Orientador: Augusto Ducati Luchessi / Banca: Alice Cristina Rodrigues / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Resumo: O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) caracteriza-se por ser a única proteína conhecida que apresenta o aminoácido hipusina, formado a partir de uma modificação pós-traducional chamada hipusinação. Apesar de originalmente eIF5A ter sido denominado como fator de início de tradução, a função de eIF5A têm sido relacionada principalmente com a etapa de elongação da tradução. Desde 2013, trabalhos importantes apresentaram evidências de que eIF5A hipusinado possui um papel fundamental na tradução de mRNAs específicos de proteínas que contém consecutivos resíduos de aminoácidos prolina (PPP ou PPG). Tendo em vista estas informações, o objetivo principal deste trabalho consiste no estudo da dependência de eIF5A na tradução da proteína ribosomal S6 kinase 2 (S6K2), pois a mesma apresenta em sua extremidade C-terminal uma região contendo cinco resíduos consecutivos de prolinas. Neste contexto, por meio da produção de uma proteína mutante (S6K2∆Pro), substituindo a região de poli-prolina de S6K2 pela sequência correspondente da proteína homóloga ribosomal S6 kinase 1 (S6K1), foram avaliadas a produção e habilidade fosforilativa da proteína mutante em comparação com S6K2 selvagem. Observou-se que S6K2ΔPro é produzida e sua superexpressão aumenta o conteúdo da proteína ribossomal S6 fosforilada, principal alvo de fosforilação das proteínas S6Ks, assim como a superexpressão das proteínas S6K1 e S6K2. Análises de silenciamento gênico em células HeLa, utilizando moléculas de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A), which is highly conserved among eukaryotes, contain the unusual amino acid hypusine, synthesized by a posttranslational modification called hypusination. Even though eIF5A was first denominated as an initiation factor, it has been related to elongation step of the translation process. Since 2013, many studies proposed that eIF5A acts on rescue the ribosome stalling promoted by synthesis of poly-proline motifs containing PPP or PPG sequences. The aim of this study is to evaluate the eIF5A dependence on Ribosomal S6 kinase 2 protein (S6K2) translation, once S6K2 contains a poly-proline stretch on its C-terminus with five consecutive prolines (PPPPP). By producing a mutant protein (S6K2Pro), replacing the polyproline motif on S6K2 for the same region found on homologous protein Ribosomal S6 kinase 1 (S6K1), the content and phosphorylation activity were evaluated. It was observed that S6K2ΔPro is produced by HeLa cells and its RPS6 phosphorylation ability, which is the mainly target of S6Ks phosphorylation, is maintained. Analyzes using siRNA molecules for eIF5A gene silencing in HeLa cells have shown that the endogenous S6K2 protein does not have its content altered as a function of the depletion of the eIF5A content, under the conditions evaluated. Furthermore, by regulating the TIF51A gene expression (homologous of the human EIF5A gene) in Saccharomyces cerevisiae it was observed that the translation of S6K2 was only sli... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:27Z : No. of bitstreams: 1 000854092.pdf: 4152129 bytes, checksum: 2349bde07b4af6efb99d75bc7ad08203 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico (PADC) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP / O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes... / The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/... / FAPESP: 11/50801-4

Orientador : Sandro Roberto Valentini / Coorientadora: Brenda Jean Andrews / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Jorg Kobarg / Banca: Monica Montero Lomeli / Banca: Iran Malavazi / Banca: Mario Henrique Bengtson / Resumo: O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes... / Abstract: The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/... / Doutor