Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en el mundo. Desregulaciones en el flujo autofágico y en la desdiferenciación de células musculares lisas vasculares (VSMC) se han asociado con diferentes enfermedades cardiovasculares. En la aterosclerosis, una de las patologías cardiovasculares más importante, las VSMC desempeñan un papel fundamental cuando cambian su fenotipo desde uno contráctil y quiescente a otro proliferativo, migratorio y sintético. Se ha descrito que el cambio fenotípico de las VSMC es un proceso dependiente de autofagia. Por lo tanto, encontrar nuevos mecanismos que regulen este cambio fenotípico es fundamental para generar nuevas alternativas para tratar las enfermedades cardiovasculares. Dentro de esta búsqueda, el péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), una hormona de la familia de las incretinas, surge como un potencial inhibidor de este proceso. Nuestro laboratorio ha descrito que esta incretina, al unirse a su receptor, activa a la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (PKA). Se ha descrito a la PKA como un regulador negativo de la autofagia, ya que fosforila e inhibe a la proteína asociada a microtúbulo 1A/1B cadena liviana 3B, conocida también como LC3, una proteína autofágica esencial que también se usa como marcadora de la autofagia. Además, tanto en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 como en pacientes sanos, se ha comprobado la acción beneficiosa de GLP-1 sobre la aterosclerosis. Por estos antecedentes, proponemos que GLP-1 inhibe la autofagia a través de la fosforilación de LC3 por PKA en VSMC. La línea celular de aorta de rata, A7r5, se cultivó en condiciones basales en medio completo suplementado con 10% suero fetal bovino. La autofagia se indujo con un medio de cultivo carente de glucosa, el RPMI 1640. Además, las células A7r5 se estimularon con GLP-1 y/o H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromofenil)alilamino)etil)-isoquinolin-5- sulfonamida], inhibidor de PKA. La autofagia se evaluó midiendo los niveles proteicos de LC3 I y LC3 II por western blot y por la formación de autofagosomas. Los autofagosomas se visualizaron mediante la transducción de VSMC con un adenovirus que sobreexpresa xii LC3 acoplada a la proteína fluorescente verde con una multiplicidad de infección de 180 y microscopía confocal. El flujo autofágico se determinó usando cloroquina. Nuestros resultados sugieren que GLP-1 disminuye el flujo autofágico en condiciones basales y de privación de glucosa. Además, GLP-1 disminuyó el número de autofagosomas por célula en la autofagia basal, pero no durante la privación de glucosa. Asimismo, se determinó que PKA participaría en los efectos generados por GLP-1 en la autofagia basal, pero no en la autofagia inducida por privación de glucosa. Finalmente, GLP-1 no aumenta la fosforilación de LC3. Este resultado sugiere que la inhibición de la autofagia por GLP-1 mediante PKA no ocurría por fosforilación de LC3. Por lo tanto, el efecto de GLP-1 en la inhibición de la autofagia en VSMC vía PKA, se suma a los antecedentes que postulan a GLP-1 como un promisorio regulador de la aterosclerosis y de otras enfermedades cardiovasculares. / Autophagy regulation by GLP-1 in vascular smooth muscle cells (VSMC) Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world. Deregulation in both autophagic flux and vascular smooth muscle cell (VSMC) dedifferentiation have been associated with different cardiovascular diseases. In atherosclerosis, one of the most important cardiovascular pathology, VSMC play a critical role when they change from a contractile and quiescent phenotype to a proliferative, migratory and synthetic phenotype. It was described that this phenotypic change is an autophagy-dependent process. Hence, finding new mechanisms to regulate this phenotypic change is critical to generate new alternatives to treat cardiovascular diseases. In this investigation, glucagon like peptide 1 (GLP-1) arises as a potential inhibitor of this process. Our laboratory has described that this incretin, upon binding to its receptor, activates the cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA). PKA was described as a negative autophagy regulator, because it phosphorylates and inhibits the microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B, also known as LC3, an essential autophagic protein also used as an autophagy marker. Besides, in both diabetic patients and healthy patients, the beneficial effects of GLP-1 on atherosclerosis has been demonstrated. Taking the above in consideration, we proposed that GLP-1 inhibits autophagy through a PKA induced LC3 phosphorylation in VSMC. The aortic VSMC cell line A7r5 were cultivated in basal condition with complte culture medium + 10% fetal bovine serum. Autophagy was induced with a glucose deprived culture medium, RPMI 1640. Also, A7r5 cells were stimulated with GLP-1, and/or H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromophenyl)alylamino)ethyl)-isoquinoline-5- sulfonamide], a PKA inhibitor.). Autophagy was assessed by LC3 I and LC3 II levels using by western blot and by autophagosome formation. Autophagosomes were visualized by adenoviral transduction of LC3 coupled to green fluorescent protein using a xiv multiplicity of infection of 180 and confocal microscopy. Autophagic flux was evaluated using chloroquine. Our results suggest that GLP-1 inhibits autophagic flux under basal and glucose deprivation conditions. In addition, GLP-1 decreased the number of autophagosomes per cell in basal autophagy, but not in glucose deprivation-induced autophagy. Moreover, a PKA participation was demonstrated in the GLP-1-dependent effects on basal autophagy, but not on glucose deprivation-induced autophagy. Finally, GLP-1 did not increase LC3 phosphorylation. This result suggest that the GLP-1-dependent autophagy inhibition would not occur through LC3 phosphorylation. Therefore, the GLP-1 effect on autophagy inhibition in VSMC via PKA adds to the background information which suggests GLP-1 as a promising regulator of atherosclerosis and other cardiovascular diseases. / Enero 2018

Magíster en fisiopatología / La hipertrofia cardiaca es una respuesta adaptativa del corazón frente a situaciones de sobrecarga de trabajo, la cual funciona inicialmente como un mecanismo compensatorio. Sin embargo, la hipertrofia sostenida en el tiempo puede conducir a la miocardiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca y muerte súbita. Los receptores adrenérgicos juegan un papel fundamental en la regulación de la función cardiaca bajo condiciones normales y patológicas. Las mitocondrias son responsables del 90% de la producción de ATP en el cardiomiocito y su función está regulada dinámicamente por procesos de fusión y fisión. Cambios en la dinámica y energética mitocondrial constituyen una característica distintiva de los corazones hipertrofiados. La estimulación de cardiomiocitos con agonistas adrenérgicos genera hipertrofia y aumento de la fisión mitocondrial, lo que se asocia a una disminución de la producción de ATP. Miro1 es una proteína de la membrana mitocondrial externa involucrada en la dinámica y el transporte de este organelo, cuya función ha sido estudiada principalmente a nivel neuronal. Es ampliamente conocido que alteraciones en proteínas mitocondriales están relacionadas directamente con cambios en el funcionamiento mitocondrial, y por ende con patologías como la hipertrofia del cardiomiocito. Es por ello que en base a estos antecedentes nos propusimos la siguiente hipótesis: “Miro1 regula negativamente la hipertrofia inducida por fenilefrina en cardiomiocitos de rata neonata” Para contestar esta hipótesis los objetivos específicos de este trabajo se enfocaron en evaluar tanto en cardiomiocitos control como en aquellos tratados con fenilefrina 50 μM el contenido de Miro1 y los efectos del silenciamiento y sobrexpresión de esta proteína sobre el área celular y los marcadores de hipertrofia. Resultados Cardiomiocitos de rata neonata tratados con fenilefrina 50 μM aumentaron en un 50% el área celular, así como también la expresión de los marcadores hipertróficos de β-MHC, ANP y BNP. El silenciamiento de Miro1 indujo un aumento significativo en los niveles de ARNm de ANP y BNP cuando los cardiomiocitos fueron estimulados con fenilefrina, no observándose cambios en el área celular ni en los niveles de β-MHC. Por el contrario, la sobre expresión de Miro1 en los cardiomiocitos evitó tanto el aumento del área celular como el aumento en la expresión de marcadores de hipertrofia. Estos resultados sugieren la participación de Miro1 como proteína reguladora de la hipertrofia en cardiomiocitos. / Cardiac hypertrophy is an adaptive response to manage the excessive cardiac workload of the heart to maintain normal cardiac function. However, sustained hypertrophy leads to cardiomyopathy, cardiac failure and death. Adrenergic receptors play a key role in the regulation of cardiac function under normal and pathological conditions. Mitochondria are responsible for 90% of ATP production in the cardiomyocyte and their function is dynamically regulated by fusion and fission processes. Changes in mitochondrial dynamics and metabolism are central issues in hypertrophied hearts. The stimulation of cardiomyocytes with adrenergic agonists generate hypertrophy and an increase in mitochondrial fission, which in turn is associated with a decrease in ATP synthesis. Miro1 is a mitochondrial outer membrane protein which is involved in the mitochondrial dynamics and transport at neuronal level. It is known that alterations in mitochondrial dynamics proteins are directly associated with mitochondrial dysfunction and with cardiac pathologies such as cardiomyocyte hypertrophy. Based on these asseverations we hypothesized that: "Miro1 negatively regulates phenylephrine-induced hypertrophy in neonatal rat cardiomyocytes" In order to answer this hypothesis the specific aims were focused on to evaluate Miro1 content, and the effect of silencing or overexpressing Miro1 on surface cellular area and hypertrophic gene markers expression in control cardiomyocytes and phenylephrine treated cardiomyocytes. Results Neonatal rat cardiomyocytes treated with 50 μM phenylephrine 50% increased the surface cell area, as well as the expression of the hypertrophic gene markers: β-MHC, ANP and BNP. Miro1 silencing induced a significant increase in ANP and BNP mRNA levels when cardiomyocytes were stimulated with phenylephrine, with no changes in surface cell area or β-MHC mRNA levels. In contrast, Miro1 overexpression in cardiomyocytes prevented both surface cell area increase and mRNA levels of hypertrophic gene markers. These results suggest the involvement of Miro1 as a regulatory protein of hypertrophy in cardiomyocytes.