Les nanopores sont des ouvertures de taille nanométrique sur une membrane étanche isolante qui permettent de réaliser le suivi des objets qui les traversent. Il existe dans la nature des nanopores facilement reproductible en laboratoire comme l'alpha-hémolysine mais qui présente l'inconvénient d'avoir une durée de vie limitée ainsi qu'une fragilité importante (difficulté à les utiliser dans des dispositifs nomades). En s'intéressant aux nanopores solides nous cherchons à étudier une alternative plus stable dans le temps et donnant des résultats d'une plus grande reproductibilité. Les nanopores que nous utilisons sont obtenus par perçage par FIB (Focused Ion Beam) au LPN sur divers supports. Les membranes de silicium commerciales ont une épaisseur typique comprise entre 10 et 300 nm et servent à l'origine comme support d'observation de composé en microscopie électronique à transmission. Leur usage en est détourné ici afin de percer des nanopores uniques au sein d'une fenêtre de 100 x 100 μm en moyenne. Les nanopores peuvent alors être mesuré par TEM ou MEB afin d'estimer la taille du pore lors de la fabrication afin de calibrer les doses nécessaires au perçage des pores. / Nanopores are nanometric holes on insulating membranes that allow the tracking of objects going through. Natural nanopores exist and are easily reproducible in laboratory conditions (alpha-hemolysine) but they are not compatible with a mobile device due to their fragility and to their reduced lifetime. Investigating solid-state nanopores allows us to approach a more stable alternative with a higher degree of reproductibility. Our nanopores are obtained by FIB drilling at LPN on various supporting membranes. The aim of this thesis is to investigate the use of SiN as a membrane to detect viruses.

Die Proteinhülle von Pflanzenviren besteht aus Protein-Untereinheiten, die das Genom des Virus verkapseln und transportieren. Der zugrunde liegende self-assembly-Mechanismus kann für nanotechnologische Anwendungen genutzt werden, indem Fremdmoleküle in den Viren verkapselt werden. Diese sogenannten Virus-ähnlichen Partikel (VLP) können zum Wirkstofftransport in der Krebstherapie, für Gentherapie oder als Kontrastmittel bei bildgebenden Verfahren verwendet werden. Auch die Oberfläche der Proteinhülle kann chemisch oder molekularbiologisch funktionalisiert werden. Ein großer Vorteil von Pflanzenviren ist, dass sie keine Gefahr für den Menschen darstellen und einfach in natürlichen Wirtspflanzen hergestellt werden können. In dieser Arbeit wird am Beispiel des Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV) gezeigt, wie diese Nanomaterialien effizient hergestellt und nutzbar gemacht werden können. Im ersten Kapitel wurde eine Affinitätsextraktion basierend auf einem neuen Peptid-Aptamer entwickelt, um das CCMV selektiv aus dem Extrakt der infizierten Pflanze zu isolieren. Das Reinigungsprotokoll wurde validiert und eine finale Reinheit von 98,4% mittels Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Im zweiten Kapitel wurden CCMV-VLPs durch rekombinante Expression und anschließende in vitro Assemblierung der Kapsidproteine hergestellt. Die Monodispersität der VLPs wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt. Zusätzlich wurde eine Mutante der CCMV-VLPs hergestellt, die physiologischen Bedingungen standhält und für den Einsatz in vivo geeignet ist. Im dritten Kapitel wurden CCMV und dessen VLPs für nanotechnologische Anwendungen genutzt. Gold-Nanopartikel wurden in CCMV-VLPs verkapselt und im TEM sichtbar gemacht. Das CCMV-Kapsid wurde mit einem Modellpeptid funktionalisiert, um das Potenzial dieses Nanomaterials als chemische Plattform zu demonstrieren. / The protein shell of plant viruses consists of protein subunits that encapsulate and transport the viral genome. The underlying self-assembly mechanism can be utilized for nanotechnological applications by encapsulating foreign molecules within the viruses. These so-called virus-like particles (VLPs) can be used for drug delivery in cancer therapy, gene therapy, or as contrast agents in imaging techniques. Additionally, the surface of the protein shell can be functionalized chemically or via molecular biology techniques. A significant advantage of plant viruses is that they pose no threat to humans and can be easily produced in natural host plants. This work demonstrates how these nanomaterials can be efficiently produced and utilized using the example of Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV). In the first chapter, an affinity extraction based on a novel peptide aptamer was developed to selectively isolate CCMV from the extract of the infected plant. The purification protocol was validated, achieving a final purity of 98.4% using reverse-phase HPLC. In the second chapter, CCMV-VLPs were produced through recombinant expression and subsequent in vitro assembly of the capsid proteins. The monodispersity of the VLPs was confirmed by transmission electron microscopy (TEM). Additionally, a mutant of the CCMV-VLPs was produced that withstands physiological conditions and is suitable for in vivo applications. In the third chapter, CCMV and its VLPs were used for nanotechnological applications. Gold nanoparticles were encapsulated within CCMV-VLPs and visualized using TEM. The CCMV capsid was also functionalized with a model peptide to demonstrate the potential of this nanomaterial as a chemical platform.

An understanding of the mechanical properties of viral capsids (protein assemblies forming shell containers) has become necessary as their perceived use as nano-materials for targeted drug delivery. In this thesis, a heterogeneous, spatially detailed model of the viral capsid is considered. This model takes into account the increased degrees of freedom between the capsomers (capsid sub-structures) and the interactions between them to better reflect their deformation properties. A spatially realistic finite element multi-domain decomposition of viral capsid shells is also generated from atomistic PDB (Protein Data Bank) information, and non-linear continuum elastic simulations are performed. These results are compared to homogeneous shell simulation re- sults to bring out the importance of non-homogenous material properties in determining the deformation of the capsid. Finally, multiscale methods in structural analysis are reviewed to study their potential application to the study of nanoindentation of viral capsids. / text

Bakgrund: Kongenital cytomegalovirusinfektion, kCMV-infektion har en prevalens på 0,5–2,0 % och är den vanligaste orsaken till förvärvad, progressiv hörselnedsättning. Infektionen kan också medföra en rad andra komplikationer som exempelvis ADHD, autismspektrumtillstånd och språkstörning. Syfte: Syftet med studien var att undersöka vad föräldrar till barn med kCMV-infektion har för upplevelse av svensk sjukvård gällande diagnosbesked, informationsflöde och kunskap om diagnosen. Metod: Datainsamling skedde genom en fokusgruppsintervju med tre deltagare och en individuell semistrukturerad intervju med en deltagare. Analysmetoden som användes var kvalitativ innehållsanalys med konventionell ansats. Resultat: Vid analysen identifierades fyra separata teman; “Information från sjukvården”, “Diagnosbesked”, “Upplevelse av sjukvården” och “Förbättringsförslag till sjukvården”. Slutsats: Resultaten tyder på att det finns en önskan från föräldrar att få information om kCMV-infektion i preventivt syfte, exempelvis vid rutinbesök hos barnmorska under graviditet. Dessutom indikerar resultaten att föräldrar till barn med kCMV-infektion önskar ökad kunskap och mer fokus på diagnosen från sjukvårdens sida, snarare än att huvudsakligen fokusera på de efterföljande funktionsnedsättningarna.