Besides playing its structural function in cellular membranes, ceramide has been recognized as a bioactive signalling molecule playing roles in the regulation of cell growth, differentiation, senescence and programmed cell death. Apoptosis can be induced in cancer cells by elevation of endogenous ceramide levels in response to a variety of apoptotic stimuli such as cytokines (TNF, IL-1), death receptor ligands (Fas ligand), heat stress, oxidative stress, chemotherapeutic agents, and ionizing or ultraviolet radiation. It was shown that use of exogenous cell-permeable short-chain ceramide can also promote apoptotic pathways in cancer cells. Several studies have attempted to further define the specific role of ceramide in cell death. However, the mechanisms by which ceramide mediates antiproliferative pathways or inhibits prosurvival effects are not yet well-defined. So, we investigated the signalling pathways triggered by exogenously-supplied natural long chain ceramide, especially C16-ceramide, to better understand how this messenger induces its biological effects in cancer cells. We first showed that C16-ceramide induced a decrease in viability of adenocarcinoma cells (HCT116), partly due to apoptosis. Using two-dimensional differential in-gel electrophoresis (2D-DIGE) proteomic approach, we identified new proteins involved notably in cell proliferation, apoptosis, protein transport and transcriptional regulation in response to exogenous C16-ceramide. Among them, the death promoting factor Btf (Bcl-2-associated transcription factor) was found to be involved in the ceramide-dependent pro-apoptotic signalling pathway. Indeed, Btf-depleted colon cancer cells were found to be more resistant to death triggered by C16-ceramide. Transfection of GFP-Btf expression plasmid up-regulated p53 and BAX protein levels whereas pBcl-2 and Mdm2 expression were down-regulated. Furthermore, we identified a new signalling pathway specifically induced by C16-ceramide, depending on Btf and leading to down-regulation of the Mdm2 protein expression and MDM2 promoter activity. Thus, we provided new information on molecular mechanisms involved in the ceramide-mediated cell death. Then, we investigated the regulation of Emerin expression and its post-translational modifications induced by ceramide. We found that cAMP-dependent protein kinase A (PKA) could be involved in the C16-ceramide induced-Emerin phosphorylation. However, we did not demonstrate the interaction between Btf and phosphorylated-Emerin upon ceramide treatment. Nevertheless, we showed that one of the pathway induced by ceramide implies Emerin and leads to down-regulation of the MDM2 promoter activity. We also hypothesized that GCL (germ-cell-less) could be an intermediate in the Emerin-Mdm2 pathway triggered by C16-ceramide. Furthermore, we showed that Emerin-depleted cells were not more sensitive to apoptosis induced by C16-ceramide. These results should allow us to further explore the potential functions of Emerin in a ceramide-dependent pathway.

Le Sélénium (Se) est un oligo-élément essentiel qui est incorporé dans une famille indispensable de protéines, les sélénoprotéines, sous la forme d’un résidu acide aminé rare, la sélénocystéine. Dans les études épidémiologiques, il apparait clairement que des faibles niveaux de sélénium dans les fluides biologiques sont associés avec (i) une augmentation du risque de cancers (colon, prostate, poumon) et de maladies cardiovasculaires, (ii) une altération de la fonction immunitaire et (iii) finalement une réduction de l’espérance de vie. Dans le génome humain, vingt-cinq gènes de sélénoprotéine ont été identifiés. Ces gènes expriment, de par la complexité de la régulation du génome, de nombreuses isoformes de chacun des 25 gènes pour constituer le sélénoprotéome. Quand la fonction est connue, ces protéines participent à des processus essentiels de défense antioxydante, d’homéostasie redox et de signalisation redox. Ces enzymes sont finement régulées par l’apport en sélénium et d’autres stimuli cellulaires. Pour comprendre la fonction et la régulation du sélénoprotéome humain, qui est exprimé à un niveau trace, il s’avère critique de développer une stratégie innovante basée sur une approche multidisciplinaire de détection et quantification du sélénium par différents outils de spectrométrie de masse élémentaire (ICP MS) et moléculaire (ESI-MS/MS). Tout d’abord, le sélénium possède un profil isotopique bien particulier avec six isotopes stables (74Se, 76Se, 77Se, 78Se, 80Se and 82Se) qui sert de signature dans nos analyses en ICP-MS ou en ESI-MS/MS. En parallèle, l’utilisation de sélénium isotopiquement enrichi permet également des marquages cellulaires en multiplexing. Ainsi, en couplant des méthodes de séparation en phase liquide (HPLC) ou en gel d’électrophorèse (IEF ou SDS-PAGE échantilloné par ablation laser) avec l’ICP MS, nous avons mis au point plusieurs méthodes permettant la détection de plusieurs sélénoprotéines de manière simultanée dans différentes lignées cellulaires. De plus, un médicament sélénié sous forme de triglycéride obtenu via un mélange d’huile de tournesol et de sélénite a été testé comme source de sélénium non toxique pouvant stimuler la production de sélénoprotéines. Plusieurs lignées cellulaires humaines cancéreuses et non-cancéreuses ont été expérimentées avec succès permettant de valider cette nouvelle source de sélénium dans la synthèse des sélénoprotéines. / Selenium (Se) is an essential trace element, which is incorporated as a rare aminoacid, selenocysteine, in twenty five selenoproteins, to constitute the selenoproteome. Selenoprotein family is one of the most important bioactive form of selenium in human health. Initially demonstrated in Kashin Beck and Keshan diseases, selenium deficiency is associated with several pathological conditions, including cancer, neurodegenerative diseases, immune and muscular disorders. Chronic selenium deficiency is hypothesized to decrease antioxidant defenses and redox regulatory pathways through a dysregulation of selenoprotein expression. We are interested in understanding the synthesis and regulation of human selenoproteins, which is critically dependent on the availability of adequate analytical methodology. To understand the function and regulation of human selenoproteome, which is expressed at a trace levels, it appears critical to develop innovative strategies based on a multidisciplinary approach to detect and quantify selenium by various elemental and molecular mass spectrometer tools. First, selenium has a particular isotopic profile with six stable isotope (74Se, 76Se, 77Se, 78Se, 80Se and 82Se) used as a signature in our analysis with ICP-MS or ESI-MS/MS. In parallel, the use of isotopically enriched selenium also allows cellular labelling and tracing of selenoproteins and other seleno-coupounds. By coupling liquid phase separation methods (HPLC) with specific mass spectrometry analytical tools, we have developed several methods for detecting several selenoproteins simultaneously in various human cell lines.

Dans cette thèse, deux dispositifs de culture in vitro de cellules ont été développés selon des technologies de microfabrication, qui offrent de nouveaux niveaux de contrôle sur le microenvironnement de la culture cellulaire. Les applications des dispositifs développés dans la recherche sur le cancer et la neurobiologie ont été démontrées, notamment pour l'étude fondamentale de métastases du cancer et le pathfinding axonal de neurones. La puce microfluidique dédiée à la transmigration comprend des microcanaux utilisées pour mimer les capillaires des tissus le long de la trajectoire des cellules cancéreuses lors de la métastase. La transparence optique du dispositif a permis une bonne observation de la déformation et de la migration des cellules dans les capillaires artificiels. Les résultats ont montré que la déformation du noyau de la cellule rigide était une des étapes les fastidieuses du processus de transmigration. Les restrictions physiques modifient la morphologie des cellules, mais elles affectent aussi de manière significative leur profil de migration. D'autres études sur le contenu moléculaire et les propriétés biologiques des cellules transmigrées ont montré que le blocage des modifications des histones par un médicament spécifique peut inhiber la transmigration des cellules cancéreuses dans le microcanal, ce qui pourrait avoir des implications sur la prévention et le traitement du cancer. La puce microfluidique peut également être utilisée pour évaluer la déformabilité de la cellule, qui est un marqueur pronostique potentiel pour le diagnostic du cancer. La puce de la culture de neurones permet la culture de cellules dans un microenvironnement au sein duquel de protéines sont imprimées selon des motifs géométriques précis. Les somas et axones des neurones mis en culture dans le dispositif peuvent être polarisés dans différents environnements fluidiquement isolés sur une longue période. L'extension des axones peut être guidée par des protéines immobilisées sur le substrat de verre. La croissance axonale orientée peut en outre être modulée par un traitement médicamenteux localisé. Les études sur le mécanisme moléculaire sous-jacent ont révélé que ces processus ont été étroitement associés à des protéines synthétisées localement dans les extrémités d'axones en croissance / In this PhD project, two in vitro cell culture devices were developed via microfabrication technologies, which provided entirely new levels of controls over the cell culture microenvironment. The applications of the developed devices in cancer and neurobiology researches were demonstrated, specifically for the fundamental study of cancer metastasis and neural axonal pathfinding. The microfluidic transmigration chip used microchannel structures to mimic the tissue capillaries along the path of cancer cell metastasis. The transparent optical qualities of the device allowed good observation of the deformation and migration of cells in the artificial capillaries. Results showed that deformation of the stiff cell nucleus were the most time-consuming steps during the transmigration process. The physical restrictions not only changed the morphology of the cells, but also significantly affect their migration profile. Further studies on the molecular contents and biological properties of the transmigrated cells showed that blocking the histone modifications by specific drug can inhibit the transmigration of cancer cells in the microchannel, which might have implications on cancer prevention and treatment. The microfluidic chip can also be used to evaluate cell deformability, which is a potential prognostic marker for cancer diagnosis. The neural culture chip integrated microfluidic cell culture and protein patterning techniques. The somas and axons of neurons cultured in the device can be polarized into different fluidically isolated environments for long period, and the extension of the axons can be guided by proteins immobilized on the glass substrate into specific patterns. The oriented axon growth can be further modulated by localized drug treatment. Studies on the underlying molecular mechanism revealed that these processes were closely associated with the proteins synthesized locally in the tips of growing axons