Titre de l'écran-titre (visionné le 16 janvier 2024) / La leucémie lymphoblastique aiguë de type T (LLA-T) provient de la transformation maligne des progéniteurs des lymphocytes T dans le thymus. Leur migration à partir du thymus vers la moelle osseuse puis vers d'autres organes est associée à un mauvais pronostic. Pour s'infiltrer, les cellules leucémiques LLA-T doivent circuler dans le sang puis transmigrer la barrière endothéliale puis traverser la membrane basale des vaisseaux sanguins composée majoritairement de matrice extracellulaire dont la laminine est le principal composant. Celle-ci est liée principalement par l'intégrine α6, mais dont le rôle dans la leucémie LLA-T n'est pas étudié. Nos résultats montrent que les cellules leucémiques LLA-T expriment fortement l'intégrine α6 qui leur permet de migrer à travers la laminine. Par ailleurs, le blocage de l'intégrine α6 par un anticorps spécifique réduit le développement de la leucémie dans un modèle murin de xénogreffe de leucémie LLA-T. Pour déterminer le mécanisme par lequel l'intégrine α6 favorise la migration des cellules leucémiques LLA-T, nous avons considéré l'implication des récepteurs purinergiques. En effet, nos travaux récents ont montré que les lymphocytes Th17 migrent à travers la fibronectine en impliquant l'ATP et son récepteur purinergique P2X4. Nos résultats montrent que les cellules leucémiques expriment les récepteurs purinergiques P2X4, P2X7 et P2Y₁₁. L'utilisation de l'apyrase qui dégrade l'ATP extracellulaire inhibe fortement la migration des cellules leucémiques LLA-T à travers la laminine. De plus, l'utilisation d'antagonistes spécifiques a montré que l'inhibition du récepteur P2X4, mais pas des récepteurs P2X7 ou P2Y₁₁, réduit la migration des cellules leucémiques LLA-T à travers la laminine. Ces résultats montrent que l'intégrine α6 via le récepteur P2X4 est une voie majeure dans la migration et la dissémination des cellules leucémiques LLA-T et suggèrent que son blocage peut représenter une nouvelle cible thérapeutique afin d'améliorer le pronostic des patients.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Facteur de transcription Ikaros / La rétine constitue un modèle très intéressant pour l'étude du développement du système nerveux. Elle origine de cellules neuroépithéliales qui se diviseront et se différencieront pour donner naissance à 6 différents types de neurones et un type de cellule gliale. Au cours du développement, la majorité des cellules progénitrices de la rétine (CPRs) sont multipotentes et quelques unes ont même le potentiel de générer tous les différents types cellulaires de la rétine. Cependant, à des stades plus tardifs, les CPRs perdent alors la compétence qui leur permet de générer les cellules dites précoces et acquièrent la capacité de générer les cellules dites tardives. Il est clair que l'ensemble des types cellulaires est produit dans un ordre bien précis et concomitant, mais les mécanismes moléculaires par lesquels les CPRs changent leur compétence au cours du temps pour générer chaque type de cellule au bon moment restent toutefois inconnus. Le facteur de transcription Ikaros avait été largement étudié dans le système hématopoïétique, cependant son rôle potentiel au niveau du système nerveux n'avait que très peu été exploré. Dans cette étude nous avons investigué l'hypothèse qu'Ikaros puisse contrôler la compétence temporelle des CPRs. Nous avons premièrement observé qu'Ikaros est exprimé dans les CPRs au début du développement tandis qu'à des stades plus avancés son expression devient alors restreinte à une sous-population pour finalement être absente dans l'ensemble des CPRs aux derniers stades du développement de la rétine. De plus, chez la rétine adulte, Ikaros est exprimé dans les neurones différenciés de type précoce. En effectuant une analyse clonale à l'aide de rétrovirus, nous avons montré qu'en induisant l'expression d'Ikaros dans les CPRs à des stades tardifs, où il n'est normalement pas exprimé, il est possible d'induire la production de cellules de type précoce au dépend des cellules produites tardivement. De plus, l'analyse de souris dont le gène Ikaros à été inactivé nous a révélé que plusieurs cellules nées précocement au cours du développement sont manquantes. L'ensemble de ces résultats suggère donc un modèle dans lequel l'expression d'Ikaros est à la fois nécessaire et suffisante pour conférer une compétente temporelle précoce au CPRs. Une fois la diversité cellulaire générée, des vagues d'apoptoses successives ont lieu de manière à éliminer les cellules extranuméraires ou corriger les erreurs de connections. La mort cellulaire programmée ou apoptose est donc un procédé essentiel au développement du système nerveux. Cependant, les régulateurs extracellulaires de cette mort cellulaire developpementale restent toutefois très méconnus. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la voie de signalisation du CNTF/LIF durant le développement rétinien in vivo. Nous démontrons que l'exposition au CNTF durant le développement postnatal de la rétine in vivo retarde l'expression de la rhodopsine et résulte en un important déficit spécifique en photorécepteurs. Plus spécifiquement, nous montrons que l'exposition au CNTF induit une augmentation importante de la mort cellulaire des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets. De plus, nous montrons que le blocage de la voie du CNTF/LIF durant le développement de la rétine de souris in vivo résulte en une diminution significative de la mort cellulaire developpementale des photorécepteurs. Nous démontrons aussi que la voie CNTF/LIF est responsable de l'apoptose spécifique des photorécepteurs issuent de clones contenant seulement des photorécepteurs sans toutefois affecter les photorécepteurs issuent de clones mixtes. Nous avons observé que la stimulation ou le blocage de la voie du CNTF/LIF contrôle l'expression génique des isoformes neuronale et endotheliale de la synthase d'oxide nitrique (NOS) et la production subséquente d'oxide nitrique (NO) à partir de ces enzymes est responsable de l'apoptose induite par CNTF . Ces résultats suggèrent donc que la voie de signalisation du CNTF/LIF est active au cours du dévelopement rétinien et agit via la régulation de la production d'oxide nitrique afin de moduler la mort cellulaire programmée des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets.

La greffe de cellules souches hématopoïétiques autologue est une thérapie de plus en plus utilisée. Cependant, les traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie intensifs peuvent affecter les cellules souches et diminuer le nombre de ces cellules pouvant être mobilisées à des fins de transplantation. Il serait donc très utile de pouvoir expandre ces cellules souches afin de s’assurer qu’elles soient en quantité suffisante pour procéder à la greffe. Or, il a été démontré que la protéine HOXB4 a la capacité d’expandre les cellules souches hématopoïétiques humaines et murines. Lors d’une greffe autologue, la moelle osseuse est cependant colonisée par des cellules malignes. Notre objectif était donc de s’assurer que la protéine HOXB4 expand les cellules souches hématopoïétiques normales mais n’expand pas les cellules « souches » leucémiques. De plus, comme des expériences précédentes ont démontré que chez des souris transplantées avec des cellules souches surexprimant HOXB4, la reconstitution du système hématopoïétique pouvait favoriser les cellules myéloïdes aux dépends des cellules lymphoïdes, nous avons aussi voulu déterminer l’impact de HOXB4 sur la différenciation des cellules progénitrices lymphoïdes normales. Pour ce faire, nous avons exposé des cellules humaines et murines à la protéine HOXB4 afin de comparer la prolifération des cellules B malignes à celle des cellules B normales. De plus, nous avons évalué l’impact de HOXB4 sur les cellules B à leurs différents stades de différenciation. Nos résultats démontrent que HOXB4 ne favorise pas l’expansion des cellules leucémiques. De plus, nous avons observé que les cellules lymphoïdes surexprimant la protéine HOXB4 ont un ralentissement dans leur processus de différenciation. Aussi, la surexpression de HOXB4 entraîne une diminution de la fréquence et du nombre de progéniteurs lymphoïdes normaux. Ces résultats démontrent donc que la protéine HOXB4 ne produit pas d’expansion des cellules malignes. De plus, elle confère un désavantage prolifératif aux cellules lymphoïdes. / Transplantation of autologous hematopoietic stem cell is increasingly used. However, intensive chemotherapy or radiation therapy protocols can affect stem cells and decrease the number of these cells that can be mobilized for stem cell transplantation. There is therefore a need to create protocols for the expansion of these stem cells to increase their numbers sufficiently to proceed to transplantation. It has been demonstrated that the protein HOXB4 has the ability to expand human and murine hematopoietic stem cells. In the context of autologous transplantation, the bone marrow is often colonized by malignant cells. Our objective was to ensure that the protein HOXB4 expands normal hematopoietic stem cells but not leukemia "stem" cells. In addition, since previous experiments have shown that in mice transplanted with stem cells overexpressing HOXB4, hematopoietic reconstitution could favour myeloid cells over lymphoid cells, we determined the impact of HOXB4 on the differentiation of normal lymphoid progenitor cells. Toward this goal, we have exposed human and mouse leukemia cells to HOXB4 and compared the proliferation of malignant versus normal B cells. In addition, we have evaluated the impact of HOXB4 on the different stages of B cell differentiation. Our results show that HOXB4 does not favour leukemia cell expansion. In addition, we observed that lymphoid cells overexpressing HOXB4 are slowed in their differentiation process. Also, HOXB4 overexpression decreases the frequency and number of normal lymphoid progenitors. These results demonstrate that HOXB4 protein does not lead to malignant stem cell expansion. In addition, the HOXB4 protein confers a proliferative disadvantage to lymphoid cells.

La cryoconservation de cortex ovarien est la seule technique envisageable pour les patientes pré-pubères et les femmes dont la pathologie nécessite l’administration d’un traitement hautement gonadotoxique dont l’initiation ne peut être différée. L’autotransplantation est jusqu’à présent la seule méthode disponible de réutilisation du tissu ovarien cryoconservé, et a permis d’obtenir plus de 130 naissances dans le monde, dont trois au CHRU de Besançon. Toutefois, en cas de pathologie néoplasique à risque de localisation métastatique ovarienne, cette technique peut présenter un risque de réintroduction de cellules malignes susceptibles d’être présentes dans le greffon. Des méthodes alternatives à l’autogreffe de tissu ovarien cryopréservé fondées sur l’utilisation de follicules ovariens isolés sont actuellement en développement. L’objectif de cette thèse a été de développer un protocole permettant l’isolement et la qualification de follicules ovariens qui pourront être utilisés en thérapie cellulaire à usage humain. Dans un premier temps, une validation de la technique d’isolement de follicules ovariens a été réalisée à partir de la dissociation de fragments de cortex ovarien, issus de patientes ayant subit une résection percœlioscopique, à l’aide d’une collagénase NB6 produite selon les bonnes pratiques de fabrication. Les follicules ainsi obtenus ont été analysés en termes de viabilité (immédiate et après culture in vitro), rendement, morphologie et état prolifératif. Dans un deuxième temps, la sécurité carcinologique des suspensions folliculaires obtenues après isolement a été évaluée par cytométrie en flux multicouleurs à l’aide d’une modélisation ayant consisté en la contamination de suspensions folliculaires avec des cellules leucémiques issues de patients souffrant de leucémies aigües myéloïdes (LAM) ou lymphoblastiques (LAL) d’immunophénotype connu. La collagénase NB6 a permis l’isolement d’un grand nombre de follicules vivants, principalement au stade primordial, et dont la majorité était non activée, même après trois jours de culture in vitro dans un gel de fibrine. La technique d’isolement suivie de trois lavages a permis d’éliminer les cellules leucémiques préalablement ajoutées aux suspensions folliculaires dans 23 cas sur 24, sans endommager les follicules isolés. La cytométrie en flux multicouleurs est une technique d’analyse efficace pour évaluer la contamination, par des cellules leucémiques, de suspensions contenant des follicules ovariens isolés. Le protocole d’isolement de follicules ovariens humains, ayant été réalisé avec la collagénase NB6 de grade clinique, peut être envisagé pour une reconstruction ovarienne à visée thérapeutique humaine. / The cryopreservation of ovarian cortex is the only technique available for prepubertal girls and women when their pathology requires the administration of a highly gonadotoxic treatment whose initiation cannot be delayed. Autotransplantation has so far been the only available method to re-use cryopreserved ovarian tissue, and has resulted in more than 130 births worldwide, including three at the Besançon Hospital. However, in cases of neoplastic disease with a risk of ovarian metastatic localization, this technique may present a risk of reintroducing malignant cells likely to be present in the graft. Alternative methods to cryopreserved ovarian tissue autograft based on the use of isolated ovarian follicles are currently under development. The aim of this thesis was to develop a protocol allowing the isolation and the qualification of ovarian follicles that can be used in cell therapy for human purposes. In a first step, a validation of the technique to isolate ovarian follicles was carried out from the dissociation of cortical ovarian fragments, taken from patients undergoing a laparoscopic ovarian drilling, using collagenase NB6 which is produced according to good manufacturing practices. Follicles thus obtained were analyzed in terms of viability (before and after in vitro culture), yield, morphology and proliferative state. In a second step, the carcinologic safety of follicular suspensions obtained after isolation was evaluated by multicolor flow cytometry using a model involving the contamination of follicular suspensions with leukemic cells from patients suffering from acute myeloid leukemia (AML) or acute lymphoblastic leukemia (LAL) with known immunophenotype. Collagenase NB6 has allowed the isolation of a large number of viable follicles, mostly at the primordial stage and the majority of which were unactivated even after three days of in vitro culture in a fibrin matrice. Our isolation technique followed by three washes has allowed the elimination of leukemic cells previously added to follicular suspensions, in 23 out of 24 cases, without damaging isolated follicles. Multicolor flow cytometry is an effective analytical technique for assessing leukemic cell contamination of suspensions containing isolated ovarian follicles. The protocol to isolate human ovarian follicles, performed with the clinical grade collagenase NB6, may be considered for an ovarian reconstruction to human therapeutic purposes.

La greffe de cellules souches hématopoïétiques autologue est une thérapie de plus en plus utilisée. Cependant, les traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie intensifs peuvent affecter les cellules souches et diminuer le nombre de ces cellules pouvant être mobilisées à des fins de transplantation. Il serait donc très utile de pouvoir expandre ces cellules souches afin de s’assurer qu’elles soient en quantité suffisante pour procéder à la greffe. Or, il a été démontré que la protéine HOXB4 a la capacité d’expandre les cellules souches hématopoïétiques humaines et murines. Lors d’une greffe autologue, la moelle osseuse est cependant colonisée par des cellules malignes. Notre objectif était donc de s’assurer que la protéine HOXB4 expand les cellules souches hématopoïétiques normales mais n’expand pas les cellules « souches » leucémiques. De plus, comme des expériences précédentes ont démontré que chez des souris transplantées avec des cellules souches surexprimant HOXB4, la reconstitution du système hématopoïétique pouvait favoriser les cellules myéloïdes aux dépends des cellules lymphoïdes, nous avons aussi voulu déterminer l’impact de HOXB4 sur la différenciation des cellules progénitrices lymphoïdes normales. Pour ce faire, nous avons exposé des cellules humaines et murines à la protéine HOXB4 afin de comparer la prolifération des cellules B malignes à celle des cellules B normales. De plus, nous avons évalué l’impact de HOXB4 sur les cellules B à leurs différents stades de différenciation. Nos résultats démontrent que HOXB4 ne favorise pas l’expansion des cellules leucémiques. De plus, nous avons observé que les cellules lymphoïdes surexprimant la protéine HOXB4 ont un ralentissement dans leur processus de différenciation. Aussi, la surexpression de HOXB4 entraîne une diminution de la fréquence et du nombre de progéniteurs lymphoïdes normaux. Ces résultats démontrent donc que la protéine HOXB4 ne produit pas d’expansion des cellules malignes. De plus, elle confère un désavantage prolifératif aux cellules lymphoïdes. / Transplantation of autologous hematopoietic stem cell is increasingly used. However, intensive chemotherapy or radiation therapy protocols can affect stem cells and decrease the number of these cells that can be mobilized for stem cell transplantation. There is therefore a need to create protocols for the expansion of these stem cells to increase their numbers sufficiently to proceed to transplantation. It has been demonstrated that the protein HOXB4 has the ability to expand human and murine hematopoietic stem cells. In the context of autologous transplantation, the bone marrow is often colonized by malignant cells. Our objective was to ensure that the protein HOXB4 expands normal hematopoietic stem cells but not leukemia "stem" cells. In addition, since previous experiments have shown that in mice transplanted with stem cells overexpressing HOXB4, hematopoietic reconstitution could favour myeloid cells over lymphoid cells, we determined the impact of HOXB4 on the differentiation of normal lymphoid progenitor cells. Toward this goal, we have exposed human and mouse leukemia cells to HOXB4 and compared the proliferation of malignant versus normal B cells. In addition, we have evaluated the impact of HOXB4 on the different stages of B cell differentiation. Our results show that HOXB4 does not favour leukemia cell expansion. In addition, we observed that lymphoid cells overexpressing HOXB4 are slowed in their differentiation process. Also, HOXB4 overexpression decreases the frequency and number of normal lymphoid progenitors. These results demonstrate that HOXB4 protein does not lead to malignant stem cell expansion. In addition, the HOXB4 protein confers a proliferative disadvantage to lymphoid cells.

L'ostéoporose a une forte composante génétique et est caractérisée par une faible densité osseuse. Le récepteur de LIF (LIFR) a un rôle dans la régulation du métabolisme osseux. Le but de cette étude est d'étudier les associations de 3 single nucleotide polymorphisms (SNP) de LIFR (s 1043, s 1045 et s 1046) et différentes mesures osseuses chez des femmes canadiennes françaises. Tous les génotypes ont été déterminés avec une méthode PCR allèle-spécifique. Les SNPs étaient testés par ANCOVA incluant les principaux facteurs environnementaux confondants. Les haplotypes ont été testés. Nous avons trouvé qu'au niveau des vertèbres chez les femmes préménopausées s 1045 (homozygote rare, C/C) était associé avec une densité osseuse élevée (p=0,036) et s 1046 (homozygote rare, T/T) était associé avec une densité osseuse faible (p=0,047). Un haplotype (C-A-A) était associé avec une densité osseuse au talon faible. Ces résultats suggèrent que des variants de LIFR pourraient contribuer à la régulation génétique du métabolisme osseux.