L’augmentation de la fréquence des pathologies vasculaires va créer ces prochaines années, des besoins importants en substituts vasculaires de petits calibres. L’idéal, à ce jour, reste l’utilisation de vaisseaux autologues réduisant les risques infectieux et immunologiques mais d’usage limité ce qui est à l’origine de l’ingénierie cellulaire. L’identification des progéniteurs vasculaires est d’un intérêt majeur dans ce domaine. Ces cellules d’origine autologues sont douées d’une grande capacité de prolifération et d’un potentiel de différenciation en cellules vasculaires (cellules endothéliales (CE) et cellules musculaires lisses (CML)) mais la difficulté réside dans le choix du recouvrement de la surface du support de culture qui favorise leur adhésion et prolifération Dans ce travail, nous avons choisi les films multicouches de polyélectrolytes et mesuré leur impact sur le comportement de ces cellules progénitrices en fonction de différentes conditions de culture (normoxie ou hypoxie). Nous avons montré dans un premier temps, que ces films multicouches de polyélectrolytes permettaient d’accélérer la différenciation de ces cellules en CE matures. Nous avons également montré que ces mêmes cellules cultivées en hypoxie étaient capables de se différencier en cellules contractiles stables dans le temps, présentant un phénotype comparable à celui des CML matures. L’association de ces résultats additionnés aux avantages apportés par des feuillets détachables est à la base de la construction d’un substitut vasculaire autologue de petit calibre, composé de CE et de CML issues d’un même pool de cellules, mais cultivées dans des conditions différentes. / The increase of vascular pathologies is going to create these next years, important needs in vascular substitutes of small calibres. The gold standard, this day, remains the use of autologous vessels reducing the infectious and immunological risks, but of limited custom, which is at the origin of tissue engineering. The identification of vascular progenitor cells is of major interest in vascular engineering. These autologous cells present a high capacity of proliferation and a potential of differentiation in vascular cells (endothelial cells (EC) and smooth muscle cells (SMC)) but the difficulty lies in the choice of the coated surface of culture which facilitates their adhesion and proliferation. In this work, we chose polyelectrolytes multilayer films and measured their impact on these vascular progenitor cells in various conditions of culture (normoxia or hypoxia). We showed at first, that these polyelectrolytes multilayer films allowed to accelerate the differentiation of these cells into matures EC. We also showed that these same cells cultivated under hypoxic conditions were able to differentiate into stable and contractile cells, presenting a phenotype comparable to the mature SMC. The association of these results added to the advantages brought by detachable sheet is the basis of the construction of an autologous small calibre vascular substitute consisting of EC and SMC differentiated from the same pool of cells, but cultivated in different conditions.

Des études récentes ont relevés que les CSMn pouvaient être in vivo des cellules périvasculaires avec des caractéristiques des péricytes. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons cultiver des CSMn issues de MO dans des conditions spécifiques pour l'expansion des péricytes puis nous avons testé leur potentiel de souchitude. De plus, nous les avons comparées avec des CSMs cultivées dans des conditions standards en maintenant les même donneurs. Des échantillons de MO ont été cultivés dans un milieu pro-Pericytaires (milieu EGM2) ou dans un milieu standard. Après culture, les cellules ont été caractérisées. Les cellules de caractère péricytaire avaient exprimé une upregulation des marqueurs de souchitude d’OCT4, NANOG et SOX2 pour un potentiel neuronal. Ces cellules ont démontré un grand potentiel in vivo. / Native mesenchymal stem cells were found tore perivascular cells with pericyte features. This suggests that pericyte phenotype is crucial for the stenness of MSC. We cultured MSC from bone marrow upon in vitro conditions (EGM2 versus standard mediums). They all express MSC, markers and character. Cells cultivated into ECM2 were found to be more immature than cells obtained from standard conditions (expressed OCT4, NANOG and SOX2), with high neuronal and engraftment potential

Le travail rapporté dans ce manuscrit s’inscrit dans la perspective de mieux comprendre les propriétés électriques des tissus biologiques dans la gamme de fréquence allant de 10 kHz à 100 MHz. La connaissance de ces propriétés est essentielle pour évaluer les effets du champ électromagnétique sur le corps humain en cas d’exposition involontaire mais aussi pour diagnostiquer un changement physiologique quand le tissu est exposé volontairement. De nombreux travaux ont été effectués pour mesurer les propriétés électriques des différents tissus mais le comportement électrique relevé n’est pas toujours bien compris en raison de la complexité de la structure du tissu. De plus, on constate une grande variabilité dans les données rapportées dans la littérature. Pour mieux appréhender le comportement électrique du tissu, la démarche originale proposée dans ce manuscrit consiste à partir de l’échelle de la cellule. Ainsi la première partie du manuscrit est consacrée à la caractérisation électrique de cellule humaines de type HEK (Human Embryonic Kidney) par électrorotation. La mise en oeuvre de cette technique a permis d’extraire les propriétés électrique de la membrane et du cytoplasme des cellules HEK. La deuxième partie du manuscrit se focalise sur la création d’agrégats de cellules à partir de cellules HEK isolées. Deux techniques ont été essayées. La première s’appuie sur la nature des jonctions intercellulaires. Même si elle donne des résultats, cette approche n’est pas satisfaisante dans la mesure où on ne peut contrôler ni la forme ni la taille des agrégats. L’autre technique consiste à utiliser un champ électrique pour manipuler les cellules par diélectrophorèse. Un microsystème a été conçu à cet effet avec un réseau d’électrodes quadripolaires. On a ainsi pu obtenir des agrégats permanents de cellules HEK ayant une taille et une forme contrôlée. La dernière partie du manuscrit porte sur l’étude du comportement électrique des agrégats de cellules par le biais de simulations numériques de spectres d’électrorotation. La comparaison du comportement électrique d’une cellule isolée et celui d’un agrégat de cellules montre que le milieu extra cellulaire influe fortement sur la réponse électrique de l’agrégat ; la différence de taille entre les cellules de même que la présence de jonctions intercellulaires ne semblent pas avoir un impact significatif. Ces résultats de simulation devront être appuyés par des études expérimentales. / The work reported in this manuscript aims at understanding the electrical properties of biological tissues in the frequency range between 10 kHz and 100 MHz. Knowing these properties is essential to assess the effects of involuntary exposure of human body to electromagnetic fields, but also to diagnose a physiological change when the tissue is exposed voluntarily. Many studies have been conducted to measure the electrical properties of different tissues but existing data are not well understood because of the complexity of tissues structure. Moreover, there is considerable variability of data among studies evaluating these properties. To better understand the electrical behavior of tissues, the original approach proposed in this manuscript consists in investigating their properties starting from the cell scale. The first part of the manuscript is dedicated to the electrical characterization of HEK 293 (HumanEmbryonic Kidney) cells by electrorotation. This technique has been used to extract the electrical properties of the membrane and the cytoplasm of HEK cells. The second part of the manuscript focuses on creating cell aggregates from isolated HEKcells. Two approaches have been proposed. The first one was based on the nature of intercellular junctions. This approach led to the formation of aggregates of irregularsize and shape. The other technique consisted in using an electric field to perform dielectrophoresis-assisted cell assembly. A microsystem comprising quadrupole electrodes was designed for this purpose. Permanent aggregates of HEK cells having a controlled size and shape could be obtained using this approach. The last part of the manuscript focuses on study of the electrical behavior of the cell aggregates through numerical simulations of electrorotation spectra. The confrontation between results obtained for a single cell and those obtained for an aggregate tend to show that the extracellular medium influences strongly the electrical response of the aggregate ; Conversely, the difference in size between the cells as well as the presence of intercellular junctions does not seem to have had a notable impact. These simulation results will have to be supported by experimental studies.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) issues de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical sont immuno-privilégiées et immunosuppressives. Dans le cadre d’une utilisation en ingénierie vasculaire, la persistance de ces propriétés après différenciation endothéliale a été explorée. La différenciation a été induite par ensemencement des CSM-GW sur des films multicouches de polyélectrolytes en présence du milieu EGM-2. L’immunogénicité des cellules endothéliales-« like » (CEL) a été vérifiée en évaluant l’expression de 2 marqueurs immunologiques HLA-DR et CD86. Afin d’évaluer l’effet immunosuppresseur des CSM-GW avant et après différenciation, celles-ci ont été cultivées en premier lieu en présence de cellules mononucléées stimulées en contact cellulaire direct ou séparées, puis avec des cellules Natural Killer (NK) et lymphocytes T (LT). Les résultats ont montré que les CEL expriment les marqueurs endothéliaux, n’expriment pas HLA-DR et CD86 et qu’elles inhibent la prolifération des différentes populations immunitaires selon un mécanisme dépendant de facteurs solubles tels que IDO, les IL-6 et -1β et de la PGE2, et de contacts cellulaires. La co-culture de LT avec les CEL a induit l’apparition d’une population de LT régulateurs de manière similaire aux CSM-GW. La co-culture des cellules NK en présence de CEL a induit une diminution du récepteur activateur NKG2D et a aussi induit un transfert du CD73 à leur surface, suggérant leur capacité à produire de l’adénosine, un puissant immunosuppresseur. Les CEL maintiennent le caractère immunoprivilégié et immunosuppresseur des CSM-GW, suggérant leur possible utilisation en ingénierie vasculaire / Umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) are immune-privileged and immunosuppressive. Our study sought to determine the effect of endothelial differentiation on the immunomodulatory capacities of WJ-MSC. Endothelial-like cells (ECL) differentiation was performed by seeding MSC on polyelectrolyte multilayer films as substrate and stimulating them by EGM-2 culture medium. The expression of two immunological markers HLA-DR and CD86 was followed during the differentiation time. The effect of co-culture with ELC or MSC either in contact or separated by a transwell on different immune cells (peripheral blood mononuclear cells, T Lymphocytes (LT), Natural Killer (NK) cells) was assessed by evaluating immune cells proliferation. The results showed that ELC expressed endothelial markers, expressed low level of HLA-DR and CD86 and inhibited the proliferation of the different immune cell populations, and this inhibition is thought to be mediated by soluble factors as IDO, IL-6, IL-1β and PGE2, and by direct cellular contact. We reported also the capacity of ELC to generate a population of regulatory T cells and to decrease the expression of activating receptor NKG2D by NK cells. Moreover, we demonstrated that co-cultures with ELC induce CD73 expression on NK cells, a mechanism that may induce adenosine (a potent immunosuppressor) secretion by NK cells. Thus, ELC maintain the hypo-immunogenic and immunosuppressive characters of WJ-MSC suggesting their possible use in vascular engineering

Les cellules de la crête neurale (CN) sont une population de cellules multipotentes que pendant le développement embryonnaire vont migrer et se différencier vers divers lignages comme mélanocytes, muscle lisse, neurones périphériques et entériques, glie ainsi que tissus mésenchymateux cranio-faciaux y compris ceux de la dent. Dans le contexte de l’étude de modèles pour l’ingénierie tissulaire de la dent, nous avons établi une nouvelle lignée de cellules souches embryonnaires (ES) à partir de blastocystes issus de croisements entre un souris Wnt1-Cre et souris rapportrices fluorescentes, les Rosa26 mT/mT. Dans ce system, les cellules qui acquièrent l’identité CN et expriment le gène Wnt1 vont devenir fluorescentes grâce à l’activation de la protéine Tomato, ce qui permet de suivre 1) leur différenciation in vitro 2) isolement et 3) devenir lorsqu’elles sont utilisées dans de modèles in vivo. En parallèle, nous avons mis au point un nouveau protocole simplifié de différenciation (monocouche et milieu défini), vers un phénotype CN. Finalement nous avons tenté de développer un protocole d’induction d’une compétence odontogénique. Notre étude montre que la lignée Wnt1 Cre/Tomato 1) présentent toutes les caractéristiques d’une lignée ES classique i.e. expression de marqueurs de pluripotence, caryotype normal, capacité à se différencier in vitro et in vivo en tissus dérivés des 3 feuillets embryonnaires 2) acquièrent une identité CN, après induction in vitro avec notre protocole de différenciation. 3) Par l’intermédiaire de réassociations tissulaires in vitro, nous avons montré que ces cellules sont capables d’interagir avec un épithélium oral pour former des tissus squelettiques oro-faciaux. Ce nouvel outil cellulaire devrait aider à la compréhension des signaux impliqués dans le dialogue ectomésenchymateux qui sous-tend la formation des tissus durs de la face mais aussi plus généralement permettre suivir le devenir de cellules CN dans des modèles d’ingénierie tissulaire. / Neural crest cells are multipotent progenitor cells that, during embryogenic development, migrate and differentiate into diverse lineages such as melanocytes, smooth muscle, peripheral and enteric neurons, glial cells as well as craniofacial mesenchymatic components, including teeth. In the context of the development of an odontogenic model for tissue engineering, we have generated a new cell line of embryonic stem cells (ES) obtained from blastocysts from crossing Wnt1-CRE mice with fluorescent reporter Rosa26 mT/mT mice. In this Cre/Lox system the cells that have acquired a CN identity and thus expressing Wnt1, will become and remain fluorescent due to the activation of Tomato expression. We have generated a simplified protocol in a monolayer cell culture in defined serum-free medium in order to differentiate the cells into CN cells, named ES-CN cells. Second, we investigated the signals necessary for the odontogenic specification of these ES-CN cells. Our study provides evidence that the Wnt1-CRE/Tomato cell line 1) is a competent ES cell line with the expression of pluripotent markers, a stable karyotype and the ability to differentiate in vitro and in vivo into all the three embryonic germ layers, 2) acquires in vitro a CN identity after induction with our protocol, 3) expresses odontogenic markers in hypoxic culture conditions and 4) is able to interact with an oral epithelium in order to form orofacial skeletal tissues via the tissue reassociation in vitro. This novel cell model should facilitate the understanding of the mechanisms implicated in the ectomesenchymatic interaction, at the base for formation of orofacial skeletal tissues, and will provide the possibility to follow the fate of ES-CN cells tissue engineering models of wounded orofacial structures in general.

Les stéatopathies métaboliques (NAFLD, non-alcoholic fatty liver diseases) sont des pathologies étroitement associées au diabète de type 2 et à l'obésité. Elles couvrent un spectre de maladies hépatiques s'étendant de la stéatose à la cirrhose. Une des étapes charnières dans l'évolution des NAFLD est l'activation des cellules hépatiques stellaires (CHS) qui sont à l'origine de la fibrogenèse hépatique. Dans ce contexte, nous avons identifié le facteur de transcription PRDM16 comme acteur clé de la fibrogenèse. En effet, nos résultats montrent que PRDM16 est induit dans le foie au cours de la fibrose hépatique chez l'Homme et dans différents modèles murins. Cette augmentation de l'expression de PRDM16 est spécifique aux CHS. Des expériences d'invalidation de Prdm16 dans les CHS démontrent que PRDM16 est nécessaire à l'expression basale et stimulé par TGF-b1 de Col-1a1 et Col-3a1. Cette action de PRDM16 s'explique en partie par sa capacité d'interaction avec SMAD3. Enfin, nous avons également démontré que PRDM16 joue un rôle dans l'activation des CHS car l'invalidation de Prdm16 entraîne la diminution de l'expression d'aSma et l'augmentation de l'expression de Srebp-1c. Cependant les mécanismes par lesquels PRDM16 contrôle l'activation des CHS reste à identifier et feront l'objet des prochaines études. / NAFLD (nonalcoholic fatty liver diseases) are closely linked to type 2 diabetes and obesity and are becoming the first cause in liver chronic diseases around the world. One of the key step in NAFLD progression is the fibrogenesis characterized by hepatic stellate cells (HSC) activation. In this context, we identified PRDM16 as a key factor in this activation. Our first prospective study revealed a correlation between fibrosis score and Prdm16 expression in human biopsies and in murine model of fibrosis. Prdm16 expression is also positively correlated in HSC with the activation state. Our results on Prdm16 invalidation in HSC highlight a role for PRDM16 in the increase expression of Col-11 and Col-31 during HSC activation in part by the binding of PRDM16 to SMAD3. Prdm16 invalidation in HSC also leads to a decrease Sma expression and an increase Srebp-1c expression, showing that PRDM16 control HSC activation through other mechanisms which will be the subject of our next studies.

Le foie est un organe connu empiriquement pour sa capacité à induire une tolérance immunologique des lymphocytes T (LT). Cette propriété pourrait s'exercer en particulier visà- vis d'antigènes alimentaires drainés de l'intestin dans le foie via la veine porte. L'objectif de ce travail de thèse était d'étudier l'implication du foie dans la tolérance périphérique et en particulier la tolérance induite par voie orale, en utilisant un modèle murin d'hypersensibilité retardée de contact (HSRC) spécifique d'haptène (DNFB), induit par des LT CD8+ spécifiques. Nous avons identifié deux types cellulaires enrichis dans le foie et doués de propriétés régulatrices/tolérogènes : i) Les cellules dendritiques plasmacytoïdes, capables d'induire une tolérance des LT CD8+ in vivo et jouant un rôle clef dans l'induction de la tolérance orale, et ii) les cellules NKT capables de réguler la réponse T CD8+ aussi bien au cours de la phase afférente que de la phase efférente de la réponse immunitaire.

Notre travail comporte une partie de chirurgie expérimentale sur animaux par création de modèles d'incontinence urinaire (chez la truie) et le dysfonctionnement érectile (chez le rat) et par évaluation de nouvelles thérapies cellulaires. Dans le modèle de l'incontinence urinaire chez la truie, nous avons montré que l'appareil sphinctérien de la truie se rapproche morphologiquement de celui de l'homme par sa taille, sa forme et sa composition en fibres de type I lui conférant une activité tonique basale mesurable en urodynamique. A l'aide de ce modèle, nous avons envisagé une nouvelle méthode de transfert intra urétral de cellules précurseur musculaires par implantation directe des ficres musculaires (CPM) avec leurs cellules satellites attachées en fourme de bandelette de muscle. Nous avons notamment observé la formation de fibres musculaires striées et un bourgeonnement de terminaisons nerveuses venant au contact de nouvelles plaques motrices. Nous avons conclu donc, que le transfert de CPM par implantation chirurgicale de bandelette musculaire apparaît comme une méthode simple permettant d'obtenir la formation de fibres striées en position ectopique. Et donc, nos résultats fournissent les bases biologiques pour une thérapie cellulaire des pathologies sphinctériennes en général. Dans le modèle de la dysfonction érectile chez le rat, les résultats qu'on a obtenus, suggèrent que le principal mécanisme de la dysfonction érectile après section des nerfs caverneux est plutôt la conséquence de l'apoptose diffuse des cellules conjonctives et des cellules musculaires lisses caverneuses que de l'absence de Nitrique Oxyde. L'injection de cellules médullaires de la moelle osseuse pourrait constituer un traitement curatif de la dysfonction érectile après prostatectomie radicale en remplaçant les cellules apoptotiques.

Le squelette oral est particulier dans l'organisme par la diversité des tissus minéralisés dentaires et osseux qui le compose. La première partie de ce travail porte sur les patrons d'expression d'effecteurs de la biominéralisation (calbindine-D28k, phosphatase alcaline et amélogénine) au cours de l'amélogénèse sur notre modèle de l'incisive à croissance continue de rongeur et avec une série de techniques adaptées à l'étude des tissus minéralisés. Les résultats montrent que les patrons d'expression de ces effecteurs sont contrôlés de façon singulière dans les cellules dentaires à des phases critiques pour la formation du tissu. Ces données sont accompagnées par des résultats sur les protéines de la matrice extracellulaires spécifiques de chacun des tissus, émail, dentine et os. La deuxième partie de ce mémoire est basée sur la découverte de niveaux d'expression importants des protéines amélaires dans l'os, par RT qPCR, alors que des études classiques considéraient que l'amélogénine, l'améloblastine et l'énaméline sont spécifiques des tissus dentaires. Nous avons revisité l'expression des protéines de l'émail comparativement dans les tissus minéralisés des maxillaires et du squelette axial. Nos résultats montrent que le tissu osseux des mâchoires se singularise par une expression des protéines de l'émail.

Les lymphocytes T qui expriment un TCR γδ (lymphocytes T γδ) sont des lymphocytes T non conventionnels qui reconnaissent des antigènes indépendamment du CMH (complexe majeur d'histocompatibilité). Chez l'homme, la sous-population T Vγ9Vδ2, majoritaire dans le sang périphérique, joue un rôle important dans l'immunité antitumorale. Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 reconnaissent les cellules tumorales grâce à leur TCR et/ou leurs récepteurs NK. Le travail de thèse s'est focalisé sur l'un de ces récepteurs : CRTAM et le rôle de son interaction avec son ligand Necl-2 exprimé par des cellules tumorales. Nous avons montré que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés expriment CRTAM de manière transitoire. Afin d'étudier l'interaction CRTAM avec son ligand Necl-2, nous avons développé des modèles de cellules tumorales exprimant Necl-2 après transduction rétrovirale. Nous avons observé que l'interaction des lymphocytes T Vγ9Vδ2 avec des cellules tumorales Necl-2+ entraînait une diminution de l'expression de CRTAM à la surface des lymphocytes. De manière concomitante, les cellules tumorales Necl-2+ acquièrent CRTAM par un mécanisme de trogocytose. Contrairement aux lymphocytes T CD8 et les cellules NK, nous n'avons pas observé d'impact de l'interaction CRTAM/Necl-2+ sur la capacité cytotoxique et la sécrétion d'IFN-γ des lymphocytes T Vγ9Vδ2. Par contre, cette interaction induit la mort des lymphocytes T Vγ9Vδ2 par un mécanisme de type autophagique. Nos résultats suggèrent que l'expression de Necl-2 par les cellules tumorales serait un mécanisme leur permettant d'échapper à une réponse des lymphocytes T Vγ9Vδ2.