On estime qu'environ 5 millions d'hommes américains souffrent de taux de testostérone réduits ou d'hypogonadisme. Chez les hommes, les cellules de Leydig sont les principales productrices de testostérone et d'insuline-like 3, deux hormones essentielles à la différenciation sexuelle masculine, aux fonctions reproductives et à la santé globale de l’homme. Les facteurs de transcription sont des protéines qui régulent la transcription des gènes en se liant à des séquences d'ADN spécifiques. Le facteur de transcription “chicken ovalbumin upstream promoter type 2” (COUP-TFII) est un facteur de transcription qui appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le testicule, COUP-TFII est exprimé dans les cellules se différenciant en cellules de Leydig adulte (ALCs) pleinement fonctionnelles et joue un rôle majeur dans leur différenciation et leur fonction. La synthèse des stéroïdes est réduite dans des cellules de Leydig appauvries en COUP-TFII, ce qui suggère que ce facteur joue un rôle important dans la stéroïdogenèse. Cependant, le mécanisme d'action de COUP-TFII dans les cellules de Leydig demeuraient largement méconnus. Dans cette thèse, une analyse des données de puces à ADN de cellules MA-10 Leydig appauvries en COUP-TFII a été effectuée afin d’identifier le rôle global de ce facteur dans les cellules de Leydig. Cette étude a permis d’identifier 262 gènes différentiellement exprimés, notamment Hsd3b1, Cyp11a1, Prlr, Pdgfra, Shp, Ear1, Amhr2, Fdx1, Inha et Gsta3. De plus, l’étude du promoteur proximal d’Amhr2 par des études de gène rapporteur a permis de démontrer que COUP-TFII est recruté au promoteur proximal d’Amhr2 et coopère avec SP1 et GATA4 afin de réguler son expression. Les résultats présentés dans cette thèse fournissent une meilleure compréhension du mécanisme d'action de COUP-TFII dans les cellules de Leydig, et des preuves supplémentaires renforçant l'importance du récepteur nucléaire COUP-TFII dans la stéroïdogenèse, l'homéostasie androgénique, la défense cellulaire et la différenciation des cellules de Leydig. / It is estimated that about 5 million American men have low testosterone levels, hypogonadism, and infertility problems. Leydig cells are the primary producers of testosterone and insulin-like 3 hormones in males, both essential for male sex differentiation, reproductive roles, and overall health. Transcription factors are proteins that bind to various DNA sequences to control DNA transcription. Chicken ovalbumin upstream promotertranscription factors II (COUP-TFII) belongs to the steroid/thyroid hormone nuclear receptor superfamily of transcription factors. COUP-TFII is expressed in the cells that give rise to fully functional steroidogenic Adult Leydig cells in the testis and plays an important role in their function and differentiation. Steroid synthesis is reduced in COUP-TFII-depleted Leydig cells, suggesting that this protein plays a vital role in steroidogenesis. However, the mechanisms of action of COUP-TFII in Leydig cells were largely unknown. The analysis of microarray data from COUP-TFII-depleted MA-10 Leydig cells identified 262 differentially expressed genes, including Hsd3b1, Cyp11a1, Prlr, Pdgfra, Shp, Ear1, Amhr2, Fdx1, Inha, and Gsta3. Anti-Müllerian hormone (AMH), which is expressed in Sertoli cells, is essential for the regression of the Müllerian ducts during male embryonic development. In Leydig cells, AMH signals through the anti-Müllerian hormone type II receptor (AMHR2). In male mammals, mutations affecting AMH or AMHR2 expression cause Persistent Müllerian Duct Syndrome (PMDS), characterized by infertility, inguinal hernias, cryptorchidism, and reduced serum testosterone levels. COUP-TFII was found to cooperate with specificity protein 1 (SP1) and GATA-binding factor 4 (GATA4) in the regulation of the Amhr2 promoter using reporter promoter assays. COUP-TFII and GATA4 were found to be recruited to the same region of the Amhr2 gene via chromatin immunoprecipitation assay (ChIP), further strengthening their cooperative roles in the regulation of this gene. Furthermore, COUP-TFII and GATA4 were found to associate in the Leydig cells molecularly. The results presented in this thesis provide a better understanding of the mechanism of COUP-TFII action in Leydig cells, and additional evidence strengthening the importance of COUP-TFII in steroidogenesis, androgen homeostasis, cellular defense, and differentiation.

Les cellules de Leydig constituent la principale source de testosterone. Elles sont essentielles à la différenciation sexuelle et à la masculinisation de même qu'à l'initiation et au maintien de la spermatogenèse. La différenciation des cellules de Leydig requiert le récepteur PDGF-Rα, localisé à leur membrane, et son ligand PDGF-A, synthétisé par les cellules de Sertoli. À ce jour, aucune information n'est disponible concernant les mécanismes de régulation de l'expression de PDGF-Rα dans les cellules de Leydig. Afin de caractériser ces mécanismes, un fragment de 2 kb du promoteur Pdgfra de rat a été isolé et fusionné au gène rapporteur luciférase. Une série de deletions 5' progressive du promoteur a ensuite été générée. Des transfections transitoires de ces constructions promotrices Pdgfra dans la lignée TM3 de cellules de Leydig ont mis en évidence une région de 49 pb qui compte pour 60% de l'activité promotrice. Afin de mieux circonscrire les éléments régulateurs critiques à l'intérieur de cette région, une série de 12 mutants de 3 pb a été réalisée par mutagenèse dirigée. Ces 12 mutants ont permis d'identifier une courte séquence de 20 pb qui joue un rôle clé dans l'activité promotrice. Des analyses de retardement sur gel ont détecté la liaison de protéines nucléaires à cet élément. Différentes approches, dont une de protéomique, ont ensuite été employées afin d'élucider la nature du/des facteurs de transcription qui se lient à cette région du promoteur Pdgfra et elles ont entre autres démontré que le facteur SPI régule positivement l'activité de ce promoteur. L'étude de la régulation de Pdgfra permettra de mieux comprendre le processus de différenciation des cellules de Leydig.

L’hormone peptidique Insulin-like 3 (INSL3) est produite par les cellules de Leydig du testicule. Elle est essentielle à la première phase de la descente testiculaire lors du développement fœtal. Les divers modèles animaux invalidés en Insl3 présentent une descente testiculaire incomplète chez les mâles, la cryptorchidie. Il s’agit du trouble développemental le plus courant chez les garçons nouveau nés des pays industrialisés et son incidence s’est accrue au cours des dernières décennies. Plusieurs études animales indiquent que les estrogènes répriment l’expression d’Insl3. La répression de l’expression d’Insl3 implique probablement le récepteur alpha des estrogènes (ERα) et/ou le récepteur nucléaire Nr0b2, tous deux présents dans les cellules de Leydig. En vue de vérifier la répression d’Insl3 par les estrogènes et d’impliquer ERα et/ou Nr0b2, j’ai analysé l’activité promotrice d’Insl3 murin par transfection et j’ai étudié les variations d’expression de son ARNm en PCR quantitatif. J’ai pu vérifier la répression d’Insl3 par l’estradiol et Nr0b2 ne parait pas être impliqué. L’implication d’ERα semble probable, mais les résultats de techniques différentes sont contradictoires.

La stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig est liée au récepteur nucléaire NR4A1. Ce récepteur nucléaire régule la transcription du gène Star qui code pour une protéine essentielle à la stéroïdogenèse. L’expression de Nr4a1 est régulée par trois promoteurs distincts dont l’activité est hormonalement régulée. Deux de ces promoteurs ont été récemment décrits et ont été nommés Nr4a1 IB et Nr4a1 IC (le promoteur original a été renommé Nr4a1 IA). Des analyses qPCR ont montré que ces promoteurs sont actifs dans les cellules de Leydig MA-10 et qu’ils répondent à une stimulation hormonale. Ces promoteurs ont été isolés et fusionnés au gène rapporteur luciférase, et des délétions 5’ progressives ont été produites. Par transfections transitoires dans les cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1, deux zones régulatrices importantes ont été localisées pour le promoteur Nr4a1 IB : l’une pour l’activité basale et l’autre, pour l’activation hormonale par l’AMPc et la LH. Bien que la transcription de Nr4a1 soit principalement activée par la voie de l’AMPc, une stimulation par la LH active d’autres voies qui peuvent influencer son profil d’expression. La majorité des études publiées n’ont pas exploré ces voies. À cet égard, la voie PKC est en mesure d’augmenter la quantité d’ARNm et l’activité promotrice de Nr4a1. Par ailleurs, l’inhibition des kinases PKA et PKC suite à une stimulation par la LH montre un profil d’ARNm qui peut être expliqué par l’existence du promoteur Nr4a1 IB récemment identifié dans les cellules de Leydig. Ces données supportent l’existence d’une régulation de l’expression de Nr4a1 impliquant d’autres seconds messagers que l’AMPc et le calcium. Par ailleurs, de nouveaux facteurs de transcriptions ont été testés comme régulateurs des promoteurs alternatifs de Nr4a1. Ces facteurs de transcription son SRF, CLOCK et BMAL1, et c-MAF. Ces informations contribuent à une meilleure compréhension de la régulation de la stéroïdogenèse.

Les homéoprotéines sont des régulateurs transcriptionnels impliqués dans le développement, l'embryogenèse et la différenciation cellulaire chez plusieurs espèces. Les homéoprotéines sont les produits des homéogènes et elles sont exprimées dans une pléiade de tissus au cours du développement. Dans le but d'approfondir nos connaissances sur les contrôles transcriptionnels qui régissent le développement et la différenciation des organes reproducteurs, je me suis intéressée à l'expression des homéoprotéines dans les cellules de Leydig dû à l'importance de ces facteurs dans les processus développementaux. Nous avons nouvellement identifiés dans les cellules de Leydig, le gène Lbx2 et l'homéoprotéine PBX1. Il n'existe actuellement pas de données sur l'expression de ces gènes au cours de la différenciation du système reproducteur et ce faisant des cellules de Leydig. Cette thèse présente donc l'expression de Lbx2 et PBX1 au cours de la différenciation du système reproducteur dans le testicule, l'épididyme, l'ovaire et les cellules de Leydig. J'ai précisé le profil d'expression du gène Lbx2 au cours du développement testiculaire, épididymaire et ovarien. J'ai déterminé que les transcrits de Lbx2 sont présents durant le développement du testicule, de l'épididyme et de l'ovaire. De plus, mes analyses révèlent également que Lbx2 est un gène dont l'expression est sexuellement dimorphique dans les gonades embryonnaires. L'élaboration du profil d'expression de la protéine PBX1 révèle qu'elle est présente au cours du développement testiculaire et durant la vie adulte. Dans les cellules de Leydig, mes résultats démontrent que PBX1 est principalement exprimée à la puberté. L'expression de PBX1 est plus forte dans les cellules de Sertoli chez l'adulte et dans les cellules myoïdes péritubulaires au cours du développement embryonnaire et postnatal. Les travaux présents dans cette thèse auront également permis d'identifier d'autres nouvelles homéoprotéines, PRRX2, GBX1, MEIS1, PREP1 exprimées dans les organes reproducteurs. Ainsi, la caractérisation du profil d'expression des homéoprotéines au cours du développement du système reproducteur aura permis d'identifier de potentiels régulateurs transcriptionnels du développement et de la différenciation du système reproducteur.

Lors des dernières décennies, une diminution de la santé reproductive masculine a été observée dans plusieurs pays industrialisés et illustrés par une diminution de la qualité du sperme, une augmentation de l’incidence des cancers testiculaires, des hypospadias et de la cryptorchidie. Ces symptômes ont été regroupés sous l’appellation du « syndrome de dysgénésie testiculaire » (TDS). Une hypothèse a été émise selon laquelle le TDS est le résultat d'une perturbation de la programmation embryonnaire et du développement gonadique pendant la vie fœtale. Les perturbateurs endocriniens environnementaux seraient en partie impliqués dans l’étiologie du TDS. De ce fait, lors de mes travaux de doctorat je me suis intéressée à l’impact de deux familles de perturbateurs endocriniens environnementaux au niveau de la stéroïdogenèse des cellules de Leydig à savoir : les phtalates et les organochlorés. En effet, j’ai mis en évidence que ces deux familles de composés affectent la stéroïdogenèse des cellules de Leydig par au moins deux voies : le transport du cholestérol via la steroidogenic acute regulatory protein (STAR) et sa conversion en prégnénolone via ADXR pour les deux composés et CYP11A1 pour les organochlorés. J’ai également mis en évidence que ces deux familles de composés affectent différemment STAR, au niveau transcriptionnel pour les phtalates et au niveau post-transcriptionnel voir post-traductionnel pour les organochlorés. Enfin, l’un de mes objectifs était de valider l’absence de toxicité de nouveaux plastifiants en remplacement aux phtalates. Mes études mettent en lumière deux plastifiants verts potentiels en remplacement aux phtalates qui n’induisent pas d’effets néfastes dans les lignées de cellules de Leydig le di-octyl Succinate (DOS) et le hexanediol Dibenzoate (C6DB). / During past decades, a decline in male reproductive health has been observed in many industrialized countries as illustrated by a decrease in sperm quality, and an increased incidence of testicular cancer, hypospadias and cryptorchidism. These symptoms are grouped under the name of testicular dysgenesis syndrome (TDS). It has been hypothesized that TDS is the result of a disruption of embryonic programming and gonadal development during fetal life. Environmental endocrine disruptors were suggested to be partly involved in the aetiology of TDS. Therefore, during my doctoral work I was interested in the impact of two families of environmental endocrine disruptors: phthalates and organochlorines on Leydig cell steroidogenesis. I demonstrated that these two families of compounds affect Leydig cells steroidogenesis at least through two pathways: cholesterol transport (via STAR for both compounds) and the conversion of cholesterol to pregnenolone (via ADXR for both compounds and via CYP11A1 for organochlorines). I also highlighted that these two compounds have different effects on STAR, at the transcriptional level for phthalates and post-transcriptional/post-translational level for organochlorines. Finally, another of my goals was to validate the absence of toxicity of new plasticizers as alternatives to phthalates in Leydig cells. I revealed two potential green plasticizers C6DB and DOS that do not cause adverse effects in different Leydig cell lines.

L'enzynle HSD3B2 humaine et la protéine STAR de souris encodées par les gènes HSD3B2 et Star, respectivement, sont retrouvées principalement au niveau des gonades et surrénales. L'importance de STAR comme transporteur du cholestérol et de HSD3B2 comme enzyme de la stéroïdogenèse est lnise en évidence par des mutations de ces gènes causant une hyperplasie congénitale des surrénales, un pseudohermaphrodisme mâle et une insuffisance des surrénales. Un rôle pour la famille de récepteurs nucléaires orphelins NUR 77 dans la stéroïdogenèse a été considéré. En effet, NUR77 est présent dans les gonades et surrénales où son expression est fortement et rapidement induite par des horlnones qui activent certains gènes impliqués dans la stéroïdogenèse. De plus, les profils d'expression de Nur77 et des gènes RSD3B2 et Star sont corrélés. Lors de cette thèse, j'ai démontré que les promoteurs HSD3B2 et Star constituent des nouvelles cibles de NUR77. Des éléments de réponse localisés à -130 pb et -95 pb des promoteurs HSD3B2 et Star respectivement, sont essentiels et suffisants pour conférer une réponse dépendante de NUR77, et la mutation de ces élélnents . diminue leurs activités basale et homlono-dépendante dans les cellules stéroïdogéniques. Dans les cellules de Leydig, un réduction de l'expression de Nur77 par siARN réduit l'induction de l'expression de Star par l'AMPc. Également, NUR77 coopère avec des co activateurs de la famille SRC et avec des membres de la famille AP-1 dans la régulation des promoteurs RSD3B2 et Star, respectivement. De plus, le dexaméthasone, un glucocorticoïde synthétique, inhibe l'activation de Star en diminuant le recrutement de NUR77, et non SF-I, à la région proximale du promoteur Star, donnant un argument moléculaire à la suppression causée par le stress de la production de testostérone dans le testicule. J'ai démontré que la voie de signalisation des CaMK est requise pour l'expression de STAR et NUR77 en réponse à l'AMPc dans les cellules de Leydig. Ainsi, CaMKI est spécifiquement exprimé dans les cellules de Leydig. Enfin, je démontre que CaMKI coopère avec NUR 77 et MEF2 pour activer les promoteurs Star et Nur77, respectivement, dans ces cellules. Ainsi, l'identification de NUR 77 comme régulateur important des promoteurs HS1J3B2 et Star et de son mécanisme d'action aident à mieux défénir la spécificité tissulaire et la régulation hormonale de ces gènes dans les cellules de Leydig en plus de soulever un rôle pour CaMKI dans ce processus.

La fonction et la différenciation des cellules de Leydig sont connues pour être régulées par différents stimuli incluant 1' hormone lutéinisante (LB) et autres facteurs paracrines et autocrines comme les cytokines dont 1 ' IL-1. NUR 77 est un facteur de transcription présent au niveau des cellules de Leydig et impliqué dans la régulation de la stéroïdogenèse. Malgré que Nur77 soit connu pour être régulé par les cytokines dans différents types cellulaires, cette régulation n 'est pas encore bien caractérisée au niveau des cellules de Leydig. Afin de mieux comprendre la régulation de Nur77 par les cytokines, j ' ai décidé d'étudier l' effet de deux facteurs de transcription, C/EBP~ et NF -KB, connus pour être impliqués dans les voies de signalisation des cytokines, sur le promoteur Nur77. J'ai trouvé que les facteurs de transcription C/EBP~ et NF -KB coopèrent ensemble dans l'activation du promoteur Nur77. Cette coopération nécessite la présènce d'au moins un des deux éléments nouvellement identifiés dans cette étude : C/EBP~ (à -110 pb en fonction du site d'initiation de la transcription) ou p50 (KB à -18 pb). L'activation du promoteur Nur77 par ces facteurs de transcription appuie mon hypothèse selon laquelle NUR 77 peut être un effecteur dans la voie de signalisation des cytokines comme 1 'IL-l.