La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates. In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays. Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.

La localisation de l'ARNm est un mécanisme post-transcriptionnel régulant l'expression des gènes qui donne un contrôle précis sur la production spatiale et temporelle des protéines. Des milliers de transcrits dans un large éventail d'organismes ou de types cellulaires se sont avérés localisés dans un compartiment sous-cellulaire spécifique. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est l'un des organismes modèle les plus étudiés pour comprendre le processus de localisation de l'ARNm. Plus de trente ARNm sont activement transportés et localisés à l'extrémité du bourgeon de la levure bourgeonnante. Dans cet organisme, la localisation des transcrits à l'extrémité du bourgeon, tels que l'ARNm ASH1, dépend de la protéine de liaison à l'ARN She2, qui interagit directement avec les éléments de localisation dans ces ARNm durant leur transcription. She2 est une protéine liant l’ARN non-canonique, qui s’assemble en tétramère pour pouvoir lier l’ARN. Lorsque le complexe ARNm-She2 est exporté vers le cytoplasme, celui-ci interagit avec la protéine She3 et la myosine Myo4, qui transportent le complexe vers le bourgeon. Une fois qu'un ARNm est correctement localisé, sa traduction est activée pour permettre la synthèse locale de sa protéine. Les mécanismes régulant la localisation des ARNm sont encore très peu connus. Cependant, plusieurs évidences suggèrent que la machinerie de localisation peut être régulée par des modifications post-traductionnelles. Dans notre étude, en utilisant une colonne de purification de phosphoprotéines, nous avons constaté que She2 est une phosphoprotéine. Nous avons utilisé une approche de phosphoprotéomique pour identifier les résidus phosphorylés dans She2 in vivo. Nous avons identifié plusieurs nouveaux phosphosites qui affectent la capacité de She2 à favoriser l'accumulation asymétrique de la protéine Ash1. Fait intéressant, plusieurs phosphosites sont présents aux interfaces de dimérisation et de tétramérisation de She2. En nous concentrant sur la position T109, nous montrons qu'un mutant phosphomimétique T109D inhibe l'interaction She2-She2 et diminue l'interaction de She2 avec ses cofacteurs Srp1, She3 et l’ARNm ASH1. Fait intéressant, la mutation T109D réduit considérablement l'expression de She2 et perturbe la localisation de l'ARNm ASH1. Nos résultats montrent que le contrôle de l'oligomérisation de She2 par phosphorylation représente un mécanisme qui régule la localisation de l'ARNm dans la levure bourgeonnante. Dans le but d’identifier la ou les kinases impliquées dans la phosphorylation de She2, nous avons recherché des motifs de reconnaissance de kinases connues parmi les phosphosites que nous avons identifiés. Nous avons trouvé que les résidus T109, S217 et S224 font partie de sites putatifs de la Caséine kinase II (CKII), suggérant que ces positions seraient susceptibles d'être phosphorylés par cette kinase. Un essai de phosphorylation in vitro a révélé que She2 est phosphorylée par CKII au niveau des résidus S217 et S224, mais pas au résidu T109. Nous avons montré que la phosphorylation de la forme monomérique de She2 par CKII in vitro est augmentée par rapport à la forme sauvage tétramérique. De plus, nous avons observé que le domaine C-terminal de She2, qui contient sa séquence de localisation nucléaire (NLS) est phosphorylé par CKII. Cependant, le rôle de la phosphorylation dans le NLS de She2 demeure inconnu. Dans l'ensemble, nos résultats montrent que les modifications post-traductionnelles sur She2 régulent la localisation de l'ARNm chez la levure. Cette étude permettra d'élucider les mécanismes de contrôle de la localisation de l'ARNm chez la levure et comment des modifications post-traductionnelles sur She2 régulent ce processus. / mRNA localization is a post-transcriptional mechanism regulating gene expression that gives precise control over the spatial and temporal production of proteins. Thousands of transcripts in a wide array of organisms or cell types were shown to localize to specific subcellular compartments. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae serves as one of the best model organisms to study the mechanisms of mRNA localization. Over thirty transcripts are actively transported and localized at the bud tip of the budding yeast. In this organism, localization of transcripts to the bud tip, such as the ASH1 mRNA, depends on the RNA-binding protein She2, which is responsible for recognizing localization elements in these mRNAs during transcription. She2 is a non-canonical RNA-binding protein which assembles as a tetramer in order to bind RNA. When the mRNA-She2 complex is exported to the cytoplasm, the protein She3 and myosin Myo4 join the complex to transport it to the bud. Once an mRNA is properly localized, its translation is generally activated to allow the local synthesis of its protein. The mechanisms regulating the localization of mRNAs are still poorly known. Still, several pieces of evidence suggest that post-translational modifications may regulate the localization machinery. Using a phosphoprotein purification column, we found that She2 is a phosphoprotein. We used a phosphoproteomic analysis to identify the phosphorylated residues in She2 in vivo. We identified several new phosphosites that impact the capacity of She2 to promote the asymmetric accumulation of Ash1. Interestingly, several of these phosphosites are present at the dimerization and tetramerization interfaces of She2. Focusing on T109, we show that a phosphomimetic mutant T109D inhibits She2-She2 interaction and decreases the interaction of She2 with its co-interactors Srp1, She3 and ASH1 mRNA. Interestingly, the T109D mutation significantly reduces the expression of She2 and disrupts ASH1 mRNA localization. Altogether, our results show that the control of She2 oligomerization by phosphorylation represents a mechanism that regulates mRNA localization in budding yeast. In order to identify which kinase(s) are involved in She2 phosphorylation, we searched for known kinases recognition motifs among the identified phosphosites. We found that T109, S217 and S224 are putative Casein kinase II (CKII) sites, suggesting that this kinase may phosphorylate these residues. Indeed, an in vitro phosphorylation assay revealed that She2 is phosphorylated by CKII at S217 and S224 but not at T109. We found that the phosphorylation of a monomeric She2 mutant by CKII in vitro is increased compared to the wild-type tetrameric protein. Furthermore, we found that the C-terminal domain of She2, which contains its nuclear localization signal (NLS), is phosphorylated by CKII. However, the biological function of the phosphorylation in the NLS is still unknown. Altogether, our results show that post-translational modifications in She2 regulate mRNA localization in yeast. This study will help elucidate the mechanisms that control mRNA localization in yeast and how post-translational modifications in She2 regulate this process.

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