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Regulación de la autofagia por GLP-1 en células musculareslisas vasculares (VSMC)Núñez Soto, Constanza Belén 09 1900 (has links)
Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en el mundo.
Desregulaciones en el flujo autofágico y en la desdiferenciación de células musculares
lisas vasculares (VSMC) se han asociado con diferentes enfermedades cardiovasculares.
En la aterosclerosis, una de las patologías cardiovasculares más importante, las VSMC
desempeñan un papel fundamental cuando cambian su fenotipo desde uno contráctil y
quiescente a otro proliferativo, migratorio y sintético. Se ha descrito que el cambio
fenotípico de las VSMC es un proceso dependiente de autofagia. Por lo tanto, encontrar
nuevos mecanismos que regulen este cambio fenotípico es fundamental para generar
nuevas alternativas para tratar las enfermedades cardiovasculares. Dentro de esta
búsqueda, el péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), una hormona de la familia de las
incretinas, surge como un potencial inhibidor de este proceso. Nuestro laboratorio ha
descrito que esta incretina, al unirse a su receptor, activa a la proteína quinasa dependiente
de AMP cíclico (PKA). Se ha descrito a la PKA como un regulador negativo de la
autofagia, ya que fosforila e inhibe a la proteína asociada a microtúbulo 1A/1B cadena
liviana 3B, conocida también como LC3, una proteína autofágica esencial que también se
usa como marcadora de la autofagia. Además, tanto en pacientes con diabetes mellitus
tipo 2 como en pacientes sanos, se ha comprobado la acción beneficiosa de GLP-1 sobre
la aterosclerosis.
Por estos antecedentes, proponemos que GLP-1 inhibe la autofagia a través de la
fosforilación de LC3 por PKA en VSMC.
La línea celular de aorta de rata, A7r5, se cultivó en condiciones basales en medio
completo suplementado con 10% suero fetal bovino. La autofagia se indujo con un medio
de cultivo carente de glucosa, el RPMI 1640. Además, las células A7r5 se estimularon
con GLP-1 y/o H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromofenil)alilamino)etil)-isoquinolin-5-
sulfonamida], inhibidor de PKA. La autofagia se evaluó midiendo los niveles proteicos de
LC3 I y LC3 II por western blot y por la formación de autofagosomas. Los autofagosomas
se visualizaron mediante la transducción de VSMC con un adenovirus que sobreexpresa
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LC3 acoplada a la proteína fluorescente verde con una multiplicidad de infección de 180
y microscopía confocal. El flujo autofágico se determinó usando cloroquina.
Nuestros resultados sugieren que GLP-1 disminuye el flujo autofágico en
condiciones basales y de privación de glucosa. Además, GLP-1 disminuyó el número de
autofagosomas por célula en la autofagia basal, pero no durante la privación de glucosa.
Asimismo, se determinó que PKA participaría en los efectos generados por GLP-1 en la
autofagia basal, pero no en la autofagia inducida por privación de glucosa. Finalmente,
GLP-1 no aumenta la fosforilación de LC3. Este resultado sugiere que la inhibición de la
autofagia por GLP-1 mediante PKA no ocurría por fosforilación de LC3.
Por lo tanto, el efecto de GLP-1 en la inhibición de la autofagia en VSMC vía
PKA, se suma a los antecedentes que postulan a GLP-1 como un promisorio regulador de
la aterosclerosis y de otras enfermedades cardiovasculares. / Autophagy regulation by GLP-1 in vascular smooth muscle cells (VSMC)
Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world. Deregulation
in both autophagic flux and vascular smooth muscle cell (VSMC) dedifferentiation have
been associated with different cardiovascular diseases. In atherosclerosis, one of the most
important cardiovascular pathology, VSMC play a critical role when they change from a
contractile and quiescent phenotype to a proliferative, migratory and synthetic phenotype.
It was described that this phenotypic change is an autophagy-dependent process. Hence,
finding new mechanisms to regulate this phenotypic change is critical to generate new
alternatives to treat cardiovascular diseases. In this investigation, glucagon like peptide 1
(GLP-1) arises as a potential inhibitor of this process. Our laboratory has described that
this incretin, upon binding to its receptor, activates the cyclic AMP-dependent protein
kinase (PKA). PKA was described as a negative autophagy regulator, because it
phosphorylates and inhibits the microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,
also known as LC3, an essential autophagic protein also used as an autophagy marker.
Besides, in both diabetic patients and healthy patients, the beneficial effects of GLP-1 on
atherosclerosis has been demonstrated.
Taking the above in consideration, we proposed that GLP-1 inhibits autophagy
through a PKA induced LC3 phosphorylation in VSMC.
The aortic VSMC cell line A7r5 were cultivated in basal condition with complte
culture medium + 10% fetal bovine serum. Autophagy was induced with a glucose
deprived culture medium, RPMI 1640. Also, A7r5 cells were stimulated with GLP-1,
and/or H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromophenyl)alylamino)ethyl)-isoquinoline-5-
sulfonamide], a PKA inhibitor.). Autophagy was assessed by LC3 I and LC3 II levels
using by western blot and by autophagosome formation. Autophagosomes were visualized
by adenoviral transduction of LC3 coupled to green fluorescent protein using a
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multiplicity of infection of 180 and confocal microscopy. Autophagic flux was evaluated
using chloroquine.
Our results suggest that GLP-1 inhibits autophagic flux under basal and glucose
deprivation conditions. In addition, GLP-1 decreased the number of autophagosomes per
cell in basal autophagy, but not in glucose deprivation-induced autophagy. Moreover, a
PKA participation was demonstrated in the GLP-1-dependent effects on basal autophagy,
but not on glucose deprivation-induced autophagy. Finally, GLP-1 did not increase LC3
phosphorylation. This result suggest that the GLP-1-dependent autophagy inhibition
would not occur through LC3 phosphorylation.
Therefore, the GLP-1 effect on autophagy inhibition in VSMC via PKA adds to
the background information which suggests GLP-1 as a promising regulator of
atherosclerosis and other cardiovascular diseases. / Enero 2018
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Participación de Miro1 en hipertrofia en cardiomiocitos de rata neonataConejeros Vásquez, Carolina January 2017 (has links)
Magíster en fisiopatología / La hipertrofia cardiaca es una respuesta adaptativa del corazón frente a situaciones de sobrecarga de
trabajo, la cual funciona inicialmente como un mecanismo compensatorio. Sin embargo, la hipertrofia
sostenida en el tiempo puede conducir a la miocardiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca y muerte
súbita. Los receptores adrenérgicos juegan un papel fundamental en la regulación de la función
cardiaca bajo condiciones normales y patológicas.
Las mitocondrias son responsables del 90% de la producción de ATP en el cardiomiocito y su función
está regulada dinámicamente por procesos de fusión y fisión. Cambios en la dinámica y energética
mitocondrial constituyen una característica distintiva de los corazones hipertrofiados. La estimulación
de cardiomiocitos con agonistas adrenérgicos genera hipertrofia y aumento de la fisión mitocondrial, lo
que se asocia a una disminución de la producción de ATP.
Miro1 es una proteína de la membrana mitocondrial externa involucrada en la dinámica y el transporte
de este organelo, cuya función ha sido estudiada principalmente a nivel neuronal. Es ampliamente
conocido que alteraciones en proteínas mitocondriales están relacionadas directamente con cambios en
el funcionamiento mitocondrial, y por ende con patologías como la hipertrofia del cardiomiocito. Es
por ello que en base a estos antecedentes nos propusimos la siguiente hipótesis: “Miro1 regula negativamente la hipertrofia inducida por fenilefrina en cardiomiocitos de rata
neonata”
Para contestar esta hipótesis los objetivos específicos de este trabajo se enfocaron en evaluar tanto en
cardiomiocitos control como en aquellos tratados con fenilefrina 50 μM el contenido de Miro1 y los
efectos del silenciamiento y sobrexpresión de esta proteína sobre el área celular y los marcadores de
hipertrofia.
Resultados
Cardiomiocitos de rata neonata tratados con fenilefrina 50 μM aumentaron en un 50% el área celular,
así como también la expresión de los marcadores hipertróficos de β-MHC, ANP y BNP. El
silenciamiento de Miro1 indujo un aumento significativo en los niveles de ARNm de ANP y BNP
cuando los cardiomiocitos fueron estimulados con fenilefrina, no observándose cambios en el área
celular ni en los niveles de β-MHC. Por el contrario, la sobre expresión de Miro1 en los cardiomiocitos
evitó tanto el aumento del área celular como el aumento en la expresión de marcadores de hipertrofia.
Estos resultados sugieren la participación de Miro1 como proteína reguladora de la hipertrofia en
cardiomiocitos. / Cardiac hypertrophy is an adaptive response to manage the excessive cardiac workload of the heart to
maintain normal cardiac function. However, sustained hypertrophy leads to cardiomyopathy, cardiac
failure and death. Adrenergic receptors play a key role in the regulation of cardiac function under
normal and pathological conditions.
Mitochondria are responsible for 90% of ATP production in the cardiomyocyte and their function is
dynamically regulated by fusion and fission processes. Changes in mitochondrial dynamics and
metabolism are central issues in hypertrophied hearts. The stimulation of cardiomyocytes with
adrenergic agonists generate hypertrophy and an increase in mitochondrial fission, which in turn is
associated with a decrease in ATP synthesis.
Miro1 is a mitochondrial outer membrane protein which is involved in the mitochondrial dynamics and
transport at neuronal level. It is known that alterations in mitochondrial dynamics proteins are directly
associated with mitochondrial dysfunction and with cardiac pathologies such as cardiomyocyte
hypertrophy. Based on these asseverations we hypothesized that: "Miro1 negatively regulates phenylephrine-induced hypertrophy in neonatal rat
cardiomyocytes"
In order to answer this hypothesis the specific aims were focused on to evaluate Miro1 content, and the
effect of silencing or overexpressing Miro1 on surface cellular area and hypertrophic gene markers
expression in control cardiomyocytes and phenylephrine treated cardiomyocytes.
Results
Neonatal rat cardiomyocytes treated with 50 μM phenylephrine 50% increased the surface cell area, as
well as the expression of the hypertrophic gene markers: β-MHC, ANP and BNP. Miro1 silencing
induced a significant increase in ANP and BNP mRNA levels when cardiomyocytes were stimulated
with phenylephrine, with no changes in surface cell area or β-MHC mRNA levels. In contrast, Miro1
overexpression in cardiomyocytes prevented both surface cell area increase and mRNA levels of
hypertrophic gene markers. These results suggest the involvement of Miro1 as a regulatory protein of
hypertrophy in cardiomyocytes.
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