Orientador: Francesco Langone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T17:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hussein_Fernanda_M.pdf: 13730743 bytes, checksum: 0ded9b4ee837e3040ae51d3a2c5d6b02 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As células tronco são células indiferenciadas capazes de se auto replicar e de se diferenciar em diversos tipos celulares maduros com funções especializadas. As células tronco de medula óssea são particularmente interessantes por serem células multipotentes, ou seja, geram células de diversos tecidos, são de fácil obtenção através da aspiração da medula óssea femural e eliminam os problemas de rejeição por ser possível realizar transplante autólogo.As células de Schwann são um dos tipos celulares mais importantes do Sistema Nervoso Periférico (SNP). Elas são uma fonte de sinais para a geração e desenvolvimento dos nervos periféricos, da mielinização e, ainda, auxiliam na regeneração axonal no caso de lesões tanto do SNP quanto do SNC. Os estudos enfocando a indução da diferenciação de células progenitoras a tipos celulares específicos desejados estão em seus passos iniciais. Já são conhecidos diversos fatores que favorecem o desenvolvimento de um determinado tipo celular a partir de células progenitoras in vitro. Contudo, permanecem desconhecidos os fatores intrínsecos ao organismo que induzem esse processo. Faz-se necessário portanto que se investigue, ainda in vitro, porém sem manipulações exógenas e mimetizando o microambiente corpóreo, quais fatores endógenos são os responsáveis pela deflagração do processo de diferenciação. Neste sentido, o Meio Condicionado por células de Schwann mostrou exercer efeitos importantes sobre as células mesenquimais de medula óssea, promovendo sua proliferação e possivelmente induzindo o processo de diferenciação nestas células. Ainda, a Eletroforese 2DE comparativa mostrou uma similaridade maior entre CS e CMMO do que com as CMMO cultivadas em MC, indicando que esta última poderia estar sofrendo um processo de diferenciação celular, diferentemente das CS e das CMMO / Abstract: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) are capable to differentiate into several cell types. The differentiation depends on culture media molecules signaling. In this study we investigated the effect of Schwann cell conditioned media on BMMSC morphology and molecular phenotype. Schwann cells (SC) were isolated from adult Wistar rats sciatic nerve (Glia, 17: 327-338, 1996) and were cultivated in DMEM plus 10% FBS (D10). Every 48 hours the SC conditioned media (CM) were collected and stored at -80°C. The BMMSC were isolated from adult Wistar rats femur bone marrow (PNAS, 95:3908-3913,1995). BMMSC were maintained in D10. Subsequently, they were cultivated in CM for 7, 14 and 21 days. After 14 days in CM it was detected changes on the BMMSC typical flattened morphology to the SC bipolar morphology. The frequency of these changes increased after 21 days. These changes have been followed by changes on immunoreactivity and S100b protein localization on BMMSC. Before they were cultivated in CM, the BMMSC showed low immunoreactivity to S100b protein on cytoplasm. Culture in CM generated a S100b label gradual increase and it was found in nuclear compartment. Only the nucleous was S100b labeled, after 21 days. On the other hand, the bipolar morphology cells showed cytoplasmatic and nuclear S100b+. These findings agree with Deloume et al. (Mol. Cell. Neurosci. 27:453-465, 2004) about the S100b immunolabelling during the differentiation of glial progenitor cells into oligodendrocytes. Our results suggest that molecules present in CM are capable of inducing phenotypes changes related with the S100b expression and it roles on differentiation of BMMSC into SC. Moreover, 2DE electrophoresis shown a extent similarity between SC and BMMSC. This result suggests that the BMMSC cultivated in CM could be in a differentiation process / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maturana_LuizGabriel_M.pdf: 2526914 bytes, checksum: 3d865f49f9fe14bd6f32ac9c00fc5846 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A axotomia periférica é uma lesão que resulta na perda de continuidade do nervo lesado. No sentido de repará-la, foram desenvolvidas diversas técnicas, entre elas o autoenxerto e a tubulização com próteses de polietileno e biorreabsorvíveis. Esta última tem a vantagem de ser confeccionada com a dimensão e forma desejada, sustentar o processo regenerativo, orientando o brotamento axonal e sofrer degradação de acordo com tempo de implantação. Apesar da grande capacidade regenerativa do sistema nervoso periférico, há a dependência da expressão correta de fatores de crescimento e rearranjo dos componentes da matriz extracelular pelas células de Schwann. Um dos componentes presentes na matriz extracelular, o colágeno, pode ser produzido com organização supramolecular e ser utilizado no preenchimento de próteses biorreabsorvíveis. Devido às características positivas das próteses reabsorvíveis, a importância das células de Schwann e do colágeno, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro e in vivo a influência do colágeno com organização supramolecular em relação à regeneração nervosa periférica fazendo uso das técnicas de cultura purificada de células de Schwann e tubulização do nervo isquiático. No estudo in vitro foram cultivadas células de Schwann sobre o colágeno com organização supramolecular, sendo estas avaliadas através da imunocitoquímica e microscopia eletrônica de varredura. Os resultados revelaram uma cultura celular com alto grau de pureza, observados pela intensa marcação com o anticorpo anti-S-100. Além disso, observou-se que a concentração de células de Schwann foi menor no grupo com o colágeno com organização supramolecular, apesar das células de Schwann terem mantido a expressão de componentes da lâmina basal, bem como alterado sua morfologia para se ajustar na superfície do substrato. Para o estudo in vivo, foram utilizados ratos da linhagem Sprague Dawley, fêmeas e adultas divididas em 4 grupos: 1) TP - animais em que foi utilizada a prótese tubular de polietileno vazia (n=7); 2) TPCL - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=5); 3) TPCLF - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de policaprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=7); 4) AE - animais que receberam autoenxerto de nervo periférico (n=5). Os resultados in vivo foram estudados através da quantificação das fibras regeneradas, morfometria dos nervos regenerados e microscopia eletrônica de transmissão 60 dias pós-cirúrgico. Além disso, o estudo in vivo incluiu análises de imunoistoquímica e microscopia de polarização 60 dias pós-cirúrgicos onde, os espécimes utilizados foram divididos em 3 grupos: 1) normal - foram utilizados nervos isquiáticos normais (n=3); 2) TPCL - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=3); 3) TPCLF - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=3). Observaram-se, na quantificação dos axônios, valores significativamente maiores para o grupo AE em relação aos outros grupos. Também se destacam valores superiores observados nos grupos TPCL e TPCLF comparados ao grupo TP. Quanto à morfometria, merecem ênfase os valores obtidos na espessura da bainha de mielina que exibiu diferenças estatisticamente significativas, demonstrando melhor comportamento das células de Schwann na regeneração nervosa periférica para o grupo TPCLF. Os dados de microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de polarização nos permitem considerar que a organização geral do nervo e do microambiente apresentou um padrão com analogia voltado ao nervo isquiático ileso. Ainda, os resultados referentes à imunoistoquímica, utilizando como marcador o anticorpo anti-p75NTR, demonstraram que as células de Schwann estavam mais reativas durante o processo regenerativo no grupo TPCLF comparado aos grupos TPCL e nervo isquiático ileso. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram que o implante de colágeno com organização supramolecular influenciou/estimulou significativamente o comportamento das células de Schwann tanto in vitro como in vivo. / Abstract: The present study investigated in vitro and in vivo the influence of naturally supraorganized collagen on the peripheral nerve regeneration. In the in vitro study, Schwann cells (SCs) were seeded on naturally supraorganized collagen membranes and evaluated with immunocytochemistry and scanning electron microscopy. The results revealed that SCs kept the expression of basal lamina components and adjusted their morphology to populate the membrane surface. For the in vivo study, adult female Sprague Dawley rats were divided into 4 groups: 1) TP - animals that received an empty polyethylene tube (n=7); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=5); 3) TPCLF - animals in which a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment was used (n=7); 4) AE - animals in which the nerve repair was carried out with an autologous nerve graft (n=5). The in vivo results were examined by counting of myelinated axons, morphometrical analysis of regenerated fibers and transmission electron microscopy, 60 days after surgery. Moreover, the in vivo study included immunohistochemical analysis and polarization microscopy. In this case, the specimens were obtained from one of 3 groups: 1) normal - normal sciatic nerves (n=3); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=3); 3) TPCLF - animals in which the nerve repair was carried out with a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment (n=3). The counting of myelinated axons provided significantly higher values in the AE group as compared to the other groups. Also, TPCL and TPCLF groups displayed higher values when compared to TP group. Regarding the morphometrical analysis, myelin thickness was greater in TPCLF group, indicating a better SC response during the regeneration process. The data regarding transmission electron microscopy and polarization microscopy indicates that TPCLF group achieved a better reorganization of the regenerated nerve microenvironment, resembling the normal nerve morphology. The immunohistochemical results were reinforced by the anti-p75NTR labeling, that demonstrated more active SC in the TPCLF group. The present results indicate that the use of naturally supraorganized collagen positively influenced/stimulated peripheral nerve regeneration possibly by increasing the activity of SC inside the prosthesis. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural