculada Zucchi / Banca: Giancarlo C. X. Oliveira / Doutor