Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis. / Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.

A busca por materiais derivados de fontes renováveis e com características como biocompatibilidade e biodegradabilidade tem crescido significativamente nos últimos anos. A utilização de enzimas na polimerização representa um grande passo para a obtenção destes, visto que possibilitam a produção de polímeros evitando a utilização de catalisadores tóxicos e, assim, melhorando sua biocompatibilidade. O presente trabalho descreve a utilização de monômeros funcionais derivados de fontes renováveis na produção de poliésteres hidrolisáveis via catálise enzimática. As sínteses de polímeros produzidos a partir de isosorbídeo e ácidos dicarboxílicos ou derivados - como seus ésteres alquílicos e vinílicos - foram feitas utilizando a lipase de Candida antarctica Fração B como catalisador. As polimerizações foram realizadas por policondensações em massa e em solução, utilizando-se diferentes solventes e diferentes técnicas para remoção de subprodutos de reação. A principal abordagem foi o estudo das diferentes condições reacionais realizadas, variando-se o tempo de reação, tipo do monômero, solvente utilizado (se for o caso) e tipo de técnica para remoção de subprodutos visando o aumento da massa molar dos polímeros. A condição que forneceu os materiais com maiores massas molares foi a policondensação em solução, utilizando a mistura cicloexano:benzeno como solvente. Tendo por objetivo investigar profundamente a condição ótima obtida, e estabelecer padrões de comparação com outros sistemas, foram estudados, nessa condição, parâmetros como tempo de reação, efeito do tamanho da cadeia carbônica do monômero, grupo de saída, solubilidade dos polímeros e diluição do sistema. Os materiais obtidos foram caracterizados por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), espectroscopia no infravermelho, difração de raios-X, e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C. Através deste trabalho foi provado que, embora apresente uma cinética de reação lenta, a polimerização enzimática deste diol secundário estericamente impedido é possível, fornecendo poliésteres com massas molares similares às obtidas via catálise química. Todos os resultados obtidos neste trabalho são inéditos no que diz respeito à polimerização enzimática de dióis secundários impedidos, mais especificamente de isosorbídeo. / The search for materials derived from renewable sources, with characteristics such as biocompatibility and biodegradability has grown significantly in recent years. The use of enzymes in the polymerization is a major step for the attainment of these materials, since it allows the production of polymers while avoiding the use of toxic catalysts and thus improving its biocompatibility. This paper describes the use of functional monomers derived from renewable sources in the production of hydrolysable polyesters by enzyme catalysis The synthesis and characterization of polymers derived from isosorbide and dicarboxilic acids or derivatives - such as alkyl and vinyl esters - were carried out using the lipase from Candida antarctica - Fraction B as catalyst. The polymerizations were accomplished by polycondensations in bulk and in solution, using different solvents and different techniques for removal of reaction byproducts. The main approach was to study the different reaction conditions, by varying the reaction time, monomer type, solvent used (if applicable) and the type of technique for removal of byproducts, aiming at maximizing polymer molar mass. The condition that provided the material with higher molecular weight was the solution step-growth polymerization, using a mixture cyclohexane:benzene as solvents. Aiming to thoroughly investigate the optimum condition obtained, and to establish standards for comparison with other systems, it was studied, in this condition, parameters such as reaction time, effect of monomer carbon chain length , leaving group, polymers solubility of and dilution of the reaction system. The materials were characterized by gel permeation chromatography (SEC), thermogravimetry (TG), differential scanning calorimetry (DSC), infrared spectroscopy, X-ray diffraction and 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Through this work it was proved that, in spite of a slow reaction kinetics, the enzymatic polymerization of this hindered secondary diol is possible, providing polyester with molecular weight similar to those obtained by chemical catalysis. All results obtained in this work are unprecedented with respect to the enzymatic polymerization of hindered secondary diols, more specifically of Isosorbide.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:59:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Deise Molinari.pdf: 2157738 bytes, checksum: 9e4ace819ec46542bcd06e637a3d604e (MD5) Previous issue date: 2015-03-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fuels in Brazil have been produced in large scales, creating jobs and promoting economic growth and energy security. Biodiesel is an alternative fuel to petroleum diesel, made from renewable sources such as vegetable oils and animal fats which react with an alcohol in the presence of catalysts. The hidroesterificação is one of the biodiesel production routes and has been much studied, consisting of a hydrolysis step followed by esterification. These reactions when carried out using heterogeneous catalysts, require high temperatures and pressures to occur, which can be circumvented with the use of enzymes as a catalyst, which use milder conditions. The crambe is an oil that has favorable agronomic conditions and a major source of non-edible oil. The use of ultrasound has been shown to be effective in increasing enzyme activity and the formation of microemulsion. This work was comoobjetivo investigate the enzymatic hydrolysis reaction of crambe oil, aiming at the production of free fatty acids, using the Ultra Lecitase lipase (Phospholipase A1), batch reactor with orbital shaking and assisted a batch reactor with cavitaçãoultrassônica gavage. The conversions obtained using the ultrasound probe were lower than those obtained by the batch reactor with orbital shaker. In this study a central rotational design planning compound (CCRD) 2³ full was used to study the effects of varying temperature, fraction of water / oil (W / O) fraction and enzyme / substrate (E / S, where S = weight Total oil and water), the yield of the reaction was followed from acid analysis. The results of the planning for the ultrasound showed that the optimum conditions were met in the study limits. Showing that the use of the ultrasound probe is superior to conventional methods, significantly larger and better formed emulsions. With only 4 hours of reaction the yield of fatty acids was 57.7% at 40 ° C, thus decreasing the reaction kinetics, while the orbital shaker for yield was 65.36%, but 12 hours was required reaction at 50 ° C. Experiments were carried out in optimum condition to obtain the kinetics. A kinetic simplified mathematical model was used to describe reaction kinetics. The use of ultrasound despite providing lower conversion, proved to be a promising technique since it reduces the reaction time. / Os combustíveis no Brasil têm sido produzidos em grandes escalas, gerando empregos e promovendo crescimento econômico e segurança energética. Biodiesel é um combustível alternativo ao diesel de petróleo, feito a partir de fontes renováveis tais como, óleos vegetais e gorduras de origem animal que reagem com um alcool na presença de catalisadores. A hidroesterificação é uma das rotas de produção de biodiesel e que tem sido muito investigada, consistindo em uma etapa de hidrolise seguida de esterificação. Estas reações quando realizadas com catalisadores heterogêneos, necessitam de altas temperaturas e pressões para ocorrer, o que pode ser contornado com o uso de enzimas como catalisador, as quais utilizam condições mais brandas. O crambe é uma oleaginosa que possui condições agronômicas favoráveis e uma considerável fonte de óleo não comestível. O uso de ultrassom tem se mostrado efetivo no aumento da atividade enzimática e na formação de microemulsões. Este trabalho teve comoobjetivo investigar a reação de hidrólise enzimática do óleo de crambe, visando a produção de ácidos graxos livres, empregando a lipase Lecitase Ultra (Fosfolipase A1), em reator batelada com agitação orbital e assistido de um reator batelada com cavitaçãoultrassônica por sonda. As conversões obtidas com o uso do ultrassom de sonda foram inferiores as obtidas pelo reator batelada com agitador orbital. Neste trabalho um planejamento de delineamento central do composto rotacional (DCCR) completo 2³ foi empregado para estudar os efeitos das variáveis temperatura, fração água/óleo (A/O) e fração de enzima/substrato (E/S, onde , S = massa de total de água e óleo), no rendimento da reação que foi acompanhada a partir da análise de acidez. Os resultados do planejamento para o ultrassom mostraram que as condições ótimas foram atingidas nos limites estudados. Mostrando que o uso do ultrassom de sonda é superior aos métodos convencionais, formando emulsões significativamente maiores e melhores. Com apenas 4 horas de reação o rendimento em ácidos graxos foi de 57,7% à 40 ºC, diminuindo assim a cinética reacional, enquanto que para o agitador orbital o rendimento foi de 65,36%, porém, foram necessárias 12 horas de reação à 50 ºC. Foram realizados experimentos na condição ótima para obtenção da cinética. Um modelo matemático cinético simplificado foi utilizado para descrever a cinética reacional. O uso de ultrassom apesar de fornecer menor conversão, se mostrou uma técnica promissora, pois diminui o tempo reacional.