Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Physiologie, Biologie des organismes, populations, interactions : Lille 2 : 2008. / Résumé en français et en anglais. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 143-175.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les Hedgehogs (Hhs) sont des morphogènes indispensables au développement et à l'homéostasie de l'organisme, notamment dans la formation de l'intestin. La littérature y révèle l'importance d'Indian Hh dans le contrôle de la prolifération, de la différenciation des entérocytes et dans l'attraction des cellules immunitaires. Par contre, sa délétion ne récapitule pas l'inhibition de la voie Hh, soulevant ainsi l'hypothèse que Sonic Hh aurait des rôles complémentaires dans l'intestin. Nous avons donc voulu identifier les implications de Shh dans l'histologie, la prolifération et la différenciation de l'épithélium intestinal chez la souris adulte. Pour ce faire, nous avons utilisé le système de délétion conditionnelle Cre/loxP afin d'abolir l'expression de Shh au niveau de l'épithélium de l'intestin et du côlon, à l'aide du promoteur de la Villine . Des traitements au DSS sur 7 jours ont permis de simuler une colite ulcéreuse (CU) chez les animaux afin d'étudier les maladies inflammatoires intestinales (MII). Aucune anomalie histologique n'a été observée par coloration H&E, mais l'axe crypte-villosité était réduit de 16%. Une immunofluorescence dirigée contre PCNA relie ce résultat avec une réduction de 24% du nombre de cellules prolifératives dans l'iléon. Ensuite, Shh ne serait pas impliqué dans la différenciation des entérocytes et des cellules entéroendocrines, contrairement à Ihh. Par contre, les observations montrent une diminution de l'expression de Klf4 en qPCR et un défaut dans l'ultrastructure des vésicules de sécrétion des cellules caliciformes en microscopie électronique. La production des mucines acides et leur fucosylation sont aussi affectées par coloration. Il en résulte un défaut dans la sécrétion de la bicouche de mucus procurant une défense physique. Ensuite, une diminution de l'expression de Sox9 et de la taille des granules dans les cellules de Paneth est observée en absence de Shh. Une diminution de l'autophagie, associée à un réticulum endoplasmique relâché, semble être à la base de ce phénotype en immunobuvardage. Il en résulte un défaut dans la production des agents antimicrobiens, tels que le lysozyme et les a-défensines, en qPCR, suggérant un possible défaut dans la défense antimicrobienne. Bien que les altérations de la barrière intestinale laissent supposer un rôle dans l'inflammation, les souris expérimentales soumises au traitement DSS suggèrent que Shh ne module pas le développement de la CU mais pourrait avoir un rôle dans les étapes de restitution. Finalement, le niveau d'expression des effecteurs Hhs en qPCR lors des Mn et de la CU chez les souris de type sauvage révèle qu'Ihh et Glil sont fortement réduits dans ces pathologies. Les résultats obtenus démontrent que Shh et Ihh ont des rôles distincts dans l'intestin. Shh semble influencer positivement la prolifération et participe à la différenciation terminale des cellules caliciformes et de Paneth ainsi que dans le processus d'autophagie. Ensemble, les Hhs sont essentiels à l'homéostasie et sont impliqués dans la pathologie des MII.

La réparation du muscle squelettique est possible grâce aux cellules satellites et aux cellules stromales résidentes (mrSC), responsables de la régénération myogénique et du remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) respectivement. Le maintien à l’état quiescent et la différenciation de ces cellules sont finement régulés par les signaux provenant de leur microenvironnement, aussi appelé niche. Nous avons posé l’HYPOTHÈSE selon laquelle les altérations de ce microenvironnement se répercutent sur le comportement des cellules progénitrices et modulent leur capacité à régénérer le muscle squelettique. Le muscle âgé est caractérisé par la présence de tissu adipeux, une accumulation excessive de MEC (fibrose) ainsi qu’un faible potentiel régénératif. Nous avons donc caractérisé les cellules progénitrices présentes dans le muscle âgé. Nos résultats montrent que les cellules progénitrices myogéniques (CPM) du muscle âgé tendent à se différencier plutôt qu’à proliférer. De plus, nous avons montré une augmentation de la population des mrSC dans le muscle âgé, pouvant expliquer la présence plus importante de tissu adipeux et de MEC. Le muscle de souris dystrophique est caractérisé par des cycles perpétuels de dégénérescence/régénération conduisant à une fibrose du tissu. Puisqu’une modulation de la voie Wnt canonique est responsable de la fibrose de différents organes, nous avons caractérisé son implication dans le muscle des souris dystrophiques. Nous avons montré que l’activation de cette voie induit une augmentation de la prolifération des mrSC ainsi que de leur synthèse de collagène in vitro et in vivo. À l’opposé, l’inhibition de l’activité Wnt canonique induit une diminution de la population des mrSC et du dépôt fibreux. En somme, la voie Wnt canonique favorise la fibrose du muscle dystrophique par l’intermédiaire des mrSC. Des études récentes ont montré que des modifications biomécaniques du microenvironnement peuvent altérer les propriétés souches des CPM. Nous avons examiné l’influence de la rigidité du microenvironnement sur le comportement des CPM. Des analyses en microscopie à force atomique ont montré que la perte de tension des fibres ex vivo causait une légère augmentation de la rigidité du microenvironnement des cellules satellites, favorable à leur prolifération. Nous avons corrélé ces résultats avec une approche in vivo où l’on a causé la perte de tension des fibres par ténotomie. Nos conclusions suggèrent que la rigidité du microenvironnement influence l’activation des cellules satellites et leur état prolifératif. Ces observations ont été mises à profit afin de développer une méthode originale pour isoler les CPM. Celle-ci permet d’obtenir rapidement et à partir de seulement quelques fibres, un nombre important de CPM hautement purifié. En résumé, ces travaux ont permis une meilleure compréhension des facteurs présents dans le microenvironnement des cellules progénitrices et contribuants à la réparation du muscle squelettique.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [156]-175. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 75-80. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches adultes qui sont à l’origine des cellules des lignages ostéoblastique (O), adipocytaire (A) et chondroblastique (C). Les CSM ont initialement trouvées dans la moelle osseuse mais il en existe également dans d’autres tissus comme le sang de cordon ombilical (SCO). Dotées d’un potentiel régénératif, les CSM peuvent utilisées dans diverses pathologies dégénératives dans un but de réparation tissulaire. En outre, leurs propriétés immunosuppressives ont conduit à envisager leur utilisation dans un but d’immunomodulation comme lors des réactions de greffon contre l’hôte dans les greffes de cellules souches hématopoïétiques (CSH) allo-géniques. Le but essentiel de ce travail a été de comparer les caractéristiques des CSM issues du SCO en comparaison de celles issues de la moelle osseuse (MO). Dans l’optique d’applications en médecine régénérative, nous avons tout d’abord testé la possibilité d’utiliser, dans les milieux de culture d’expansion des CSM de SCO et de MO, un lysat plaquettaire d’origine humaine (HPL) comme substitut au sérum de veau fœtal (SVF) source possible de contaminations. / The mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells which are at the origin of the ostebiastic lignage cells (O), adipocytes (A) and chondrobiasts (C). The MSC are initially found in the bone marrow (BM) but it also exists there in other tissues as the umbilical cord blood (UCB).Endowed with a regenerative potential, MSC can used in diverse degenerative pathologies in a purpose of tissular repair. Besides, their immunosuppressive properties allowed to envisage their use in a purpose of immunomodulation as during the reactions of transplant against the host in allogenic hematopoietic stem cell transplants (HSC). The essential purpose of this work was to compare the characteristics of the MSC derived from the UCB in comparison to those stemming from the bone marrow (BM).

La physiopathologie artérielle comprend différentes pathologies telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hyperplasie intimale qui sont caractérisées par un remodelage artériel en réponse à différents stress environnementaux. Mon travail de thèse s'est intéressé à décrire les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu en réponse à un stress artériel dans des modèles murins et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention des dommages artériels. Ainsi, nous nous sommes intéressés au rôle d'une isoforme particulière de la famille des phosphoinositide 3-kinase, la PI3Ky. Cette protéine est largement exprimée dans le compartiment hématopoïétique, où son activité catalytique intervient dans l'inflammation de la paroi artérielle, mais elle est également présente à de plus faible niveau dans les CML et les CE. Associée à son rôle catalytique largement impliqué dans la migration et la libération de facteurs inflammatoires, la PI3Ky a été décrite comme ayant des fonctions non-catalytiques, dite " d'ancrage ", activant des phosphodiestérases (PDE). Ainsi, en utilisant deux modèles murins génétiquement modifiés pour la PI3Ky, l'un délété pour la PI3Ky (PI3KyKO pour knockout) et l'autre exprimant une forme inactive de la PI3Ky (PI3KyKD pour kinase dead) nous avons pu évaluer le rôle des 2 fonctions dans des modèles murins de lésions artérielle. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle non-catalytique de la PI3Ky dans les CML. A partir d'un modèle murin de remodelage artériel induit par un stress hypertenseur nous avons observé que l'hyperplasie médiale des CML est dépendante de la PI3Ky, mais indépendante de son activité catalytique. In vitro à partir de cultures primaires de CML de souris nous avons démontré que la PI3Ky régule l'activité des PDE indépendamment de son activité, limitant les taux intracellulaires d'AMPc qui est un puissant frein de la prolifération des CML. Ces modèles nous ont aussi permis de tester une stratégie thérapeutique originale utilisant un peptide perméant inhibant l'interaction PI3Ky/PDE. Ce peptide est capable de prévenir à la fois la prolifération des CML in vitro mais aussi l'hyperplasie médiale in vivo. Dans un deuxième temps, nous avons étudié comment l'activité PI3Ky inflammatoire, inhibe la cicatrisation endothéliale suite à une lésion endovasculaire. A l'aide de différents modèles in vivo et ex vivo de réendothélialisation chez la souris, nous avons pu observer que suite à une lésion vasculaire l'activité de PI3Ky des lymphocytes T induit la sécrétion d'IFNy, entrainant une production locale de CXCL10 par les CML. Cette chimiokine va directement inhiber la cicatrisation endothéliale, indépendamment du compartiment immun. Ces travaux ont permis d'une part de démontrer que l'inhibition de la PI3Ky représentait une stratégie thérapeutique envisageable dans les complications de l'angioplastie mais ont également permis de montrer les mécanismes d'interactions cellulaires complexes mis en jeu lors d'une agression artérielle. Ils ont notamment permis de démontrer un rôle central de la CML agissant comme un relai entre l'inflammation adventitielle et l'endothélium. L'ensemble de ces données a pu mettre en avant une double fonction de la PI3Ky dans les processus de réponse à un stress inflammatoire ou hémodynamique. D'une part, son rôle pro-inflammatoire contrôlé par son activité catalytique, responsable d'une inhibition de la cicatrisation endothéliale via l'activation des CML. D'autre part, son rôle non-catalytique dans les CML, modulant leur prolifération via la signalisation de l'AMPc. Ces travaux permettent d'envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant d'une part à inhiber son activité en utilisant des inhibiteurs hautement spécifiques pour cette isoforme et d'autre part des peptides capables de bloquer le rôle non catalytique de la PI3Ky. / Cardiovascular diseases represent the first cause of death worldwide and a large part of them concerns different arterial disorders as hypertension, atherosclerosis, intimal hyperplasia and aneurism. All of these diseases are characterized by arterial remodeling resulting in a complex collaboration between environment and arterial physiology participants: Blood flow, endothelial cells (EC), smooth muscle cells (SMC) and arterial inflammation. In this context, this thesis project is interested in y-isoform of phosphoinositide 3-kinase (PI3Ky). PI3Ky is largely expressed in hematopoietic compartment where its catalytic activity drives arterial wall inflammation, but it is also lower expressed in cardiovascular system such as SMC and EC. Moreover, in addition to catalytic function implicated in chemoattraction and release of inflammatory mediators, PI3Ky has been described to activate phosphodiesterases (PDE) activity, through a non-catalytic "docking" function. At first, this work studied studied non-catalytic docking function of PI3Ky in SMC. Using hypertension-induced arterial remodeling in mice showed that SMC hyperplasia was dependent of PI3Ky protein expression but independent of its activity. Further, in vitro exploration with primary-SMC from mice aorta highlighted that PI3Ky activates PDE independently of its catalytic function, which promotes SMC proliferation by hydrolysis of an anti-mitotic second messenger: the cyclic-AMP. In the same approach, we tested original therapeutic strategy using a permeant-peptide which inhibits PI3Ky/PDE interaction. This permeant-peptide showed good efficiency to prevent both in vitro SMC proliferation and in vivo arterial SMC hyperplasia. The second part of this work how PI3Ky activity in inflammatory cells modulates endothelial healing following endovascular injury. Using in vivo and ex vivo models of arterial de-endothelialization in mouse, we observed a cellular cross talk in arterial wall between T-cells, SMC and EC. PI3Ky activity in T-cells promotes IFNy secretion following arterial injury which indirectly decreases re-endothelialization through a local secretion of CXCL10 by SMC. Indeed, CXCL10 directly inhibits endothelial healing independently of immune compartment. Our findings provide a new promising target to promote endothelial repair and therefore prevent cardiovascular events following endovascular intervention.Altogether, these works unravel an interesting dual function of PI3Ky in arterial stress response. In one hand, catalytic function of PI3Ky drives inflammatory-induced inhibition of endothelial healing, and in other hand, non-catalytic function controls SMC proliferation via inhibition of cyclic-AMP pathway.