Orientador: Humberto Santo Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Boni_RobsonAparecidodosSantos_M.pdf: 2053465 bytes, checksum: ae91ac2421ee67ae72964df4c510de03 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A distrofina é uma proteína de membrana ligada ao citoesqueleto da matriz extracelular das fibras musculares (esqueléticas e cardíacas) e nervosas. Enquanto que o papel da distrofina e os efeitos de sua ausência são bem conhecidos nos camundongos mdx (modelo animal da distrofia muscular de Duchenne), sabe-se pouco sobre sua função em nervos periféricos. A distrofina parece ser importante para o crescimento axonal, no sistema trigeminal a sua falta leva a defasciculação do sistema olfatório de camundongos. Em casos de ausência de distrofina a eliminação sináptica ocorre precocemente à expressão de moléculas pré-sinapticas é reduzida e a habilidade das células de Schwann terminais de guiarem as fibras para reinervação muscular fica comprometida. Estes achados sugerem que a distrofina possui papel essencial na regeneração nervosa periférica. Para testar esta hipótese nós examinamos a regeneração nervosa em camundongos mdx. Foram utilizados camundongos adultos machos da linhagem mdx e camundongos da linhagem C57BL/10 como controle, eles foram anestesiados com mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina. O nervo isquiático direito foi exposto e esmagado com uso de uma pinça fina sem ranhuras. Após o evento cirúrgico e cessado o efeito do anestésico os animais foram acondicionados em gaiolas e submetidos a regime hídrico e alimentar "ad libitum" com ciclo fotoperiódico claro/escuro de 12 horas. Destes, um grupo foi tratado com injeções intraperitoneais de L-arginina (6mg/kg) diluído em água bidestilada. Seis e 21 dias após o esmagamento os animais foram anestesiados e perfundidos por via intracardíaca com solução de Karnovsky. O nervo isquiático foi removido e imerso em fixador por 24 horas e pós-fixado em tetróxido de ósmio 1% por 2 horas. Posteriormente foram inclusos em blocos e feitos cortes semifinos que foram corados com azul de toluidina 0,5%. As secções foram analisadas em fotomicroscópio NIKON ECLIPSE E-400 (NIKON, Inc.). A densidade dos axônios com mielina (6dias) e axônios em regeneração (21 dias) foram contados. Nossos resultados demonstraram que a densidade de axônios com mielina foi significantemente maior no mdx em comparação ao C57BL/10 (312±10,2/mm2 versus 213,8±4,6/mm2). A densidade de macrófagos e células de Schwann com restos de mielina foram respectivamente 77,6±5,6/mm2 e 148±2,4/mm2. Após 21 dias, todos os parâmetros (diâmetro do axônio, espessura da bainha de mielina e número de axônios regenerados) foram significantemente menores nos camundongos mdx. Nos camundongos tratados com L-arginina os parâmetros foram semelhantes ao controle não havendo diferença estatística. Os resultados mostraram que o papel da distrofina e do óxido nítrico são de fundamental importância na regeneração nervosa periférica. / Abstract: Dystrophin is a membrane protein that links the cytoskeleton to the extracellular matrix in skeletal and cardiac muscle fibers and in the nervous system. While the role of dystrophin is well established and the effects of dystrophin loss, as it occurs in the mdx mice model of Duchenne muscular dystrophy, have been widely examined in muscle fibers, less is known about dystrophin function in peripheral nerves. It seems to be important for axonal outgrowth in the trigeminal system and the lack of dystrophin leads to nerve defasciculation in the mouse olfactory system. In the absence of dystrophin, synapse elimination occurs earlier, expression of presynaptic molecules is reduced and the ability of terminal Schwann cells to guide reinnervation of muscle fibers is impaired. These findings suggest a potential role of dystrophin in the regeneration of peripheral nerves. To test this hypothesis we examined nerve regeneration in mdx mice. Adult male mdx and control C57Bl/10 mice were anesthetized with a mixture of ketamine hydrochloride and thyazine hydrochloride. Right sciatic nerve was exposed at mid thigh and crushed with a fine forceps. The wound was closed and mice were kept with food and water ad libitum in a light-dark cycle of 12hs. One group was treated with L-arginine (6mg/kg) in drinking water. Six and 21 days after nerve crush mice were anesthetized and perfused intracardiacally with Karnovsky solution. Sciatic nerves were excised and fragments were immersed in the same fixative for 24 hours and post-fixed in 1% osmium tetroxide for 2 hours. They were conventionally processed for electron microscopy. Transverse semithin sections were stained with 0.5% toluidine blue. Sections were viewed under a Nikon Eclipse E-400 (Nikon, Inc.) microscope. The density of axons with myelin breakdown, of Schwann cells/macrophages filled with myelin debris (6 days) and of myelinated regenerating axons (3 weeks) were directly counted. Our results demonstrated that the density of axons displaying myelin breakdown was significantly higher in mdx than in crushed C57Bl/10 (312±10,2/mm2 versus 213,8±4,6/mm2) the density of macrophages and Schwann cells with myelin debris were respectively 77,6±5,6/mm2 and 148±2,4/mm2. After 21 days, all parameters (axonal diameter, myelin sheath thickness, number of regenerating axons) were significantly lower in mdx mice. When mdx was treated with L-arginine such parameters were not significantly different from control. These results demonstrated that dystrophin plays a role on nerve regeneration and that nitric oxide may be an important factor in that. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maturana_LuizGabriel_M.pdf: 2526914 bytes, checksum: 3d865f49f9fe14bd6f32ac9c00fc5846 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A axotomia periférica é uma lesão que resulta na perda de continuidade do nervo lesado. No sentido de repará-la, foram desenvolvidas diversas técnicas, entre elas o autoenxerto e a tubulização com próteses de polietileno e biorreabsorvíveis. Esta última tem a vantagem de ser confeccionada com a dimensão e forma desejada, sustentar o processo regenerativo, orientando o brotamento axonal e sofrer degradação de acordo com tempo de implantação. Apesar da grande capacidade regenerativa do sistema nervoso periférico, há a dependência da expressão correta de fatores de crescimento e rearranjo dos componentes da matriz extracelular pelas células de Schwann. Um dos componentes presentes na matriz extracelular, o colágeno, pode ser produzido com organização supramolecular e ser utilizado no preenchimento de próteses biorreabsorvíveis. Devido às características positivas das próteses reabsorvíveis, a importância das células de Schwann e do colágeno, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro e in vivo a influência do colágeno com organização supramolecular em relação à regeneração nervosa periférica fazendo uso das técnicas de cultura purificada de células de Schwann e tubulização do nervo isquiático. No estudo in vitro foram cultivadas células de Schwann sobre o colágeno com organização supramolecular, sendo estas avaliadas através da imunocitoquímica e microscopia eletrônica de varredura. Os resultados revelaram uma cultura celular com alto grau de pureza, observados pela intensa marcação com o anticorpo anti-S-100. Além disso, observou-se que a concentração de células de Schwann foi menor no grupo com o colágeno com organização supramolecular, apesar das células de Schwann terem mantido a expressão de componentes da lâmina basal, bem como alterado sua morfologia para se ajustar na superfície do substrato. Para o estudo in vivo, foram utilizados ratos da linhagem Sprague Dawley, fêmeas e adultas divididas em 4 grupos: 1) TP - animais em que foi utilizada a prótese tubular de polietileno vazia (n=7); 2) TPCL - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=5); 3) TPCLF - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de policaprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=7); 4) AE - animais que receberam autoenxerto de nervo periférico (n=5). Os resultados in vivo foram estudados através da quantificação das fibras regeneradas, morfometria dos nervos regenerados e microscopia eletrônica de transmissão 60 dias pós-cirúrgico. Além disso, o estudo in vivo incluiu análises de imunoistoquímica e microscopia de polarização 60 dias pós-cirúrgicos onde, os espécimes utilizados foram divididos em 3 grupos: 1) normal - foram utilizados nervos isquiáticos normais (n=3); 2) TPCL - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=3); 3) TPCLF - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=3). Observaram-se, na quantificação dos axônios, valores significativamente maiores para o grupo AE em relação aos outros grupos. Também se destacam valores superiores observados nos grupos TPCL e TPCLF comparados ao grupo TP. Quanto à morfometria, merecem ênfase os valores obtidos na espessura da bainha de mielina que exibiu diferenças estatisticamente significativas, demonstrando melhor comportamento das células de Schwann na regeneração nervosa periférica para o grupo TPCLF. Os dados de microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de polarização nos permitem considerar que a organização geral do nervo e do microambiente apresentou um padrão com analogia voltado ao nervo isquiático ileso. Ainda, os resultados referentes à imunoistoquímica, utilizando como marcador o anticorpo anti-p75NTR, demonstraram que as células de Schwann estavam mais reativas durante o processo regenerativo no grupo TPCLF comparado aos grupos TPCL e nervo isquiático ileso. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram que o implante de colágeno com organização supramolecular influenciou/estimulou significativamente o comportamento das células de Schwann tanto in vitro como in vivo. / Abstract: The present study investigated in vitro and in vivo the influence of naturally supraorganized collagen on the peripheral nerve regeneration. In the in vitro study, Schwann cells (SCs) were seeded on naturally supraorganized collagen membranes and evaluated with immunocytochemistry and scanning electron microscopy. The results revealed that SCs kept the expression of basal lamina components and adjusted their morphology to populate the membrane surface. For the in vivo study, adult female Sprague Dawley rats were divided into 4 groups: 1) TP - animals that received an empty polyethylene tube (n=7); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=5); 3) TPCLF - animals in which a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment was used (n=7); 4) AE - animals in which the nerve repair was carried out with an autologous nerve graft (n=5). The in vivo results were examined by counting of myelinated axons, morphometrical analysis of regenerated fibers and transmission electron microscopy, 60 days after surgery. Moreover, the in vivo study included immunohistochemical analysis and polarization microscopy. In this case, the specimens were obtained from one of 3 groups: 1) normal - normal sciatic nerves (n=3); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=3); 3) TPCLF - animals in which the nerve repair was carried out with a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment (n=3). The counting of myelinated axons provided significantly higher values in the AE group as compared to the other groups. Also, TPCL and TPCLF groups displayed higher values when compared to TP group. Regarding the morphometrical analysis, myelin thickness was greater in TPCLF group, indicating a better SC response during the regeneration process. The data regarding transmission electron microscopy and polarization microscopy indicates that TPCLF group achieved a better reorganization of the regenerated nerve microenvironment, resembling the normal nerve morphology. The immunohistochemical results were reinforced by the anti-p75NTR labeling, that demonstrated more active SC in the TPCLF group. The present results indicate that the use of naturally supraorganized collagen positively influenced/stimulated peripheral nerve regeneration possibly by increasing the activity of SC inside the prosthesis. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural