Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la alta demanda de combustibles y la creciente alza en el precio del petróleo es primordial buscar nuevas alternativas energéticas para satisfacer las necesidades de la población. Dentro de este escenario, considerando la abundancia de residuos lignocelulósicos forestales y agroindustriales en nuestro país, la posibilidad de producir bioetanol a partir de éstos parece ser una alternativa bastante atractiva en los aspectos estratégicos y ambientales. La hidrólisis de la celulosa es una de las etapas que tiene mayores posibilidades de ser optimizada con el fin de reducir los costos de producción del bioetanol de segunda generación. Ésta se basa en la utilización de una mezcla de celulasas que causan la depolimerización de la celulosa con el fin de generar azúcares simples (glucosa). Considerando lo anterior, el presente Trabajo de Memoria de Título, tuvo como objetivo la identificación de secuencias pertenecientes a nuevas endoglucanasas que puedan ser utilizadas en el proceso de hidrólisis de celulosa. La estrategia utilizada se dividió en tres etapas principales: (i) la realización de un screening de actividad endoglucanasa sobre un conjunto de hongos de pudrición blanca, para identificar cuales poseían enzimas con esta actividad; (ii) la amplificación por PCR desde DNA genómico y cDNA de fragmentos pertenecientes a secuencias que codifican para estas enzimas, utilizando partidores degenerados diseñados a partir de regiones de homología de endoglucanasas de hongos; y (iii) la amplificación de regiones aledañas a las secuencias obtenidas utilizando la estrategia RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Mediante la utilización de esta metodología, fue posible obtener fragmentos de secuencias de genes de glicosil hidrolasas, los cuales fueron clonados y analizados in sílico, obteniéndose los siguientes resultados: a partir del cDNA se obtuvieron fragmentos de cuatro endoglucanasas y una exoglucanasa. Una de las secuencias de endoglucanasa pertenece a la familia 5 y procede del hongo Polystictus versicolor; la segunda pertenece a la familia 7 y procede de Fusarium oxysporum; una tercera pertenece a la familia 61 y procede del hongo Ganoderma applanatum, mientras que la cuarta pertenece a la familia 61 y procede del hongo Fusarium oxysporum. Las secuencias se compararon con secuencias de endoglucanasas presentes en las bases de datos, encontrándose que poseen un porcentaje de identidad a nivel de secuencia aminoacídica de 93, 100, 58 y 60 % con respecto al mejor alineamiento observado, respectivamente. La secuencia de exoglucanasa proviene del hongo Polystictus versicolor y se clasifica dentro de la familia 7, con un 80% de identidad aminoacídica con respecto al mejor alineamiento observado. De todas las endoglucanasas identificadas en este trabajo, sólo la proveniente del hongo Fusarium oxysporum se encontraba previamente descrita. A partir de DNA genómico, no fue posible obtener fragmentos con utilidad para el proceso de hidrólisis de celulosa. En conclusión, la estrategia utilizada fue exitosa, siendo posible obtener fragmentos de secuencia de tres endoglucanasas de hongos no descritas, que pueden ser potencialmente útiles en el proceso de hidrólisis de celulosa para la producción de bioetanol de segunda generación.

La separación y purificación de una proteína desde una fermentación a gran escala es un elemento crítico en los procesos modernos biotecnológicos, puesto que representa el mayor costo industrial. Es por esto que numerosos estudios se enfocan en mejorar y/o disminuir las etapas de purificación, de manera de aumentar la pureza de la proteína de interés, y al mismo tiempo disminuir los costos de producción. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico a una celulasa del tipo endoglucanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para este estudio se seleccionaron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P), de a lo más 6 aminoácidos, para formar la secuencia del extremo que fue adicionado en el extremo carboxilo terminal de la enzima nativa, mediante la técnica Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las endoglucanasas mutadas Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3. Los cultivos productores de las endoglucanasas modificadas con los extremos hidrofóbicos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas; luego las proteínas fueron recuperadas de la fracción extracelular para la posterior medición de actividad enzimática, proteína total y cálculo de la actividad específica. La adición de extremos hidrofóbicos no afectó la distribución de la actividad enzimática en las fracciones subcelulares, puesto que la endoglucanasa nativa y las mutadas presentaron comportamiento similar: más del 90% de actividad en el medio extracelular y en el periplasma un 6% aproximadamente. Los valores de proteína total demostraron que la endoglucanasa nativa y las mutadas tienen una igual distribución de proteínas, aproximadamente de un 87% en el medio extracelular y 8% en la fracción periplasmática. Con esto, fue posible concluir que la actividad y recuperación de la endoglucanasa no se vio afectada por la adición de los extremos hidrofóbicos. Adicionalmente, las endoglucanasas nativa y modificadas se purificaron por HIC, utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa Fast Flow 6FF. De los cromatogramas obtenidos se midieron los tiempos de retención adimensionales (DRT), de acuerdo a la fracción en la cual eluyó cada una de las endoglucanasas. En todos los cromatogramas se observó una tendencia similar, presentándose dos peaks de actividad tanto para la endoglucanasa nativa como para las modificadas. Esto se atribuye a la presencia de proteasas en el medio que posiblemente fragmentaron a la proteína en un sitio previo al extremo hidrofóbico. Se recomienda para futuros estudios, agregar inhibidores de proteasas para evitar estos sucesos. Por otra parte, se calculó la hidrofobicidad superficial de la endoglucanasa nativa y el aporte de cada extremo polipeptídico, para esto se usó como modelo una endoglucanasa de código pdb 1TVN, que tenía un 88,4 % de identidad a nivel de aminoácidos con la enzima utilizada en este estudio. Las proteínas mutadas presentaron en los valores de DRT un aumento porcentual promedio respecto de la endoglucanasa nativa de 19,7 %, 15,0 %, 14,3 % y 10,9 % para el caso de Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3 respectivamente, los cuales se relacionan con el porcentaje de aumento de la hidrofobicidad superficial total de la proteína (φ), según la recta: DRT = 2,41φ – 19,36 con un R2 = 0,96. Finalmente, se estableció como criterio cualitativo para seleccionar el extremo que reporte mayores mejoras en el proceso de purificación, que no es necesario que el extremo hidrofóbico incluya prolina para que esta proteína extracelular mantenga su actividad. Y como criterios cuantitativos, se estableció que el extremo a adicionar debe tener una hidrofobicidad menor a 500 y que existe una relación lineal entre el aumento de DRT y el aumento de hidrofobicidad.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / El creciente consumo de energía a nivel mundial y la escasez de combustibles fósiles han dado espacio a nuevas fuentes de energía de carácter renovable y con un impacto ambiental menor. Entre estas fuentes de energía aparece el material lignocelulósico, que puede ser utilizado para producir bioetanol de segunda generación, el cual es un sustituyente o complemento de la gasolina utilizada para el transporte terrestre. La producción de bioetanol a partir de material lignocelulósico consta principalmente de tres etapas: pretratamiento, hidrólisis enzimática y fermentación. En el presente trabajo se realizó una comparación entre tres pretratamientos: explosión a vapor, organosolv y líquidos iónicos (utilizándose emimCl en este caso) y dos residuos de distintos tamaños: eucalipto: 1 2 mm; álamo: 1 30 mm. Estas técnicas se compararon por medio de una caracterización física y química, con lo que se estableció el principal efecto que tienen sobre el material y la propiedad más relevante para comprender la conversión de glucosa obtenida en la hidrólisis enzimática. En cuanto al análisis químico se obtuvo que el organosolv generó el material con mayor contenido porcentual de glucosa (eucalipto: 90,12%; álamo: 77,82%), removiendo casi la totalidad de la lignina y parte de la hemicelulosa. La explosión a vapor fue el método que más hemicelulosa removió, pasando de un 17,5% a solo un 4,5% para el eucalipto y de un 17,2% a un 7,2% para el álamo. El material pretratado con emimCl no presentó cambios significativos en su composición química. Por otro lado, la caracterización física del material consistió en medir su área superficial, cristalinidad, grado de polimerización, longitud de fibra y accesibilidad enzimática. En todas ellas, el organosolv presentó condiciones más favorables para la hidrólisis enzimática que los otros pretratamientos. En la hidrólisis que contenía 2% de sólidos, para el material pretratado por organosolv, se obtuvo una conversión de 82,3% para el eucalipto y 70,8% para el álamo, mientras que para la explosión a vapor fueron de 71,9% para el eucalipto y 60,9% para el álamo. Para el material pretratado con emimCl todas las conversiones fueron inferiores al 10%, por lo que se concluyó que el tratamiento no resultó efectivo en las condiciones utilizadas de 60 min a 150°C. Para las hidrólisis de alta consistencia (10% sólidos y 10% glucosa), las conversiones obtenidas fueron inferiores (32 48,3%) debido a limitación en la transferencia de masa convectiva. Sin embargo, las conversiones fueron siempre mayores para el eucalipto debido al menor tamaño de chip inicial. Todas las propiedades físicas fueron afectadas de acuerdo a la teoría, a excepción de la longitud de fibra para el eucalipto, donde el resultado fue afectado por la severidad del pretratamiento. El grado de polimerización post pretratamiento, inferido a partir de la viscosidad, resultó ser el mejor indicador para evaluar la conversión de celulosa a glucosa en la hidrólisis, por lo que se ajustó un polinomio de segundo grado que relaciona esta conversión en función de la viscosidad y el tamaño inicial de chip utilizado. En conclusión, el organosolv resultó ser el pretratamiento que genera las mejores condiciones tanto físicas como químicas para la hidrólisis enzimática en ambas biomasas y el grado de polimerización es el mejor indicador para predecir esto.

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The waste from agricultural and food industry are accessible in large quantity anywhere in the whole world nowadays. Most of these wastes include cellulose (30 - 40 %), hemicellulose (20 - 40 %) and lignine (10 - 20 %). Therefore these waste materials have wide use as the substrates for the microbial growth and the production of the enzymes. The microorganisms are able to use organic compounds from the wastes as the source of energy for the growth and carbon for synthesis of cellular biomass [24]. Wheat and rice straw are possible to use as the substrates for cultivation of the microorganisms and following production of the enzymes. In this thesis the utilization of the wastes from food industry for the production of the enzymes by the microorganisms was studied. We observed utilization of wheat straw as source of energy for growth of tested microorganisms and investigated their ability for the production of oxidoreductase (laccase). The optimalization of growth conditions of Aureobasidium pullulans was proceeded. Further the activity of laccase was studied. Milled wheat straw was used as the substrate. The cultivation was done in the thermoregulator at the temperature of 27°C. The activity of laccase was not found in this thesis. Petri dishes were contaminated by three unknown microoganisms during optimalization of growth of Aureobasidium pullulans. One of them produced laccase in cultivation with straw.

The study of production of hydrolytic enzymes dealt with the production of cellulase and polygalacturonase by two microbial strains - Aspergillus niger and Aureobasidium pullulans. The enzymes were produced in solid-state fermentation system. The wheat straw and sugar beet pulp were used as a substrate. The substrates were moistened by water, mineral solution or by medium with glucose. The effect of mineral solution and glucose on production of these enzymes were monitored during cultivation. The highest production of polygalacturonase was achieved by Aspergillus niger during cultivation on sugar beet pulp moistened by mineral solution. The highest production of cellulase was achieved by Aspergillus niger during cultivation on wheat straw moistened by medium with glucose.

Study of the employment of waste paper to microbial production of cellulase was carried out using Aspergillus niger cultivation on carbon sources that have been waste office paper and cardboard, humidified by no – carbon medium or distiled water. Cultivation took place in the SSF way in Erlenmeyer flasks and columns. Concentration of extracellular proteins, cellulase and protease activity for selected samples were monitored. It was found that the most advantageous method of cultivation in terms of cellulase activity production is the cultivation in the column washing by no – carbon medium in three day intervals.

Production of cellulase and polygalacturonase by Aspergillus niger and Aureobasidium pullulans was studied in submerged (SmF) and solid state fermentation (SSF) systems. Substrates used in fermentation systems were mandarin peels and grape pomace. With Aspergillus niger used on grape pomace as a sole carbon source, cellulase production was detected after 72 hours in SSF and after 24 hours in SmF systems. The activity of cellulase per gram of substrate was higher in a submerged than in a solid state fermentation system. The longer time for higher polygalacturonase production was necessary in submerged fermentation systems and polygalacturonase activity was higher in SmF. The SSF fermentation with mandarin peels as a sole carbon source was similar, the highest detected activity of cellulase was determined after 72 hours. Different production of polygalacturonase was observed on mandarin peels in SmF systems. A comparison of enzyme productivities on grape pomace and mandarin peels showed that polygalacturonase activity per gram of substrate is highest in SmF system with mandarin peels as a sole carbon source. With Aureobasidium pullulans used on grape pomace as a sole carbon source, cellulase production was detected after 48 hours in SmF and SSF fermentation systems. The activity of cellulase per gram of substrate was higher in solid state system than in a submerged fermentation system. Longer time for higher polygalacturonase production was necessary in both fermentation systems. Polygalacturonase activity was higher in SmF. The SSF fermentation with mandarin peels as a sole carbon source was similar, the highest detected activity of cellulase was determined after 48 hours. Different production of polygalacturonase was observed on mandarin peels in SmF systems. A comparison of enzyme productivities on grape pomace and mandarin peels showed that polygalacturonase activity per gram of substrate is highest in SmF system with mandarin peels as a sole carbon source. For both systems and both substrates manganese-dependent peroxidase was detected for the first time. Differences in the enzyme synthesis by Aspergillus niger and Aureobasidium pullulans depend on both the substrates used as well as on the fermentation system.