Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-01-28Bitstream added on 2014-06-13T20:36:12Z : No. of bitstreams: 1 costa_mmtm_me_araca.pdf: 412338 bytes, checksum: 5199132768adb8d8b70a2790ca26b60c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo deste trabalho foi investigar a migração celular induzida pelo hidróxido de cálcio para bolha de ar subcutânea em camundongos. Observou-se que a migração de neutrófilos ocorreu de maneira dose-dependente, alcançando o pico de migração 96 horas após a injeção do estímulo. Esta migração foi inibida com o pré-tratamento dos animais com indometacina (5mg/Kg), meloxican (5mg/Kg) e dexametasona (1mg/Kg), diferentemente, o MK886 (1mg/Kg) foi inefetivo neste processo. Constatou-se também que os animais estimulados com hidróxido de cálcio apresentaram um aumento significativo na liberação de citocinas e quimiocinas (KC, MIP-2, IL1ß e TNFa). O pré-tratamento com meloxican ou aminoguanidina inibiu a liberação de KC, MIP-2, IL1ß, mas não de TNFa. O pré-tratamento com Tioglicolato a 3% aumentou cerca de 167% a população de macrófagos na bolha de ar subcutânea, entretanto, não alterou a migração de neutrófilos. Pôde-se concluir que a migração de neutrófilos para bolha de ar subcutânea induzida pelo hidróxido de cálcio, em camundongos, foi dependente de KC, MIP-2, IL1ß e TNFa, sendo a liberação destes mediadores independente de mastócitos e de macrófagos. / The aim of this study was to investigate the cellular migration induced by calcium hydroxide to air-pouch in mice. It was observed that the migration developed dependently to the doses and achieved the peak 96 hours after the stimulation. Neutrophil migration was inhibited with the pre-treatment with indometacin (5mg/Kg), meloxican (5mg/Kg) and dexamethasone (1mg/Kg). Differently, MK886 (1mg/Kg) was ineffective in this process. It was seen that the animals stimulated with calcium hydroxide showed an increase of cytokines and chymiokines (KC, MIP-2, IL1ß e TNFa) release. Pre-treatment with meloxican or aminoguanidine inhibited KC, MIP-2, IL1ß release, but not TNFa. Release of TNFa was not dependent of prostaglandines and nitric oxide because it was not inhibited by aminoguanidine and meloxican. Pretreatment with Tioglocolate 3% increased 167% the macrophage population in the air-pouch. However, it did not change neutrophil migration. It was possible to conclude that the neutrophil migration to the air-pouch induced by calcium hydroxide in mice was dependent on KC, MIP-2, IL1ß, TNFa and prostaglandins and it was not dependent on the mast cells and macrophages.

Resumo: O objetivo deste trabalho foi investigar a migração celular induzida pelo hidróxido de cálcio para bolha de ar subcutânea em camundongos. Observou-se que a migração de neutrófilos ocorreu de maneira dose-dependente, alcançando o pico de migração 96 horas após a injeção do estímulo. Esta migração foi inibida com o pré-tratamento dos animais com indometacina (5mg/Kg), meloxican (5mg/Kg) e dexametasona (1mg/Kg), diferentemente, o MK886 (1mg/Kg) foi inefetivo neste processo. Constatou-se também que os animais estimulados com hidróxido de cálcio apresentaram um aumento significativo na liberação de citocinas e quimiocinas (KC, MIP-2, IL1ß e TNFa). O pré-tratamento com meloxican ou aminoguanidina inibiu a liberação de KC, MIP-2, IL1ß, mas não de TNFa. O pré-tratamento com Tioglicolato a 3% aumentou cerca de 167% a população de macrófagos na bolha de ar subcutânea, entretanto, não alterou a migração de neutrófilos. Pôde-se concluir que a migração de neutrófilos para bolha de ar subcutânea induzida pelo hidróxido de cálcio, em camundongos, foi dependente de KC, MIP-2, IL1ß e TNFa, sendo a liberação destes mediadores independente de mastócitos e de macrófagos. / Abstract: The aim of this study was to investigate the cellular migration induced by calcium hydroxide to air-pouch in mice. It was observed that the migration developed dependently to the doses and achieved the peak 96 hours after the stimulation. Neutrophil migration was inhibited with the pre-treatment with indometacin (5mg/Kg), meloxican (5mg/Kg) and dexamethasone (1mg/Kg). Differently, MK886 (1mg/Kg) was ineffective in this process. It was seen that the animals stimulated with calcium hydroxide showed an increase of cytokines and chymiokines (KC, MIP-2, IL1ß e TNFa) release. Pre-treatment with meloxican or aminoguanidine inhibited KC, MIP-2, IL1ß release, but not TNFa. Release of TNFa was not dependent of prostaglandines and nitric oxide because it was not inhibited by aminoguanidine and meloxican. Pretreatment with Tioglocolate 3% increased 167% the macrophage population in the air-pouch. However, it did not change neutrophil migration. It was possible to conclude that the neutrophil migration to the air-pouch induced by calcium hydroxide in mice was dependent on KC, MIP-2, IL1ß, TNFa and prostaglandins and it was not dependent on the mast cells and macrophages. / Orientador: João Eduardo Gomes Filho / Coorientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Carlos Ferreira dos Santos / Banca: Pedro Felício Estrada Bernabé / Mestre

A migração de células musculares lisas (VSMC) da camada média do vaso para a íntima é essencial para vasculogênese e contribui para o processo de aterosclerose e estenose após lesão por cateter-balão, caracterizando-se como um importante alvo terapêutico. Diversos trabalhos já demonstraram que fatores de crescimento (como PDGF e FGF) estimulam a migração de VSMC, inclusive, muitos desses fatores de crescimento induzem sinalização redox associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ex. Nox1 NADPH oxidase). Nosso grupo já descreveu interações físicas e regulação funcional da NADPH oxidase por uma chaperona redox do retículo endoplasmático, a Dissulfeto Isomerase Protéica (PDI). Contudo, tanto a relevância fisiológica como os mecanismos desta interação ainda não estão claros. O objetivo geral do presente trabalho é investigar por meio de experimentos de perda e ganho de função da PDI, a importância da PDI na migração celular associada à ativação do complexo NADPH oxidase, bem como possíveis mecanismos envolvidos na interação entre a PDI e esse complexo enzimático durante a migração celular. Os objetivos específicos são: i) avaliar o efeito do silenciamento da PDI, bem como da expressão forçada de PDI wild type na migração de VSMC in vitro; ii) analisar o efeito da transfecção de siRNA da PDI atividade e expressão de distintas isoformas da NADPH oxidase vascular e produção de ROS induzida por PDGF; iii) investigar o envolvimento de RhoGTPases na regulação do complexo NADPH oxidase pela PDI. No presente trabalho, mostramos que o PDGF induz redistribuição da PDI e aumento da produção de ROS. O silenciamento da PDI inibe a produção de ROS e a expressão do mRNA da Nox1, sem alterar a expressão do mRNA da Nox4. Mais ainda, o silenciamento da PDI reduz a migração celular induzida por PDGF, em diferentes modelos de migração, enquanto a super-expressão da PDI induz aumento espontâneo da migração na condição basal. Análise utilizando métodos de Biologia de Sistemas de redes de interação física proteína-proteína em bancos de dados e técnicas de análise de centralidade, topologia e ontologia gênica indicou forte convergência entre PDI e proteínas da família das pequenas RhoGTPases e seus reguladores. Em VSMC com silenciamento da PDI, a presença do PDGF induziu uma redução na atividade de Rac1 e RhoA, sem alterar a expressão total destas proteínas. Estudos mostraram que a PDI colocaliza com Rac1 na região perinuclear e co-imunoprecipita com Rac1 e RhoA, tanto na presença como na ausência de PDGF. Além disso, ocorreu a interação entre PDI e o regulador de GTPases RhoGDI (inibidor da dissociação da guanina) na condição basal (por microscopia confocal e co-imunoprecipitação), diminuída após estimulo com PDGF. O silenciamento da PDI induziu ainda alterações em estrutura de citoesqueleto: desorganização das fibras de estresse, e redução no número e tamanho de adesões focais e vesículas de adesão marcadas por RhoGDI e Rac1. Assim, os dados apresentados no presente trabalho sugerem que a PDI sustenta a migração de VSMC dependente de sinalização redox e RhoGTPases. Além disso, RhoGTPases podem ser um alvo proximal importante mediando a convergência entre PDI e o complexo NADPH oxidase / Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) migration into vessel neointima is a therapeutic target for atherosclerosis and post-injury restenosis. NADPH oxidase-derived oxidants synergize with growth factors to support VSMC migration. We described interaction between NADPH oxidases and the endoplasmic reticulum redox chaperone Protein Disulfide Isomerase (PDI) in many cell types. However, physiological implications as well as mechanisms of such association are yet unclear. The aim of the present work was to investigate, througth experiments of gain or loss of PDI function, the importance of PDI in VSMC migration associated to NADPH oxidase. The specific aims were: i) to evaluate effects of PDI silencing or PDI overexpression in VSMC migration in vitro; ii) to evaluate effects of PDI silencing on PDGF-induced NADPH oxidase isoform expression and ROS production; iii) to evaluate the involvement of RhoGTPases on NADPH oxidase regulation by PDI. We show here that PDGF promoted subcellular redistribution of PDI concomitant to ROS production and that siRNA-mediated PDI silencing inhibited such ROS production, while near-totally suppressing the increase in Nox1 expression, with no change in Nox4. Furthermore, PDI silencing inhibited PDGF-induced VSMC migration assessed by distinct methods, while PDI overexpression increased spontaneous basal VSMC migration. To address possible mechanisms of PDI effects, we searched for PDI interactome by PPPI networks, which indicated convergence with small GTPases and their regulator RhoGDI. PDI silencing decreased PDGF-induced Rac1 and RhoA activities, without change in their expression. PDI displayed small detectable points of perinuclear co-localization with Rac1 and co-immunoprecipitated with Rac1 and RhoA in a PDGF-independent way. Moreover, there was PDI association with RhoGDI at baseline (confocal and co-immunoprecipitation), decreased after PDGF. Of note, PDI silencing promoted strong cytoskeletal changes: branched stress fiber disorganization, markedly decreased number of focal adhesions and reduced number of RhoGDI-containing vesicular recycling adhesion structures. Overall, these data suggest that PDI is required to support redox and GTPase-dependent VSMC migration. Moreover, RhoGTPases are a potential upstream target mediating the convergence between PDI and NADPH oxidase

A migração de células musculares lisas (VSMC) da camada média do vaso para a íntima é essencial para vasculogênese e contribui para o processo de aterosclerose e estenose após lesão por cateter-balão, caracterizando-se como um importante alvo terapêutico. Diversos trabalhos já demonstraram que fatores de crescimento (como PDGF e FGF) estimulam a migração de VSMC, inclusive, muitos desses fatores de crescimento induzem sinalização redox associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ex. Nox1 NADPH oxidase). Nosso grupo já descreveu interações físicas e regulação funcional da NADPH oxidase por uma chaperona redox do retículo endoplasmático, a Dissulfeto Isomerase Protéica (PDI). Contudo, tanto a relevância fisiológica como os mecanismos desta interação ainda não estão claros. O objetivo geral do presente trabalho é investigar por meio de experimentos de perda e ganho de função da PDI, a importância da PDI na migração celular associada à ativação do complexo NADPH oxidase, bem como possíveis mecanismos envolvidos na interação entre a PDI e esse complexo enzimático durante a migração celular. Os objetivos específicos são: i) avaliar o efeito do silenciamento da PDI, bem como da expressão forçada de PDI wild type na migração de VSMC in vitro; ii) analisar o efeito da transfecção de siRNA da PDI atividade e expressão de distintas isoformas da NADPH oxidase vascular e produção de ROS induzida por PDGF; iii) investigar o envolvimento de RhoGTPases na regulação do complexo NADPH oxidase pela PDI. No presente trabalho, mostramos que o PDGF induz redistribuição da PDI e aumento da produção de ROS. O silenciamento da PDI inibe a produção de ROS e a expressão do mRNA da Nox1, sem alterar a expressão do mRNA da Nox4. Mais ainda, o silenciamento da PDI reduz a migração celular induzida por PDGF, em diferentes modelos de migração, enquanto a super-expressão da PDI induz aumento espontâneo da migração na condição basal. Análise utilizando métodos de Biologia de Sistemas de redes de interação física proteína-proteína em bancos de dados e técnicas de análise de centralidade, topologia e ontologia gênica indicou forte convergência entre PDI e proteínas da família das pequenas RhoGTPases e seus reguladores. Em VSMC com silenciamento da PDI, a presença do PDGF induziu uma redução na atividade de Rac1 e RhoA, sem alterar a expressão total destas proteínas. Estudos mostraram que a PDI colocaliza com Rac1 na região perinuclear e co-imunoprecipita com Rac1 e RhoA, tanto na presença como na ausência de PDGF. Além disso, ocorreu a interação entre PDI e o regulador de GTPases RhoGDI (inibidor da dissociação da guanina) na condição basal (por microscopia confocal e co-imunoprecipitação), diminuída após estimulo com PDGF. O silenciamento da PDI induziu ainda alterações em estrutura de citoesqueleto: desorganização das fibras de estresse, e redução no número e tamanho de adesões focais e vesículas de adesão marcadas por RhoGDI e Rac1. Assim, os dados apresentados no presente trabalho sugerem que a PDI sustenta a migração de VSMC dependente de sinalização redox e RhoGTPases. Além disso, RhoGTPases podem ser um alvo proximal importante mediando a convergência entre PDI e o complexo NADPH oxidase / Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) migration into vessel neointima is a therapeutic target for atherosclerosis and post-injury restenosis. NADPH oxidase-derived oxidants synergize with growth factors to support VSMC migration. We described interaction between NADPH oxidases and the endoplasmic reticulum redox chaperone Protein Disulfide Isomerase (PDI) in many cell types. However, physiological implications as well as mechanisms of such association are yet unclear. The aim of the present work was to investigate, througth experiments of gain or loss of PDI function, the importance of PDI in VSMC migration associated to NADPH oxidase. The specific aims were: i) to evaluate effects of PDI silencing or PDI overexpression in VSMC migration in vitro; ii) to evaluate effects of PDI silencing on PDGF-induced NADPH oxidase isoform expression and ROS production; iii) to evaluate the involvement of RhoGTPases on NADPH oxidase regulation by PDI. We show here that PDGF promoted subcellular redistribution of PDI concomitant to ROS production and that siRNA-mediated PDI silencing inhibited such ROS production, while near-totally suppressing the increase in Nox1 expression, with no change in Nox4. Furthermore, PDI silencing inhibited PDGF-induced VSMC migration assessed by distinct methods, while PDI overexpression increased spontaneous basal VSMC migration. To address possible mechanisms of PDI effects, we searched for PDI interactome by PPPI networks, which indicated convergence with small GTPases and their regulator RhoGDI. PDI silencing decreased PDGF-induced Rac1 and RhoA activities, without change in their expression. PDI displayed small detectable points of perinuclear co-localization with Rac1 and co-immunoprecipitated with Rac1 and RhoA in a PDGF-independent way. Moreover, there was PDI association with RhoGDI at baseline (confocal and co-immunoprecipitation), decreased after PDGF. Of note, PDI silencing promoted strong cytoskeletal changes: branched stress fiber disorganization, markedly decreased number of focal adhesions and reduced number of RhoGDI-containing vesicular recycling adhesion structures. Overall, these data suggest that PDI is required to support redox and GTPase-dependent VSMC migration. Moreover, RhoGTPases are a potential upstream target mediating the convergence between PDI and NADPH oxidase