Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la alta demanda de combustibles y la creciente alza en el precio del petróleo es primordial buscar nuevas alternativas energéticas para satisfacer las necesidades de la población. Dentro de este escenario, considerando la abundancia de residuos lignocelulósicos forestales y agroindustriales en nuestro país, la posibilidad de producir bioetanol a partir de éstos parece ser una alternativa bastante atractiva en los aspectos estratégicos y ambientales. La hidrólisis de la celulosa es una de las etapas que tiene mayores posibilidades de ser optimizada con el fin de reducir los costos de producción del bioetanol de segunda generación. Ésta se basa en la utilización de una mezcla de celulasas que causan la depolimerización de la celulosa con el fin de generar azúcares simples (glucosa). Considerando lo anterior, el presente Trabajo de Memoria de Título, tuvo como objetivo la identificación de secuencias pertenecientes a nuevas endoglucanasas que puedan ser utilizadas en el proceso de hidrólisis de celulosa. La estrategia utilizada se dividió en tres etapas principales: (i) la realización de un screening de actividad endoglucanasa sobre un conjunto de hongos de pudrición blanca, para identificar cuales poseían enzimas con esta actividad; (ii) la amplificación por PCR desde DNA genómico y cDNA de fragmentos pertenecientes a secuencias que codifican para estas enzimas, utilizando partidores degenerados diseñados a partir de regiones de homología de endoglucanasas de hongos; y (iii) la amplificación de regiones aledañas a las secuencias obtenidas utilizando la estrategia RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Mediante la utilización de esta metodología, fue posible obtener fragmentos de secuencias de genes de glicosil hidrolasas, los cuales fueron clonados y analizados in sílico, obteniéndose los siguientes resultados: a partir del cDNA se obtuvieron fragmentos de cuatro endoglucanasas y una exoglucanasa. Una de las secuencias de endoglucanasa pertenece a la familia 5 y procede del hongo Polystictus versicolor; la segunda pertenece a la familia 7 y procede de Fusarium oxysporum; una tercera pertenece a la familia 61 y procede del hongo Ganoderma applanatum, mientras que la cuarta pertenece a la familia 61 y procede del hongo Fusarium oxysporum. Las secuencias se compararon con secuencias de endoglucanasas presentes en las bases de datos, encontrándose que poseen un porcentaje de identidad a nivel de secuencia aminoacídica de 93, 100, 58 y 60 % con respecto al mejor alineamiento observado, respectivamente. La secuencia de exoglucanasa proviene del hongo Polystictus versicolor y se clasifica dentro de la familia 7, con un 80% de identidad aminoacídica con respecto al mejor alineamiento observado. De todas las endoglucanasas identificadas en este trabajo, sólo la proveniente del hongo Fusarium oxysporum se encontraba previamente descrita. A partir de DNA genómico, no fue posible obtener fragmentos con utilidad para el proceso de hidrólisis de celulosa. En conclusión, la estrategia utilizada fue exitosa, siendo posible obtener fragmentos de secuencia de tres endoglucanasas de hongos no descritas, que pueden ser potencialmente útiles en el proceso de hidrólisis de celulosa para la producción de bioetanol de segunda generación.

Ingeniera Civil en Biotecnología / En las últimas décadas se han estudiado y utilizado las energías renovables no convencionales como una alternativa a los combustibles fósiles. Dentro de éstas se encuentra el bioetanol de segunda generación, producido a partir de residuos lignocelulósicos, siendo la hidrólisis de celulosa una de las etapas claves en el proceso productivo. Uno de los métodos de hidrólisis, es el uso de enzimas producidas por hongos de pudrición que degradan naturalmente la madera. Bajo este marco se define el objetivo general de este trabajo, que es estudiar la producción de proteínas hidrolíticas para la degradación de lignocelulosa por el hongo de pudrición blanca Trametes versicolor. La metodología se dividió en dos ejes principales: definir las condiciones de cultivo de T. versicolor que induzcan la producción de proteínas hidrolíticas, y caracterizar tales proteínas mediante ensayos de actividad de celulasas y ligninasas, utilizando sustratos puros y paja de trigo. El cultivo del hongo se realizó a 28ºC, 50 rpm de agitación y en oscuridad. El medio elegido fue adaptado del artículo de Suwannarangsee et al. (2012), y contenía además 1% p/v de paja de trigo. Este cultivo se inoculó con el hongo en una preparación líquida, y se incubó por 11 días, alcanzando una actividad celulasa de 0,5 [IU/ml] (promedio de los 6 matraces) al cabo de este periodo. La separación de proteínas obtenidas del cultivo se hizo mediante cromatografía de filtración en gel en columna Sephacryl S-100. En esta etapa se recuperó un 18% de proteínas totales, y se logró un enriquecimiento enzimático de 35,96 [IU/mg proteína], triplicando el valor obtenido por el extracto proteico que fue cargado en la columna. Estas proteínas fraccionadas se sometieron a ensayos de celulasas y ligninasas, en los cuales se obtuvo que los mayores valores de actividad estaban entre las fracciones 23 a 28, coincidentes con el peak de absorbancia a 280 nm. Además, se pudo constatar un alto enriquecimiento de xilanasas con 32,9 [IU/mg prot.], versus el extracto proteico con 3,1 [IU/mg prot.]. Por otro lado, se realizó una hidrólisis con paja de trigo, para comparar la acción enzimática de las fracciones proteicas con respecto a Celluclast. Se pudo concluir que no existe sinergia entre ambos componentes, pero si hay una contribución a la acción de la enzima comercial por parte de las proteínas de T. versicolor. Esto se evidenció principalmente en la medición de xilosa, en la cual hubo un mejoramiento de un 47% en la fracción 27. El rendimiento enzimático fue de 2,11 [mg xilosa/mg proteína], siendo más del doble de lo obtenido por las celulasas comerciales en la hidrólisis de paja de trigo. Finalmente, se concluyó que el sistema de separación es eficiente para tener una primera aproximación de las enzimas buscadas dentro de las fracciones cromatográficas, y enriquecer tales fracciones con las proteínas de interés. También fue posible constatar que existe un gran potencial hidrolítico dado por la batería enzimática del hongo T. versicolor, especialmente por las xilanasas producidas por éste. Esto es muy relevante para la etapa de sacarificación, ya que el xilano como sustrato es el segundo más abundante después de la celulosa, y por ende, con gran potencial fermentativo.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / Existe una preocupación mundial por la disponibilidad de los combustibles fósiles para suplir la demanda de energía en el mundo, que aumenta año a año, y los problemas ambientales que su uso genera. Así, el bioetanol lignocelulósico ha surgido como una adecuada alternativa para reemplazar parcialmente la gasolina, pero todavía su costo no es competitivo con el petróleo o gasolina. El proceso de producción de bioetanol consta de tres etapas principales: pretratamiento, hidrólisis y fermentación. Específicamente, la hidrólisis es catalizada por celulasas y es una de las etapas con grandes proyecciones a disminuir su costo, por lo que este trabajo se enfoca en esta etapa, principalmente en el desarrollo de nuevas celulasas, que puedan aportar al desarrollo actual y a lograr reducir el costo de producción del bioetanol. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar el gen que codifica para una endoglucanasa del hongo Trametes versicolor y expresar la enzima en el sistema de expresión de Pichia pastoris. A partir de dos fragmentos de la secuencia del gen, se obtuvo una secuencia con el dominio catalítico completo, llamada tveg. La secuencia se clonó en el vector pPICZαA y se transformó células de la cepa GS115 de P. patoris para expresar la proteína en forma extracelular. Luego se realizó una curva de inducción y se estudió la expresión de la enzima en la fracción extracelular e intracelular. El análisis de la expresión se realizó mediante ensayos de actividad sobre carboximetilcelulosa (CMC) en medio sólido y en medio líquido, zimogramas y geles SDS-PAGE. El análisis de tveg mediante BLASTX mostró, con un 90% de identidad, que corresponde a la secuencia de una endoglucanasa del hongo T. versicolor, perteneciente a la familia 5 de las glicosil hidrolasas. Los ensayos en medio sólido revelaron actividad enzimática en la cepa recombinante GS115, indicando que la expresión fue exitosa. Por otra parte, los ensayos en medio líquido de la cepa GS115-TvEG permitieron cuantificar la actividad de la endoglucanasa TvEG recombinante, produciendo 8,3 U/l de cultivo a las 84 horas de inducción con metanol, de las cuales un 50% se encontraba en la fracción extracelular y un 50% en la fracción citoplasmática. Los zimogramas corroboraron los resultados de los ensayos en medio líquido y en los geles SDS-PAGE se vio una proteína con un peso molecular aparente de 90 kDa, mucho mayor a los 30 kDa estimados para TvEG, posiblemente por hiperglicosilación y/o problemas de corte de la señal de secreción. Por otro lado, se estudió la producción de celulasas nativas del hongo T. veriscolor en Avicel, CMC y astillas de Lenga como fuente de carbono. Con CMC se logró mayor producción de actividad celulolítica, llegando a un máximo de 225 U/l a los 6 días de cultivo. La gran diferencia entre el sistema nativo y el sistema recombinante, y la comparación con otros estudios, indican que la expresión de TvEG debe y puede ser mejorada.