O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem. / In Caulobacter crescentus, the groESL operon presents a dual type of control. Heat shock induction of the operon is dependent on the heat shock sigma factor σ-32. At physiological temperatures, groESL expression is cell cycle regulated and the control involves the repressor protein HrcA and the element CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin ~xpression). To study the activity of HrcA in vitro, we produced and purified from E. coli a histidine-tagged version of the protein, and specific binding to the CIRCE element was analyzed in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). The amount of retarded DNA increased significantly in the presence of GroES/GroEL, suggesting that these proteins modulate HrcA activity. Further evidence of this modulation was obtained using lacZ transcription fusions with the groESL regulatory region in C. crescentus cells producing different amounts of GroES/GroEL. The mutants proteins HrcA Pro81Ala and HrcA Arg87Ala, that contain amino acid substitutions in the putative DNA-bindíng domain of the protein, were found to be deficient in binding to CIRCE in vitro and in vivo. Furthermore, HrcA Ser56Ala expressed together with the wild type protein within the same cell, produced a dominant-negative phenotype, indicating that C. crescentus HrcA binds to CIRCE in an oligomeric form, most likely as a dimer. Attempts to obtain null mutants for groESL or dnaKJ were unsuccessful indicating the importance of GroES/GroEL and DnaK/lDnaJ to the survival of C. crescentus cells. Conditional mutants were then constructed in our laboratory in which groESL and dnaKJ expression is under the control ofaxylose inducible promoter (PxyIX) , giving rise to strains SG300 and SG400, respectively. These strains were characterized in regard to their morphology under permissive and restrictive conditions, as well as their viability under different types of environmental stresses. SG300 cells depleted of GroES/GroEL are resistant to heat shock at 42°C and can acquire some thermotolerance, but they are sensitive to oxidative, saline and osmotic stresses. SG400 cells depleted of DnaKlJ are quite sensitive to heat shock, ethanol and freezing, and are unable of acquiring thermotolerance. Cells depleted of either GroES/EL or DnaKlJ also present morphological problems. SG300 cells depleted of GroES/EL form long and pinched filaments. SG400 cells depleted of DnaKlJ are only somewhat more elongated than wild-type predivisional cells and most cells do not present septum. These observations indicate a cell division arrest, which should occur at different stages in each strain.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JULIANA_ MOCO CORREA (2).pdf: 1734110 bytes, checksum: 24beceb790c634d766ff59c9de448991 (MD5) Previous issue date: 2014-11-27 / PAPER 1 Depletion of the xynB2 gene upregulates β-Xylosidase expression in C. crescentus. Caulobacter crescentus is able to express several enzymes involved in the utilization of lignocellulosic biomasses. Five genes, xynB1-5, that encode β-xylosidases are present in the genome of this bacterium. In this study, the xynB2 gene, which encodes - xylosidase II (CCNA_02442), was cloned under the control of the PxylX promoter to generate the O-xynB2 strain, which overexpresses the enzyme in the presence of xylose. In addition, a null mutant strain, -xynB2, was created by two homologous recombination events where the chromosomal xynB2 gene was replaced by a copy that was disrupted by the spectinomycin-resistant cassette. It was demonstrated that C. crescentus cells lacking -xylosidase II up-regulates the xynB genes inducing β- xylosidase activity. Transcriptional analysis revealed that xynB1 (RT-PCR analysis) and xynB2 (lacZ transcription fusion) gene expression was induced in the -xynB2 cells, and high -xylosidase activity was observed in the presence of different agroindustrial residues in the null mutant strain, a characteristic that can be explored and applied in biotechnological processes. In contrast, overexpression of the xynB2 gene caused down-regulation of the expression and activity of the -xylosidase. For example, the β-xylosidase activity that was obtained in the presence of sugar cane bagasse was 7-fold and 16-fold higher than the activity measured in the C. crescentus parental and O-xynB2 cells, respectively. Our results suggest that -xylosidase II may have a role in controlling the expression of the xynB1 and xynB2 genes in C.crescentus. PAPER 2 - OPTIMIZATION OF THE PRODUCTION β-XYLOSIDASE: A NEW Thermomyces lanuginosus ISOLATED FROM ATLANTIC FOREST BIOME. The successful production of enzymes for the deconstruction of plant biomass depends not only on the isolation and identification of new microorganism producers of hemicellulases, but also on the implementation and improvement of experimental strategies that lead to maximal induction of enzymatic activities. In this work, a new strain of Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) was isolated from the Atlantic Forest biome in Brazil, and its β-xylosidase activity in response to agro-industrial residues was tested. Using the (CCRD) statistical approach as a strategy for optimization, the induction of β-xylosidase activity was evaluated in residual corn straw, which was used as a carbon source, and improved so that the optimum condition achieved high β-xylosidase activity (1,003 U ml -1; specific activity = 1.683 U mg-1) with 214 U ml -1. The optimal conditions for the crude enzyme extract were pH 5.5 and 60° C showing better thermostability at 55° C. The saccharification ability of β-xylosidase in the presence of hemicellulose obtained from corn straw and xylan from beechwood substrates showed a xylo-oligosaccharide to xylose conversion yield of 80 and 50%, respectively, at 50° C. These data suggest that β-xylosidase from T. lanuginosus isolated from the Atlantic Forest can be used for the saccharification of hemicellulose derived from corn straw, an abundant residue in the American continents, thus providing an interesting alternative for future tests for energy production that relies on the conversion of plant biomass. / RESUMO GERAL As Beta-D-Xilosidases (1,4-β-D-xilano xilohidrolase; EC 3.2.1.37) são glicosídeo hidrolases que tem papel crucial em catalizar a liberação de unidades de xilose a partir de xilo-oligossacarídeos derivados da degradação do xilano. A completa degradação do xilano é um passo chave do ciclo do carbono na natureza e é um processo também realizado por microrganismos. A bioconversão de materiais lignocelulósicos é vantajosa não somente do ponto de vista ambiental mais também econômico o que é recebido nos setores produtivos com um considerável interesse, pois esses materiais representam vasta fonte de carbono, que podem ser empregados no desenvolvimento de bioprocessos que resultam em produtos de alto valor agregado; entre os quais estão os açúcares fermentáveis, combustíveis, fármacos, enzimas e substâncias de interesse industrial, além de fazer uma gestão integrada do efluente que por não haver um desenvolvimento biotecnológico adequado é descartado e acumulado na natureza. Em face disso, o presente trabalho teve por objetivos estudar a regulação gênica do gene xynB2 da bactéria Caulobacter crescentus que codifica para a Beta-xilosidase II através de abordagens moleculares e otimizar a produção enzimática de Betaxilosidases de Thermomyces lanuginosus na presença de diferentes resíduos de biomassa vegetal por delineamento experimental. No primeiro artigo exploramos a bactéria aquática Caulobacter crescentus por possuir várias enzimas envolvidas na utilização de biomassas lignocelulósicas; contendo em seu genoma cinco genes que codificam β-xilosidases. A partir do gene xynB2, que codifica para enzima -xylosidase II (CCNA_02442), desenvolvemos duas linhagens mutantes denominadas O-xynB2, que super-expressa a enzima na presença de xilose e -xynB2 que tem o gene xynB2 interrompido, o que possibilitou avaliar que a ausência da enzima -xylosidase II em células de C. crescentus regula positivamente os genes xynB, induzindo a atividade global de β-xilosidases, revelando um papel regulatório para a mesma. No segundo trabalho um fungo da linhagem Thermomyces lanuginosus isolado de bioma de Mata Atlântica foi identificado e analisado quanto à capacidade de produzir Beta-xilosidases na presença de diferentes resíduos vegetais; em decorrência disso foi otimizado a produção enzimática com delineamento experimental DCCR, o que permitiu alcançar altos níveis de atividade enzimática beta-xilosidásica na presença de palha de milho.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JULIANA_ MOCO CORREA (2).pdf: 1734110 bytes, checksum: 24beceb790c634d766ff59c9de448991 (MD5) Previous issue date: 2014-11-27 / PAPER 1 Depletion of the xynB2 gene upregulates β-Xylosidase expression in C. crescentus. Caulobacter crescentus is able to express several enzymes involved in the utilization of lignocellulosic biomasses. Five genes, xynB1-5, that encode β-xylosidases are present in the genome of this bacterium. In this study, the xynB2 gene, which encodes - xylosidase II (CCNA_02442), was cloned under the control of the PxylX promoter to generate the O-xynB2 strain, which overexpresses the enzyme in the presence of xylose. In addition, a null mutant strain, -xynB2, was created by two homologous recombination events where the chromosomal xynB2 gene was replaced by a copy that was disrupted by the spectinomycin-resistant cassette. It was demonstrated that C. crescentus cells lacking -xylosidase II up-regulates the xynB genes inducing β- xylosidase activity. Transcriptional analysis revealed that xynB1 (RT-PCR analysis) and xynB2 (lacZ transcription fusion) gene expression was induced in the -xynB2 cells, and high -xylosidase activity was observed in the presence of different agroindustrial residues in the null mutant strain, a characteristic that can be explored and applied in biotechnological processes. In contrast, overexpression of the xynB2 gene caused down-regulation of the expression and activity of the -xylosidase. For example, the β-xylosidase activity that was obtained in the presence of sugar cane bagasse was 7-fold and 16-fold higher than the activity measured in the C. crescentus parental and O-xynB2 cells, respectively. Our results suggest that -xylosidase II may have a role in controlling the expression of the xynB1 and xynB2 genes in C.crescentus. PAPER 2 - OPTIMIZATION OF THE PRODUCTION β-XYLOSIDASE: A NEW Thermomyces lanuginosus ISOLATED FROM ATLANTIC FOREST BIOME. The successful production of enzymes for the deconstruction of plant biomass depends not only on the isolation and identification of new microorganism producers of hemicellulases, but also on the implementation and improvement of experimental strategies that lead to maximal induction of enzymatic activities. In this work, a new strain of Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) was isolated from the Atlantic Forest biome in Brazil, and its β-xylosidase activity in response to agro-industrial residues was tested. Using the (CCRD) statistical approach as a strategy for optimization, the induction of β-xylosidase activity was evaluated in residual corn straw, which was used as a carbon source, and improved so that the optimum condition achieved high β-xylosidase activity (1,003 U ml -1; specific activity = 1.683 U mg-1) with 214 U ml -1. The optimal conditions for the crude enzyme extract were pH 5.5 and 60° C showing better thermostability at 55° C. The saccharification ability of β-xylosidase in the presence of hemicellulose obtained from corn straw and xylan from beechwood substrates showed a xylo-oligosaccharide to xylose conversion yield of 80 and 50%, respectively, at 50° C. These data suggest that β-xylosidase from T. lanuginosus isolated from the Atlantic Forest can be used for the saccharification of hemicellulose derived from corn straw, an abundant residue in the American continents, thus providing an interesting alternative for future tests for energy production that relies on the conversion of plant biomass. / RESUMO GERAL As Beta-D-Xilosidases (1,4-β-D-xilano xilohidrolase; EC 3.2.1.37) são glicosídeo hidrolases que tem papel crucial em catalizar a liberação de unidades de xilose a partir de xilo-oligossacarídeos derivados da degradação do xilano. A completa degradação do xilano é um passo chave do ciclo do carbono na natureza e é um processo também realizado por microrganismos. A bioconversão de materiais lignocelulósicos é vantajosa não somente do ponto de vista ambiental mais também econômico o que é recebido nos setores produtivos com um considerável interesse, pois esses materiais representam vasta fonte de carbono, que podem ser empregados no desenvolvimento de bioprocessos que resultam em produtos de alto valor agregado; entre os quais estão os açúcares fermentáveis, combustíveis, fármacos, enzimas e substâncias de interesse industrial, além de fazer uma gestão integrada do efluente que por não haver um desenvolvimento biotecnológico adequado é descartado e acumulado na natureza. Em face disso, o presente trabalho teve por objetivos estudar a regulação gênica do gene xynB2 da bactéria Caulobacter crescentus que codifica para a Beta-xilosidase II através de abordagens moleculares e otimizar a produção enzimática de Betaxilosidases de Thermomyces lanuginosus na presença de diferentes resíduos de biomassa vegetal por delineamento experimental. No primeiro artigo exploramos a bactéria aquática Caulobacter crescentus por possuir várias enzimas envolvidas na utilização de biomassas lignocelulósicas; contendo em seu genoma cinco genes que codificam β-xilosidases. A partir do gene xynB2, que codifica para enzima -xylosidase II (CCNA_02442), desenvolvemos duas linhagens mutantes denominadas O-xynB2, que super-expressa a enzima na presença de xilose e -xynB2 que tem o gene xynB2 interrompido, o que possibilitou avaliar que a ausência da enzima -xylosidase II em células de C. crescentus regula positivamente os genes xynB, induzindo a atividade global de β-xilosidases, revelando um papel regulatório para a mesma. No segundo trabalho um fungo da linhagem Thermomyces lanuginosus isolado de bioma de Mata Atlântica foi identificado e analisado quanto à capacidade de produzir Beta-xilosidases na presença de diferentes resíduos vegetais; em decorrência disso foi otimizado a produção enzimática com delineamento experimental DCCR, o que permitiu alcançar altos níveis de atividade enzimática beta-xilosidásica na presença de palha de milho.