O objetivo do presente estudo foi avaliar a pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4%, em cultura de macrófagos da linhagem RAW 264.7, cultura primária de células da linhagem osteoblástica e em tecido subcutâneo de camundongos. Além disso, foi avaliada a atividade antimicrobiana desses materiais. Em cultura de macrófagos RAW 264.7 foram avaliados os seguintes aspectos: a viabilidade celular (Ensaio de MTT), propriedades imunoestimuladoras (dosagem de óxido nítrico) e propriedades antiinflamatórias (dosagem de óxido nítrico, TNF-α e IL-1α). Em cultura primária de células da linhagem osteoblástica foram avaliados viabilidade celular (períodos de 3, 7 e 10 dias), conteúdo de proteína total (Método de Lowry modificado nos períodos de 7 e 10 dias), atividade da fosfatase alcalina (liberação de timolftaleína nos períodos de 7 e 10 dias e in situ pelo método do Fast red), proteínas da matriz não-colágena (marcação por Imunofluorescência Indireta e Fluorescência Direta por meio da utilização da faloidina e DAPI, nos períodos de 3, 7 e 14 dias) e formações nodulares de matriz mineralizada (marcação pelo vermelho de Alizarina nos períodos de 3, 7 e 14 dias). A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio do teste de difusão em ágar, sobre 2 microrganismos indicadores (Enterococcus faecalis e Kocuria rhizophila). A biocompatibilidade após implantanção de tubos de polietileno contendo as pastas no tecido subcutâneo de camundongos isogênicos Balb/c. Os dados numéricos foram submetidos à análise estatística por meio do teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn, com nível de significância de 5%. Os resultados referentes à exposição das células da linhagem RAW 264.7 de macrófagos evidenciou baixa atividade imunoestimuladora da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina 0,4%, nas diferentes concentrações avaliadas. Por outro lado, pôde-se observar atividade antiinflamatória, com inibição na liberação de óxido nítrico e das citocinas (TNF-α e IL1-α), quando da utilização da associação hidróxido de cálcio e clorexidina na concentração de 25µg/ml. Resultados semelhantes ao controle foram observados após a avaliação da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4% em cultura primária de células da linhagem osteoblástica uma vez que os dados numéricos do conteúdo de proteína total, da quantidade de fosfatase alcalina e das formações nodulares de matriz mineralizada não foram estatisticamente diferentes (p>0,05). Em relação à caracterização morfológica das culturas primárias os resultados obtidos foram semelhantes quando comparou-se a pasta Calen®, associada ou não à clorexidina a 0,4%. Em relação à atividade antimicrobiana, a associação hidróxido de cálcio e clorexidina promoveu a formação de maiores halos de inibição (em mm), em relação ao Enterococcus faecalis, embora sem diferença estatística significante com os demais grupos avaliados (p>0,05). No tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos, a análise microscópica demonstrou ser esta associação biocompatível, com tecido circunjacente e reacional, apresentando fibrosamento discreto e semelhante ao tecido conjuntivo fibroso normal, aos 63 dias de avaliação, sem diferença estatística com grupo controle (p>0,05). Com base nas metodologias empregadas e nos resultados obtidos pode-se concluir que a adição da clorexidina não apresentou benefícios adicionais à pasta à base de hidróxido de cálcio. / The aim of this study was to evaluate the calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage, and mice subcutaneous tissue. Besides we evaluated the antimicrobial activity of those materials. In RAW 264.7 macrophages culture the followed aspects were evaluated: cellular viability (MTT assay), immunestimulatory (nitric oxide detection) and anti-inflammatory (nitric oxide, TNF-α and IL-1-α detection) properties. In primary cell culture of osteoblastic lineage we evaluated the cellular viability for 3, 7 and 10 days, total protein content (Lowry modified method for 7 and 10 days), alkalinic phosphatase activity (thymolphthalein liberation for 7 and 10 days, and in situ by Fast red method), extracellular matrix noncollagen protein (stained by indirect immunofluorescence and direct fluorescence by phalloidin and DAPI for 3, 7 and 14 days), and mineralized matrix nodular formation (stained by Alizarin red for 3, 7 and 14 days). Antimicrobial activity was evaluated by agar diffusion test with Enterococcus faecalis and Kocuria rhizophila as indicators, and the biocompatibility after polyethylene tubes with the paste implanted into Balb/c mice subcutaneous tissue. The data were statistically analyzed by Kruskal-Wallis test, followed by Dunn\'s post test, considering a level of significance of 5%. The results of macrophage RAW 264.7 cells lineage exposition showed low stimullatory activity for the different concentrations evaluated of calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. On the other hand, we could observe anti-inflammatory activity with inhibition of nitric oxide and cytokines quantification (TNF--α e IL1--α), after the use of 25-µg/ml calcium hydroxide associated to chlorhexidine (25-µg/ml). Same results to the control were observed after evaluation of Calen® paste associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage because the data of total protein content, alkaline phosphatase, and mineralized matrix nodular formation were not statistically different (p>0.05). In relation to the morphological characterization of primary culture, the results obtained were the same after comparison of Calen® paste, associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. About antimicrobial activity, the association Calcium hydroxide and chlorhexidine promoted formation of largest inhibition halo (in mm) for Enterococcus faecalis, but with no statistically significant with others evaluated groups (p>0.05). The microscopic analysis in mice conjunctive subcutaneous tissue demonstrated biocompatibility of that association with the around and reactional tissue, sowing a discret fibrosis, as well as the normal conjunctive fibrous tissue after 63 days of evaluation with no statistically difference with the control group (p>0.05). Based on the methodology used, and the results obtained in this work, we could conclude that the addition of chlorexidine showed no additional benefits to the calcium hydroxide-based paste.

O objetivo do estudo foi analisar a interação entre o laser de diodo de alta potência e a superfície radicular através da análise de: variação de temperatura (Fase A), morfologia superficial das raízes dentárias (Fase B), adesão e a proliferação de fibroblastos cultivados sobre estas superfícies (Fase C). Vinte e um dentes unirradiculares foram utilizados nas 3 fases dos experimentos. Os grupos experimentais foram: Grupo controle - só recebeu o tratamento inicial de raspagem e alisamento radicular; Grupo INT - recebeu o mesmo tratamento do controle seguido de irradiação com o laser de diodo de alta potência, com comprimento de onda de 808 nm e fibra óptica de 400 µm de diâmetro, posicionada paralela à superfície radicular no parâmetro de 1,5 W (597,1 W/cm 2 na ponta da fibra) durante 30 s no modo interrompido; e Grupo CW - onde foi usado o mesmo tratamento do grupo INT, porém com o laser no modo contínuo. Na fase A utilizaram-se termopares para monitorar a temperatura intrapulpar; na Fase B, microscopia eletrônica de varredura (MEV) das superfícies tratadas dos 3 grupos experimentais, e na Fase C, fibroblastos foram plaqueados sobre as superfícies tratadas e em eletromicrografias de varredura as células foram contadas em 24 (adesão), 48 e 72 h (proliferação) após o plaqueamento. A monitoração de temperatura demonstrou que, com os parâmetros utilizados, houve aumento de temperatura dentro dos limites biocompatíveis e que esse aumento foi significantemente maior no grupo CW do que no grupo INT. Nos grupos irradiados observou-se presença de smear-layer modificada, exibindo uma superfície com áreas de aspecto mais liso correspondendo às áreas de fusão e ressolidificação, entremeadas por zonas de aspecto mais corrugado. Túbulos dentinários abertos não foram observados. Os fibroblastos plaqueados sobre as superfícies irradiadas aderiram e aumentaram em número no decorrer do tempo experimental. As curvas de crescimento celular sobre as superfícies irradiadas com os dois modos do laser apresentaram comportamento biológico similar entre si e com o controle. Pode-se concluir, nas condições deste estudo, que o uso do laser de diodo de alta potência é seguro do ponto de vista térmico, e causa alterações morfológicas superficiais similares, independentemente dos modos de irradiação. Adicionalmente, essas superfícies radiculares irradiadas são biocompatíveis, possibilitando a adesão e a proliferação celular / The aim of this study was to analyze the interaction between the high power diode laser and the dental root surface through the temperature variation analysis (Step A), root surface morphological observation (Step B), adhesion and proliferation of fibroblasts cultured on the top of the root surfaces (Step C). Twenty-one uniradicular teeth were used in the 3 steps of the experiments. The experimental groups were, as follows: Control group - root planning and scaling using Gracey curets; INT group - the root surfaces received the same treatment as control group followed by laser irradiation (high power diode laser, wavelength 808 nm, 400 µm optical fiber used parallel to the root surface, 1,5 W for 30 s, 597,1 W/cm 2 ), and CW - treated as the INT group however in a continuous wave. For the step A thermocouples were used; for step B, scanning electron microscopy (SEM) of the treated root surfaces of the 3 experimental groups, and at the Step C, fibroblasts were plated on the top of the root surfaces, and in scanning electronmicrographs the attached cells were counted 24 (adhesion), 48 e 72 h (proliferation) after plating. The temperature monitorization showed that, with the parameters used, there was an increase in temperature within the biological safety limits and, this increase was significantly higher for the CW group. At the root surfaces of irradiated groups a modified smear-layer was observed exhibiting rough areas intermingled to smooth areas corresponding to areas of fusion and resolidification of dental hard tissues. Open dentinal tubules were not observed. The fibroblasts plated on the top of the irradiated surfaces adhered and proliferated throughout the experimental time (0 to 3 days). The growth curves of the irradiated groups, independently of the irradiation mode, showed biological behavior similar between them and with the control group. At the conditions of this study, we concluded that the use of high power diode laser for root surface conditioning is thermically safe and causes similar superficial morphological changes independently of the irradiation mode used. Additionally, these root surfaces are biocompatible because did not impair the cell adhesion and growth

As porfirinas e seus derivados têm sido, ao longo dos anos, alvos de vários campos diferentes de interesse, obtendo diversas aplicações, as quais tem aumentado constantemente com o decorrer dos anos. Dentre suas aplicações, uma das mais importantes se encontra no campo da Medicina moderna, sendo a principal na área de detecção e extirpação de tecidos modificados, a partir da Terapia Fotodinâmica (do termo inglês Photodynamic Therapy – PDT), apresentando resultados promissores. Em diversos processos biológicos, as porfirinas podem existir na forma monomérica ou na forma agregada. Entretanto, a agregação de porfirinas reduz sua eficiência nas aplicações em PDT devido a redução dos tempos de vida e rendimentos quânticos de produção dos estados excitados singleto e tripleto e levando, conseqüentemente, a redução na produção de oxigênio singleto. Diversos fatores influenciam o processo de agregação das porfirinas. Dentre eles, a interação eletrostática exerce um importante papel. A modulação dessa interação pode tanto estimular a agregação, quanto diminuir a probabilidade de formação dos agregados. Deste modo, condições externas, tais como pH, força iônica e especialmente a interação com sistemas microheterogêneos podem modificar essa interação e influenciar também nas características de agregação. Neste trabalho buscamos avaliar, através de diversos métodos espectroscópicos, os efeitos da interação das porfirinas meso-tetrakis (p-sulfonatofenil) porfirina (TPPS4), aniônica, e meso-tetrakis (4-N-metilpiridil) porfirina (TMPyP), catiônica, com sistemas microheterogêneos naturais e sintéticos (células “ghost" de eritrócitos e micelas) em função da sua própria estrutura, da estrutura destes sistemas e de fatores externos (concentração, pH, força iônica). O interesse principal foi dedicado aos efeitos dessa interação na formação de agregados das porfirinas. Foram analisadas as mudanças nas características fotofísicas e fotoquímicas destes compostos, tais como espectros de absorção, rendimentos quânticos e tempos de vida dos estados excitados singleto e tripleto, produção de oxigênio singleto, etc, visando obter informações sobre o comportamento coletivo dessas porfirinas, o que é muito importante para as suas possíveis aplicações em medicina, em particular na Terapia Fotodinâmica do câncer. Foi descoberto que a interação da porfirina aniônica TPPS4 com micelas de carga oposta ou na presença de alta força iônica em pH < pKa estimula a formação seqüencial de dois tipos de agregados: inicialmente são formados agregados H que após certo período se transformam em agregados J. A formação desses agregados altera os espectros de absorção, rendimentos quânticos e tempos de vida dos estados excitados singleto e tripleto e produção de oxigênio singleto. Foi observado que a interação com porfirinas altera a c.m.c dos tensoativos, reduzindo em até três ordens de grandeza o valor da c.m.c dos tensoativos de carga oposta à das porfirinas. Associamos esta c.m.c com a formação de micelas mistas porfirina+tensoativo. Foi também observado que a adição de NaCl no sistema porfirina+micelas ou porfirina+células ghost facilita a penetração da porfirina no interior da micela ou membrana, diminuindo assim a probabilidade de contato entre as porfirinas e o oxigênio, reduzindo a constante bimolecular de supressão do estado tripleto da porfirina pelo O2. A fim de avaliar a influência da estrutura dos fotossensibilizadores (FS) na sua fototoxicidade, comparamos o efeito fototóxico de ambas porfirinas e dois corantes bisciânicos em células de linhagem neoplásica HT29. Os resultados foram analisados levando em consideração as características de ligação dos FS, sua penetração e localização nas células HT29. A fototividade de ambas porfirinas em cultura celular demonstrou ser independente do tipo de suas cargas, apresentado um perfil de toxicidade muito similar. Os BCDs apresentaram uma elevada toxicidade em comparação com a das porfirinas. Observamos que as porfirinas e os BCDs possuem uma cinética de acumulação muito similar e períodos de ligação muito próximos (2h). Entretanto, o tempo e o local de internalização parecem ser dependentes tanto da estrutura quanto da carga do FS. Assim, os BCDs se internalizaram após apenas 2 horas e se localizaram preferencialmente nas mitocôndrias. Por outro lado, a TPPS4 localiza-se principalmente nos lisossomos enquanto que a TMPyP parece estar localizada na membrana celular, ambas com um tempo de internalização de 24 horas. Estes resultados podem explicar a elevada fototoxicidade dos BCDs observada em nossos experimentos. / During several decades the porphyrins and their derivatives continue of interest in different areas including various applications, the number of which is increasing with time. One of their most important applications is in modern medicine to detect and extirpate modified tissues, the photodynamic therapy (PDT) being the principle area, which demonstrates promising results. Taking part of various biological processes, the porphyrins may exist as monomers or aggregates. However, aggregation reduces their efficacy in PDT as it shortens their lifetimes and quantum yields of excited singlet and triplet states, thus reducing the production of singlet oxygen. There exist various factors, which may modify aggregation of the porphyrins, the electrostatic interaction being very important. Modulation of this interaction can stimulate aggregation or reduce the probability of the aggregate formation. So external conditions such as pH, ionic strength and interaction with microheterogeneous systems can modify this interaction and thus affect the aggregation characteristics. In this work we present the results received with the help of various spectroscopic techniques on interaction of anionic meso-tetrakis (p-sulfonatophenyl) (TPPS4) and cationic meso-tetrakis (4-N-methyl-pyrydiumil) (TMPyP) porphyrins with natural and synthetic microheterogeneous systems (“ghost" erythrocyte membranes and micelles) in function of their proper structure, the structure of these systems and the external factors (concentration, pH, ionic strength). The principle attention was paid to the effects of this interaction on aggregation of the porphyrins. We analyzed variations in the porphyrin photophysical and photochemical characteristics such as absorption spectra, quantum yields and lifetimes of excited singlet and triplet states, singlet oxygen production, etc., to look for the regularities in their collective behavior which is very important at their possible application in medicine, in PDT of cancer, in particular. We found that the interaction of the anionic porphyrin TPPS4 with micelles of the opposite charge or in the presence of high ionic strength at pH<pKa stimulated sequential formation of two types of aggregates: at the beginning H aggregates were formed which transformed with time in J type. Formation of the aggregates modified the porphyrin absorption spectra, their lifetimes and quantum yields of excited singlet and triplet states and the production of singlet oxygen, as well. We observed that the interaction with porphyrins reduced up to three orders of magnitude the c.m.c. values for surfactants with the charge opposite to that of the porphyrin. We attribute these reduced c.m.c. values to formation of mixed micelles (surfactant + porphyrin). We observed that in the presence of NaCl in the systems (porphyrin + micelle) or (porphyrin + “ghost" cells) the dye penetrated more easily the interior of the micelle or the membrane, reducing the probability of its contact with oxygen, and, hence, reducing the bimolecular constant of triplet suppression by O2. To evaluate the influence of the structure of photosensitizers (PS) on their phototoxicity we compared phototoxic effects of both porphyrins and two biscyanine dyes upon the neoplasic cells line HT29. The results were analyzed taking into account the characteristics of photosensitizer binding, penetration and localization in cells. The photoefficacy of both porphyrins was demonstrated independent of the type of their charge, their phototoxicities being very close. The BCDs demonstrated the elevated phototoxicity as compared with that of porphyrins. We observed that both porphyrins and BCDs possessed very close accumulation kinetics and their binding periods were similar (2 h). Nevertheless, the time of the PS entrance to the cell and their intracellular localization were shown to depend on their structure and charge. So, the BCDs entered the cell in two hours and were localized preferably in mitochondrias. The TPPS4 localized in lysosomes, while TMPyP seemed to prefer the cell membrane, the time of entrance for both being close to 24 hours. These results may explain higher BCDs phototoxicity observed in the experiments.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 5 uppsatser.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4%, em cultura de macrófagos da linhagem RAW 264.7, cultura primária de células da linhagem osteoblástica e em tecido subcutâneo de camundongos. Além disso, foi avaliada a atividade antimicrobiana desses materiais. Em cultura de macrófagos RAW 264.7 foram avaliados os seguintes aspectos: a viabilidade celular (Ensaio de MTT), propriedades imunoestimuladoras (dosagem de óxido nítrico) e propriedades antiinflamatórias (dosagem de óxido nítrico, TNF-&alpha; e IL-1&alpha;). Em cultura primária de células da linhagem osteoblástica foram avaliados viabilidade celular (períodos de 3, 7 e 10 dias), conteúdo de proteína total (Método de Lowry modificado nos períodos de 7 e 10 dias), atividade da fosfatase alcalina (liberação de timolftaleína nos períodos de 7 e 10 dias e in situ pelo método do Fast red), proteínas da matriz não-colágena (marcação por Imunofluorescência Indireta e Fluorescência Direta por meio da utilização da faloidina e DAPI, nos períodos de 3, 7 e 14 dias) e formações nodulares de matriz mineralizada (marcação pelo vermelho de Alizarina nos períodos de 3, 7 e 14 dias). A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio do teste de difusão em ágar, sobre 2 microrganismos indicadores (Enterococcus faecalis e Kocuria rhizophila). A biocompatibilidade após implantanção de tubos de polietileno contendo as pastas no tecido subcutâneo de camundongos isogênicos Balb/c. Os dados numéricos foram submetidos à análise estatística por meio do teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn, com nível de significância de 5%. Os resultados referentes à exposição das células da linhagem RAW 264.7 de macrófagos evidenciou baixa atividade imunoestimuladora da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina 0,4%, nas diferentes concentrações avaliadas. Por outro lado, pôde-se observar atividade antiinflamatória, com inibição na liberação de óxido nítrico e das citocinas (TNF-&alpha; e IL1-&alpha;), quando da utilização da associação hidróxido de cálcio e clorexidina na concentração de 25&micro;g/ml. Resultados semelhantes ao controle foram observados após a avaliação da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4% em cultura primária de células da linhagem osteoblástica uma vez que os dados numéricos do conteúdo de proteína total, da quantidade de fosfatase alcalina e das formações nodulares de matriz mineralizada não foram estatisticamente diferentes (p>0,05). Em relação à caracterização morfológica das culturas primárias os resultados obtidos foram semelhantes quando comparou-se a pasta Calen®, associada ou não à clorexidina a 0,4%. Em relação à atividade antimicrobiana, a associação hidróxido de cálcio e clorexidina promoveu a formação de maiores halos de inibição (em mm), em relação ao Enterococcus faecalis, embora sem diferença estatística significante com os demais grupos avaliados (p>0,05). No tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos, a análise microscópica demonstrou ser esta associação biocompatível, com tecido circunjacente e reacional, apresentando fibrosamento discreto e semelhante ao tecido conjuntivo fibroso normal, aos 63 dias de avaliação, sem diferença estatística com grupo controle (p>0,05). Com base nas metodologias empregadas e nos resultados obtidos pode-se concluir que a adição da clorexidina não apresentou benefícios adicionais à pasta à base de hidróxido de cálcio. / The aim of this study was to evaluate the calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage, and mice subcutaneous tissue. Besides we evaluated the antimicrobial activity of those materials. In RAW 264.7 macrophages culture the followed aspects were evaluated: cellular viability (MTT assay), immunestimulatory (nitric oxide detection) and anti-inflammatory (nitric oxide, TNF-&alpha; and IL-1-&alpha; detection) properties. In primary cell culture of osteoblastic lineage we evaluated the cellular viability for 3, 7 and 10 days, total protein content (Lowry modified method for 7 and 10 days), alkalinic phosphatase activity (thymolphthalein liberation for 7 and 10 days, and in situ by Fast red method), extracellular matrix noncollagen protein (stained by indirect immunofluorescence and direct fluorescence by phalloidin and DAPI for 3, 7 and 14 days), and mineralized matrix nodular formation (stained by Alizarin red for 3, 7 and 14 days). Antimicrobial activity was evaluated by agar diffusion test with Enterococcus faecalis and Kocuria rhizophila as indicators, and the biocompatibility after polyethylene tubes with the paste implanted into Balb/c mice subcutaneous tissue. The data were statistically analyzed by Kruskal-Wallis test, followed by Dunn\'s post test, considering a level of significance of 5%. The results of macrophage RAW 264.7 cells lineage exposition showed low stimullatory activity for the different concentrations evaluated of calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. On the other hand, we could observe anti-inflammatory activity with inhibition of nitric oxide and cytokines quantification (TNF--&alpha; e IL1--&alpha;), after the use of 25-&micro;g/ml calcium hydroxide associated to chlorhexidine (25-&micro;g/ml). Same results to the control were observed after evaluation of Calen® paste associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage because the data of total protein content, alkaline phosphatase, and mineralized matrix nodular formation were not statistically different (p>0.05). In relation to the morphological characterization of primary culture, the results obtained were the same after comparison of Calen® paste, associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. About antimicrobial activity, the association Calcium hydroxide and chlorhexidine promoted formation of largest inhibition halo (in mm) for Enterococcus faecalis, but with no statistically significant with others evaluated groups (p>0.05). The microscopic analysis in mice conjunctive subcutaneous tissue demonstrated biocompatibility of that association with the around and reactional tissue, sowing a discret fibrosis, as well as the normal conjunctive fibrous tissue after 63 days of evaluation with no statistically difference with the control group (p>0.05). Based on the methodology used, and the results obtained in this work, we could conclude that the addition of chlorexidine showed no additional benefits to the calcium hydroxide-based paste.

As porfirinas e seus derivados têm sido, ao longo dos anos, alvos de vários campos diferentes de interesse, obtendo diversas aplicações, as quais tem aumentado constantemente com o decorrer dos anos. Dentre suas aplicações, uma das mais importantes se encontra no campo da Medicina moderna, sendo a principal na área de detecção e extirpação de tecidos modificados, a partir da Terapia Fotodinâmica (do termo inglês Photodynamic Therapy – PDT), apresentando resultados promissores. Em diversos processos biológicos, as porfirinas podem existir na forma monomérica ou na forma agregada. Entretanto, a agregação de porfirinas reduz sua eficiência nas aplicações em PDT devido a redução dos tempos de vida e rendimentos quânticos de produção dos estados excitados singleto e tripleto e levando, conseqüentemente, a redução na produção de oxigênio singleto. Diversos fatores influenciam o processo de agregação das porfirinas. Dentre eles, a interação eletrostática exerce um importante papel. A modulação dessa interação pode tanto estimular a agregação, quanto diminuir a probabilidade de formação dos agregados. Deste modo, condições externas, tais como pH, força iônica e especialmente a interação com sistemas microheterogêneos podem modificar essa interação e influenciar também nas características de agregação. Neste trabalho buscamos avaliar, através de diversos métodos espectroscópicos, os efeitos da interação das porfirinas meso-tetrakis (p-sulfonatofenil) porfirina (TPPS4), aniônica, e meso-tetrakis (4-N-metilpiridil) porfirina (TMPyP), catiônica, com sistemas microheterogêneos naturais e sintéticos (células “ghost” de eritrócitos e micelas) em função da sua própria estrutura, da estrutura destes sistemas e de fatores externos (concentração, pH, força iônica). O interesse principal foi dedicado aos efeitos dessa interação na formação de agregados das porfirinas. Foram analisadas as mudanças nas características fotofísicas e fotoquímicas destes compostos, tais como espectros de absorção, rendimentos quânticos e tempos de vida dos estados excitados singleto e tripleto, produção de oxigênio singleto, etc, visando obter informações sobre o comportamento coletivo dessas porfirinas, o que é muito importante para as suas possíveis aplicações em medicina, em particular na Terapia Fotodinâmica do câncer. Foi descoberto que a interação da porfirina aniônica TPPS4 com micelas de carga oposta ou na presença de alta força iônica em pH < pKa estimula a formação seqüencial de dois tipos de agregados: inicialmente são formados agregados H que após certo período se transformam em agregados J. A formação desses agregados altera os espectros de absorção, rendimentos quânticos e tempos de vida dos estados excitados singleto e tripleto e produção de oxigênio singleto. Foi observado que a interação com porfirinas altera a c.m.c dos tensoativos, reduzindo em até três ordens de grandeza o valor da c.m.c dos tensoativos de carga oposta à das porfirinas. Associamos esta c.m.c com a formação de micelas mistas porfirina+tensoativo. Foi também observado que a adição de NaCl no sistema porfirina+micelas ou porfirina+células ghost facilita a penetração da porfirina no interior da micela ou membrana, diminuindo assim a probabilidade de contato entre as porfirinas e o oxigênio, reduzindo a constante bimolecular de supressão do estado tripleto da porfirina pelo O2. A fim de avaliar a influência da estrutura dos fotossensibilizadores (FS) na sua fototoxicidade, comparamos o efeito fototóxico de ambas porfirinas e dois corantes bisciânicos em células de linhagem neoplásica HT29. Os resultados foram analisados levando em consideração as características de ligação dos FS, sua penetração e localização nas células HT29. A fototividade de ambas porfirinas em cultura celular demonstrou ser independente do tipo de suas cargas, apresentado um perfil de toxicidade muito similar. Os BCDs apresentaram uma elevada toxicidade em comparação com a das porfirinas. Observamos que as porfirinas e os BCDs possuem uma cinética de acumulação muito similar e períodos de ligação muito próximos (2h). Entretanto, o tempo e o local de internalização parecem ser dependentes tanto da estrutura quanto da carga do FS. Assim, os BCDs se internalizaram após apenas 2 horas e se localizaram preferencialmente nas mitocôndrias. Por outro lado, a TPPS4 localiza-se principalmente nos lisossomos enquanto que a TMPyP parece estar localizada na membrana celular, ambas com um tempo de internalização de 24 horas. Estes resultados podem explicar a elevada fototoxicidade dos BCDs observada em nossos experimentos. / During several decades the porphyrins and their derivatives continue of interest in different areas including various applications, the number of which is increasing with time. One of their most important applications is in modern medicine to detect and extirpate modified tissues, the photodynamic therapy (PDT) being the principle area, which demonstrates promising results. Taking part of various biological processes, the porphyrins may exist as monomers or aggregates. However, aggregation reduces their efficacy in PDT as it shortens their lifetimes and quantum yields of excited singlet and triplet states, thus reducing the production of singlet oxygen. There exist various factors, which may modify aggregation of the porphyrins, the electrostatic interaction being very important. Modulation of this interaction can stimulate aggregation or reduce the probability of the aggregate formation. So external conditions such as pH, ionic strength and interaction with microheterogeneous systems can modify this interaction and thus affect the aggregation characteristics. In this work we present the results received with the help of various spectroscopic techniques on interaction of anionic meso-tetrakis (p-sulfonatophenyl) (TPPS4) and cationic meso-tetrakis (4-N-methyl-pyrydiumil) (TMPyP) porphyrins with natural and synthetic microheterogeneous systems (“ghost” erythrocyte membranes and micelles) in function of their proper structure, the structure of these systems and the external factors (concentration, pH, ionic strength). The principle attention was paid to the effects of this interaction on aggregation of the porphyrins. We analyzed variations in the porphyrin photophysical and photochemical characteristics such as absorption spectra, quantum yields and lifetimes of excited singlet and triplet states, singlet oxygen production, etc., to look for the regularities in their collective behavior which is very important at their possible application in medicine, in PDT of cancer, in particular. We found that the interaction of the anionic porphyrin TPPS4 with micelles of the opposite charge or in the presence of high ionic strength at pH<pKa stimulated sequential formation of two types of aggregates: at the beginning H aggregates were formed which transformed with time in J type. Formation of the aggregates modified the porphyrin absorption spectra, their lifetimes and quantum yields of excited singlet and triplet states and the production of singlet oxygen, as well. We observed that the interaction with porphyrins reduced up to three orders of magnitude the c.m.c. values for surfactants with the charge opposite to that of the porphyrin. We attribute these reduced c.m.c. values to formation of mixed micelles (surfactant + porphyrin). We observed that in the presence of NaCl in the systems (porphyrin + micelle) or (porphyrin + “ghost” cells) the dye penetrated more easily the interior of the micelle or the membrane, reducing the probability of its contact with oxygen, and, hence, reducing the bimolecular constant of triplet suppression by O2. To evaluate the influence of the structure of photosensitizers (PS) on their phototoxicity we compared phototoxic effects of both porphyrins and two biscyanine dyes upon the neoplasic cells line HT29. The results were analyzed taking into account the characteristics of photosensitizer binding, penetration and localization in cells. The photoefficacy of both porphyrins was demonstrated independent of the type of their charge, their phototoxicities being very close. The BCDs demonstrated the elevated phototoxicity as compared with that of porphyrins. We observed that both porphyrins and BCDs possessed very close accumulation kinetics and their binding periods were similar (2 h). Nevertheless, the time of the PS entrance to the cell and their intracellular localization were shown to depend on their structure and charge. So, the BCDs entered the cell in two hours and were localized preferably in mitochondrias. The TPPS4 localized in lysosomes, while TMPyP seemed to prefer the cell membrane, the time of entrance for both being close to 24 hours. These results may explain higher BCDs phototoxicity observed in the experiments.

Orientador: Maria Beatriz Puzzi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dinato_MarceloMattose_M.pdf: 4803476 bytes, checksum: eb9d2db304929302cdd47c38064634bb (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Grande parte das úlceras diabéticas em extremidades inferiores tem difícil cicatrização, representando a causa mais comum de amputação não traumática no mundo. Para pacientes sem resposta à terapêutica clássica como desbridamentos, curativos e antibioticoterapia sistêmica, pode ser excelente indicação a terapia celular. O propósito deste estudo foi avaliar a eficácia de implantes autólogos de células da pele (fibroblastos e queratinócitos) cultivadas "in vitro" e aplicadas com cola de fibrina autóloga em úlceras cutâneas crônicas de 5 pacientes diabéticos (4 DM2 e 1 DM1) com diagnóstico variando de 9 a 34 anos. Foram tratadas 6 úlceras de 4,0 a 36.62 cm2 de tamanho com duração de 4 meses a 20 anos, localizadas em membros inferiores, sem resposta a diversos tratamentos convencionais. Observou-se cicatrização completa em 5 úlceras (83,3%) entre 21 e 120 dias, sendo que a média dos Índices de Cicatrização das Úlceras (ICU) foi de 62%, 75%, 78% e 83%, no 30º; 60º; 90º e 120º dias de evolução, respectivamente. Existe uma correlação entre a velocidade de cicatrização, o tamanho da úlcera e o seu tempo de duração. Não ocorreram reações adversas decorrentes do tratamento. Concluiu-se que, a terapia celular (queratinócitos-fibroblastos) associada à cola de fibrina autóloga mostrou-se uma opção terapêutica eficaz, autóloga, de realização ambulatorial minimamente invasiva que acelerou significativamente o processo de cicatrização das úlceras diabéticas crônicas / Abstract: A great part of diabetic ulcers on the lower extremities have difficult healing and represent the most common cause of amputation worldwide. For patients unresponsive to the classical therapy with debridement, dressings and systemic antibiotic therapy, cell therapy may be an excellent indication. The objective of this study was to assess the efficacy of autologous skin cell (fibroblasts and keratinocytes) implants cultivated in vitro and applied with autologous fibrin glue to chronic skin ulcers of 5 diabetic patients (4 DM2 and 1 DM1) who had been diagnosed between 9 and 34 years before. There were 6 ulcers from 4.0 to 36.62 cm2 in size, with onset between 4 months and 20 years before, located on the lower limbs and unresponsive to several conventional treatments. Complete healing was observed in 5 ulcers (83.3%), after 21 to 120 days and the average of ulcer healing indices (UHI) were 62%, 75%, 78% and 83%, on the 30th, 60th, 90th and 120th days, respectively. There is a correlation between healing time, ulcer size and duration. No adverse reactions derived from the treatment occurred. It was concluded that cell therapy (keratinocytes, fibroblasts) associated with autologous fibrin glue proved to be an effective therapeutic option, minimally invasive and performed on an outpatient basis, that has significantly accelerated the healing of chronic diabetic ulcers / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

O objetivo do estudo foi analisar a interação entre o laser de diodo de alta potência e a superfície radicular através da análise de: variação de temperatura (Fase A), morfologia superficial das raízes dentárias (Fase B), adesão e a proliferação de fibroblastos cultivados sobre estas superfícies (Fase C). Vinte e um dentes unirradiculares foram utilizados nas 3 fases dos experimentos. Os grupos experimentais foram: Grupo controle - só recebeu o tratamento inicial de raspagem e alisamento radicular; Grupo INT - recebeu o mesmo tratamento do controle seguido de irradiação com o laser de diodo de alta potência, com comprimento de onda de 808 nm e fibra óptica de 400 µm de diâmetro, posicionada paralela à superfície radicular no parâmetro de 1,5 W (597,1 W/cm 2 na ponta da fibra) durante 30 s no modo interrompido; e Grupo CW - onde foi usado o mesmo tratamento do grupo INT, porém com o laser no modo contínuo. Na fase A utilizaram-se termopares para monitorar a temperatura intrapulpar; na Fase B, microscopia eletrônica de varredura (MEV) das superfícies tratadas dos 3 grupos experimentais, e na Fase C, fibroblastos foram plaqueados sobre as superfícies tratadas e em eletromicrografias de varredura as células foram contadas em 24 (adesão), 48 e 72 h (proliferação) após o plaqueamento. A monitoração de temperatura demonstrou que, com os parâmetros utilizados, houve aumento de temperatura dentro dos limites biocompatíveis e que esse aumento foi significantemente maior no grupo CW do que no grupo INT. Nos grupos irradiados observou-se presença de smear-layer modificada, exibindo uma superfície com áreas de aspecto mais liso correspondendo às áreas de fusão e ressolidificação, entremeadas por zonas de aspecto mais corrugado. Túbulos dentinários abertos não foram observados. Os fibroblastos plaqueados sobre as superfícies irradiadas aderiram e aumentaram em número no decorrer do tempo experimental. As curvas de crescimento celular sobre as superfícies irradiadas com os dois modos do laser apresentaram comportamento biológico similar entre si e com o controle. Pode-se concluir, nas condições deste estudo, que o uso do laser de diodo de alta potência é seguro do ponto de vista térmico, e causa alterações morfológicas superficiais similares, independentemente dos modos de irradiação. Adicionalmente, essas superfícies radiculares irradiadas são biocompatíveis, possibilitando a adesão e a proliferação celular / The aim of this study was to analyze the interaction between the high power diode laser and the dental root surface through the temperature variation analysis (Step A), root surface morphological observation (Step B), adhesion and proliferation of fibroblasts cultured on the top of the root surfaces (Step C). Twenty-one uniradicular teeth were used in the 3 steps of the experiments. The experimental groups were, as follows: Control group - root planning and scaling using Gracey curets; INT group - the root surfaces received the same treatment as control group followed by laser irradiation (high power diode laser, wavelength 808 nm, 400 µm optical fiber used parallel to the root surface, 1,5 W for 30 s, 597,1 W/cm 2 ), and CW - treated as the INT group however in a continuous wave. For the step A thermocouples were used; for step B, scanning electron microscopy (SEM) of the treated root surfaces of the 3 experimental groups, and at the Step C, fibroblasts were plated on the top of the root surfaces, and in scanning electronmicrographs the attached cells were counted 24 (adhesion), 48 e 72 h (proliferation) after plating. The temperature monitorization showed that, with the parameters used, there was an increase in temperature within the biological safety limits and, this increase was significantly higher for the CW group. At the root surfaces of irradiated groups a modified smear-layer was observed exhibiting rough areas intermingled to smooth areas corresponding to areas of fusion and resolidification of dental hard tissues. Open dentinal tubules were not observed. The fibroblasts plated on the top of the irradiated surfaces adhered and proliferated throughout the experimental time (0 to 3 days). The growth curves of the irradiated groups, independently of the irradiation mode, showed biological behavior similar between them and with the control group. At the conditions of this study, we concluded that the use of high power diode laser for root surface conditioning is thermically safe and causes similar superficial morphological changes independently of the irradiation mode used. Additionally, these root surfaces are biocompatible because did not impair the cell adhesion and growth

La présence d’un récepteur de type RXR a récemment été rapporté chez la pensée de mer, Renilla koellikeri, de même que chez d’autres anthozoaires, et le NO semble jouer des différents rôles physiologiques, chez plusieurs cnidaires. L’acide rétinoïque (AR) et le monoxyde d’azote (NO) sont connus pour leur implication dans l’induction de la croissance des neurites chez les vertébrés ainsi que chez les invertébrés. Mais jusqu’à présent, aucun rôle de ces agents n’a encore été identifié chez ce phylum ancien des invertébrés. Dans le but de montrer que ces agents morphogénétiques ont un rôle dans le développement neuronal chez ces ancêtres des métazoaires bilatéraux, nous avons utilisé des cultures primaires de cellules du cnidaire anthozoaire Renilla koellikeri (pensée de mer), doté d’un système nerveux des plus primitif. Nous avons trouvé que les deux types d’acide rétinoïque, 9-cis et 11-trans, induisent une prolifération cellulaire dose-dépendante en fonction du temps dans les boîtes de pétri enduites de polylysine. Les cultures cellulaires exposées à l’acide rétinoïque dans les boîtes sans polylysine montrent une différenciation en des cellules épithéliales. D’autre part, le NO induit exclusivement une différenciation neuronale dans les boîtes enduites de polylysine. Aucun autre type de cellules subit un différenciation en présence de NO et la densité des cellules dédifférenciées a diminué. Les prolongements des neurones différenciés semblent s’enchevêtrer et former un réseau neuronal assez dense. L’ensemble de ces observations suggère que l’acide rétinoïque, contrairement à NO, est associé à l’activité mitotique, et que l’acide rétinoïque et le NO sont impliqués différemment dans la spécification cellulaire, respectivement épithéliale et neuronale, chez la pensée de mer. Le type d’action déclenchée, qu’il soit la mitogénèse ou la différenciation (épithéliale ou neuronale), varie alors selon l’état d’adhésion des cellules au substrat. Comme les données moléculaires et paléontologiques rapprochent les cnidaires, telle la pensée de mer, des ancêtres des eumétazoaires, nos résultats suggèrent que le rôle morphogénétique de l’acide rétinoïque et du NO est enraciné dans l’ancêtre commun de tous les métazoaires. / Retinoic acid receptors were recently reported in the sea pansy, Renilla koellikeri, and in other anthozoans, and NO seems to play various roles in several cnidarians. Retinoic acid (RA) and nitric oxide (NO) are known for their implication in inducing neurite outgrowth in both vertebrates and invertebrates. But so far, no role of these agents has been identified in this basal metazoan phylum. In order to show that these agents have a morphogenetic role in neuronal development in the ancestors of bilateral metazoan. We used primary cultures of cells from the cnidarian anthozoan Renilla koellikeri (sea pansy), with the most primary nervous system. We found that both 9-cis and 11-trans retinoic acid induced cell proliferation in dose- and time-dependant manners in petri dishes coated with polylysine. Cell cultures exposed to retinoic acid in dishes devoid of polylysine were observed to differentiate into epithelial cells. On the other hand, NO induced extensive neurite outgrowth in polylysine-coated culture dishes. No other celle type underwent differentiation in the presence of NO, and the density of dedifferentiated cells was reduced. The neurites of the differentiating neurons appeared to intertwine and form a loose nerve net. These observations suggest that retinoic acid, but not NO, has mitogenic activity, and that retinoic acid and NO are differentially involved in nerve cell specification in the sea pansy. The type of action, mitogenesis or cell differenciation (epithelial or neural), depends on the degree of cell adhesion to substrate. As both molecular and paleontological evidence place cnidarians such as the sea pansy closest to the eumetazoan ancestor, our results suggest that the morphogenetic role of retinoic acid and NO was rooted in the commun ancestor of all metazoans.

La présence d’un récepteur de type RXR a récemment été rapporté chez la pensée de mer, Renilla koellikeri, de même que chez d’autres anthozoaires, et le NO semble jouer des différents rôles physiologiques, chez plusieurs cnidaires. L’acide rétinoïque (AR) et le monoxyde d’azote (NO) sont connus pour leur implication dans l’induction de la croissance des neurites chez les vertébrés ainsi que chez les invertébrés. Mais jusqu’à présent, aucun rôle de ces agents n’a encore été identifié chez ce phylum ancien des invertébrés. Dans le but de montrer que ces agents morphogénétiques ont un rôle dans le développement neuronal chez ces ancêtres des métazoaires bilatéraux, nous avons utilisé des cultures primaires de cellules du cnidaire anthozoaire Renilla koellikeri (pensée de mer), doté d’un système nerveux des plus primitif. Nous avons trouvé que les deux types d’acide rétinoïque, 9-cis et 11-trans, induisent une prolifération cellulaire dose-dépendante en fonction du temps dans les boîtes de pétri enduites de polylysine. Les cultures cellulaires exposées à l’acide rétinoïque dans les boîtes sans polylysine montrent une différenciation en des cellules épithéliales. D’autre part, le NO induit exclusivement une différenciation neuronale dans les boîtes enduites de polylysine. Aucun autre type de cellules subit un différenciation en présence de NO et la densité des cellules dédifférenciées a diminué. Les prolongements des neurones différenciés semblent s’enchevêtrer et former un réseau neuronal assez dense. L’ensemble de ces observations suggère que l’acide rétinoïque, contrairement à NO, est associé à l’activité mitotique, et que l’acide rétinoïque et le NO sont impliqués différemment dans la spécification cellulaire, respectivement épithéliale et neuronale, chez la pensée de mer. Le type d’action déclenchée, qu’il soit la mitogénèse ou la différenciation (épithéliale ou neuronale), varie alors selon l’état d’adhésion des cellules au substrat. Comme les données moléculaires et paléontologiques rapprochent les cnidaires, telle la pensée de mer, des ancêtres des eumétazoaires, nos résultats suggèrent que le rôle morphogénétique de l’acide rétinoïque et du NO est enraciné dans l’ancêtre commun de tous les métazoaires. / Retinoic acid receptors were recently reported in the sea pansy, Renilla koellikeri, and in other anthozoans, and NO seems to play various roles in several cnidarians. Retinoic acid (RA) and nitric oxide (NO) are known for their implication in inducing neurite outgrowth in both vertebrates and invertebrates. But so far, no role of these agents has been identified in this basal metazoan phylum. In order to show that these agents have a morphogenetic role in neuronal development in the ancestors of bilateral metazoan. We used primary cultures of cells from the cnidarian anthozoan Renilla koellikeri (sea pansy), with the most primary nervous system. We found that both 9-cis and 11-trans retinoic acid induced cell proliferation in dose- and time-dependant manners in petri dishes coated with polylysine. Cell cultures exposed to retinoic acid in dishes devoid of polylysine were observed to differentiate into epithelial cells. On the other hand, NO induced extensive neurite outgrowth in polylysine-coated culture dishes. No other celle type underwent differentiation in the presence of NO, and the density of dedifferentiated cells was reduced. The neurites of the differentiating neurons appeared to intertwine and form a loose nerve net. These observations suggest that retinoic acid, but not NO, has mitogenic activity, and that retinoic acid and NO are differentially involved in nerve cell specification in the sea pansy. The type of action, mitogenesis or cell differenciation (epithelial or neural), depends on the degree of cell adhesion to substrate. As both molecular and paleontological evidence place cnidarians such as the sea pansy closest to the eumetazoan ancestor, our results suggest that the morphogenetic role of retinoic acid and NO was rooted in the commun ancestor of all metazoans.